梁芳 黃萍 袁秀云 崔波 李霞

摘要：【目的】克隆菊花CmAPETALA1基因（CmAP1）并構(gòu)建植物表達(dá)載體，為該基因功能的遺傳改良打下研究基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎猛纯寺〖癛T-PCR從菊花葉片中克隆CmAP1基因，運(yùn)用在線生物信息學(xué)分析工具對(duì)其核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)該基因的組織表達(dá)差異進(jìn)行分析，并用雙酶切法將目的基因與pCAMBIA1300載體連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體?！窘Y(jié)果】克隆獲得的CmAP1基因（GenBank登錄號(hào)KU872999）編碼區(qū)開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)741 bp，編碼246個(gè)氨基酸；CmAP1蛋白屬親水性蛋白，分子質(zhì)量約28.3 kD、理論等電點(diǎn)（pI）為8.76，預(yù)測(cè)該蛋白內(nèi)含10個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)；蛋白氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明，CmAP1蛋白與CDM111蛋白的同源性達(dá)98%，屬M(fèi)ADS-box基因家族A類基因的euAP1分支；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，CmAP1基因在花蕾中表達(dá)量極高，在舌狀花和筒狀花中表達(dá)量較低，而在營(yíng)養(yǎng)器官中僅痕量表達(dá)。將CmAP1基因連接到pCAMBIA1300載體上，可成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmAP1?！窘Y(jié)論】CmAP1基因在花的發(fā)育及形成過程中發(fā)揮重要作用，成功構(gòu)建獲得的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmAP1可為后期利用基因工程手段改變菊花花形態(tài)結(jié)構(gòu)、調(diào)控花期及遺傳改良打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 菊花；CmAPETALA1（CmAP1）；基因克??；植物表達(dá)載體；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S682.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）06-0000-08

Cloning of CmAP1 gene from Chrysanthemum morifolium and establishment of its plant expression vector

Abstract：【Objective】CmAPETALA1 gene（CmAP1） in Chrysanthemum morifolium was cloned and its plant expression vector was established， in order to provide references for further study on genetic improvement of CmAP1 gene function. 【Method】CmAP1 gene was cloned from leaf of C. morifolium by method of homology cloning and RT-PCR. The nucleotide and amino acid sequence were analyzed by online bioinformatics tool. Expression difference of this gene was determined by real-time fluorescence quantitative PCR. CmAP1 gene was linked to pCAMBIA1300 vector by double enzyme digestion to establish plant expression vector. 【Result】CmAP1 gene（GenBank accession number：KU872999） was obtained by cloning. The open reading frame（ORF） of CmAP1 was 741 bp encoding 246 amino acids. CmAP1 protein was a hydrophilic protein，and the molecular weight of this protein was about 28.3 kD. Its theoretical isoelectric point（pI） was 8.76. It was predicted that the protein contained ten phosphorylation sites and two potential N-glycosayation sites. Sequence and phylogenic analysis showed that CmAP1 protein was close to C. morifolium CDM111 protein with 98% similarity， which both belonged to euAP1 clade of A type gene in MADS-box gene family. Real fluorescence quantitative PCR analysis indicated that expression of CmAP1 gene was extremely high in buds. The expression level was low in tubiform and lingulate florets and was in trace expression in vegetative organs. CmAP1 was linked to pCAMBIA1300 vector and the plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 was established successfully. 【Conclusion】CmAP1 gene plays an important role in growth and development of C. morifolium. The established plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 is useful for further research on changing morphological structure of C. Morifolium by genetic engineering， regulation of flowering and genetic modification.

Key words： Chrysanthemum morifolium； CmAPETALA1（CmAP1）； gene cloning； plant expression vector； bioinformatics

0 引言

【研究意義】成花過程是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)折的關(guān)鍵期。調(diào)控植物成花過程的基因分為花序分生組織特征基因、花分生組織特征基因和花器官形態(tài)特征基因。大部分花器官形態(tài)特征基因?qū)儆贛ADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族基因，其中APETALA1/FRUITFULL（AP1/FUL）亞家族被認(rèn)為既是花分生組織特征基因，又是花器官特征基因。AP1基因是花瓣和萼片正常發(fā)育的必需基因（Alvarez-Buylla et al.，2006）。菊花（Chrysanthemum morifolium）是重要的短日照作物之一，多數(shù)品種在自然條件下于每年10～11月開花，溫室種植的菊花需人工調(diào)控光照周期，成本較高，而通過分子育種可縮短菊花對(duì)短日照的響應(yīng)時(shí)間，有效降低溫室供熱及人力物力等生產(chǎn)成本。因此，克隆菊花AP1基因（CmAP1）并進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建對(duì)其基因功能的遺傳改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今，已有很多植物的AP1同源基因被分離克隆，如馬鈴薯（樊春媛等，2010）、草莓（鄒冬梅等，2012）、萼脊蘭（崔波等，2013）、梨（Liu et al.，2013）、荷花（Kong et al.，2015）等。Ellul等（2004）將擬南芥AP1基因轉(zhuǎn)入番茄中，轉(zhuǎn)基因番茄營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期縮短，開花期比對(duì)照提前，且不影響植株正常發(fā)育。煙草中異源表達(dá)大豆AP1基因，表現(xiàn)為提前開花及花器官改變（Chi et al.，2011）。白樺AP1基因過表達(dá)能引起早花，且影響很多開花相關(guān)基因的表達(dá)及二萜化合物的生物合成（Huang et al.，2015）。在菊花MADS-box基因研究方面，Shchennikova等（2004）從菊花中分離出3個(gè)AP1/FUL亞家族基因CDM111、CDM8和CDM41及1個(gè)SEPALLATA3亞家族基因CDM44；Shulga等（2011）將CDM111、HAM75和HAM92基因分別轉(zhuǎn)入菊花中，在長(zhǎng)日照條件下轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照在表型上無(wú)差異，短日照條件下花芽啟動(dòng)比對(duì)照提前兩周，且轉(zhuǎn)基因植株花色著色更早；Shchennikova等（2011）克隆出菊花AGAMOUS的同源基因CDM37，該基因能促進(jìn)萼片中蜜腺的發(fā)育。此外，將菊花CDM41（Goloveshkina et al.，2012）、CIM8（Wang et al.，2013）和SOC1（Fu et al.，2014）基因分別轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中，均可使煙草和擬南芥提前開花且引起花形態(tài)異常?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)AP1同源基因克隆和生物信息學(xué)分析及植物表達(dá)載體構(gòu)建的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以菊花晚花品種獅子頭為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR克隆CmAP1基因，并對(duì)該基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)開花期菊花不同器官中該基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmAP1，以期為CmAP1基因功能的遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 植物材料 供試菊花品種為黃色大花品種獅子頭，由鄭州好日子園藝有限公司提供；試驗(yàn)于2015年10月～2016年4月在鄭州師范學(xué)院生物工程研究所進(jìn)行。取其葉片進(jìn)行基因克隆，在盛花期分別取健康植株的根、莖、葉、花蕾、管狀花及舌狀花，用于分析目的基因在不同部位的表達(dá)量。所有材料迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 1. 2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobactrium tumefaciens）EHA105及植物表達(dá)載體pCAMBIA1300由鄭州師范學(xué)院生物工程研究所分子實(shí)驗(yàn)室保存提供，pGEM-T Easy Vector購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1. 1. 3 酶與化學(xué)試劑 XbaⅠ及SmaⅠ限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTPs、DNA Marker等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 引物設(shè)計(jì) 運(yùn)用Primer Premier 5.0和DNAMAN，根據(jù)NCBI上已登錄的菊科植物AP1基因序列ORF兩端設(shè)計(jì)引物CmAP1-F和CmAP1-R（表1）；為構(gòu)建真核表達(dá)載體，在引物5'端分別加上Xba I和Sma I酶切位點(diǎn)。

1. 2. 2 CmAP1基因克隆 采用Trizol（Invitrogen公司）試劑提取葉片總RNA。以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：ddH2O 13.2 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL、CmAP1-F和CmAP1-R（10 mmol/L）各1.0 μL、cDNA 1.0 μL、rTaq DNA聚合酶0.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)及回收，目的片段大小為756 bp。將回收的目的片段再經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)正確后，連接到pGEM-T載體上，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌落PCR鑒定，陽(yáng)性菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1. 2. 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)克隆獲得的CmAP1基因序列，重新設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qRT-F和qRT-R，以Actin基因（GenBank登錄號(hào)AB770471）為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物（表1）對(duì)CmAP1基因在不同組織部位的表達(dá)進(jìn)行分析。分別提取根、莖、葉、花蕾、管狀花及舌狀花的總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit（TaKaRa）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10.0 μL、qRT-F和qRT-R各0.8 μL、cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，并設(shè)陰性對(duì)照。CmAP1相對(duì)表達(dá)量Rel.Exp=2-△△C t，其中△C t=C t（CmAP1）-

C t（Actin），△△C t=（各植物組織△C t）-（根△C t）。

1. 2. 4 CmAP1過表達(dá)載體構(gòu)建 將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液擴(kuò)搖并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提取質(zhì)粒pGEM- CmAP1，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sma I酶切后，回收約750 bp的目的片段；同時(shí)pCAMBIA1300載體也用Xba I和Sma I進(jìn)行酶切，回收大片段。將回收的目的片段和表達(dá)載體片段用T4 DNA連接酶于16 ℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌落，重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-CmAP1。提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，以確定植物表達(dá)載體構(gòu)建成功，正確者將其質(zhì)粒重組DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)2 d后，挑取單菌落進(jìn)行兩次PCR鑒定，均為陽(yáng)性者確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，-80 ℃保存或用于后續(xù)的農(nóng)桿菌侵染試驗(yàn)。

1. 2. 5 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)CmAP1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，用Protscale（http：//web.expasy.org/protscale.html/）對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析；通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。采用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分別分析磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)。用ExPASyGOR4 Secondary Structure Prediction Method（https：//npsa-

prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SWISS-

MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源建模方法對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用DNAMAN進(jìn)行蛋白同源序列多重比對(duì)分析。從NCBI下載已知菊科所有MADS-box A類基因，采用ClustalX進(jìn)行核酸序列比對(duì)，然后采用MEGA 6.0以鄰接法構(gòu)建基于CmAP1基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CmAP1基因ORF的克隆

以菊花葉片cDNA為模板，利用引物對(duì)CmAP1-F和CmAP1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期片段（756 bp），其ORF長(zhǎng)741 bp，編碼246個(gè)氨基酸（圖1）。在NCBI上進(jìn)行BLASTN在線分析，發(fā)現(xiàn)此序列與其他已登錄菊花AP1基因（AY173054、AB808650、AB808649、JX87-

2512、AB808648、AB808647和AB679275）的同源性均為99%，與向日葵（Helianthus annuus）AP1基因（AY173071、GU985582、GU985583和AF462152）的同源性為89%～90%，與非洲菊（Gerbera hybrid cultivar）AP1基因（AJ009727和FN298388）的同源性為83%～87%，故將該基因命名為CmAP1，GenBank登錄號(hào)KU872999。

2. 2 CmAP1蛋白的基本理化性質(zhì)

CmAP1蛋白氨基酸序列的CDD分析結(jié)果（圖2）顯示，CmAP1蛋白氨基酸序列具有典型的MEF2_like MADS結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，MADS結(jié)構(gòu)域位于CmAP1蛋白N端第2～75位氨基酸，K-box結(jié)構(gòu)域位于第89～167位氨基酸，說明CmAP1基因是植物典型的MIKCC-Type MADS-box基因。

基于K-D法的CmAP1蛋白親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果見圖3，正值為疏水區(qū)，負(fù)值為親水區(qū)，多肽鏈第36～52位的氨基酸區(qū)域?yàn)槭杷宰顝?qiáng)區(qū)域，第46位的異亮氨酸（Ile）疏水性最強(qiáng)，分值最高，為2.089；第173位的谷氨酸（Glu）和第174位的精氨酸（Lys）分值最低，均為2.833，親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈中親水性氨基酸較多，故表現(xiàn)為親水性。

ProtParam分析結(jié)果表明，CmAP1分子質(zhì)量約28.3 kD、理論等電點(diǎn)（pI）為8.76，分子式為C1227H1976N362O385S11；負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為33，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為37。在組成CmAP1蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最高，為10.6%，色氨酸（Trp）所占比例最低，為0.8%。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為52.08，半衰期30 h，脂肪指數(shù)為73.33，根據(jù)Guruprasad判定，CmAP1蛋白不穩(wěn)定。NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CmAP1蛋白序列中存在10個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括6個(gè)Ser位點(diǎn)（22Ser、61Ser、74Ser、89Ser、99Ser和120Ser），3個(gè)Thr位點(diǎn)（76Thr、86Thr和168Thr）和1個(gè)Tyr位點(diǎn)（191Tyr）。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CmAP1蛋白存在2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為164Asn和214Asn。說明蛋白翻譯后修飾對(duì)CmAP1蛋白功能的實(shí)現(xiàn)起重要作用。

2. 3 CmAP1蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果

采用GOR4進(jìn)行CmAP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CmAP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、伸展鏈和無(wú)規(guī)則卷曲組成，其中，α螺旋（Hh）占54.88%，β折疊（Ee）占15.04%，無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）占30.08%（圖4）。采用SWISS-MODEL同源建模方法對(duì)CmAP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以3p57.1.A為模板，序列一致性為50.68%，三級(jí)結(jié)構(gòu)詳見圖5，即CmAP1蛋白由α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成。

2. 4 CmAP1蛋白氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

CmAP1蛋白與菊科其他AP1蛋白氨基酸序列的比對(duì)分析結(jié)果（圖6）表明，CmAP1蛋白序列與甘野菊（C. seticuspe，BAL14662）的序列完全相同，與向日葵HAM75（Helianthus annuus，AAL83209）蛋白的同源性為93%，與菊花CDM111（AAO22979）的同源性為98%，與非洲菊GSQUA3（Gerbera hybrid cultivar，CAX65662）的同源性為88%。

為進(jìn)一步分析CmAP1基因與菊科及模式植物擬南芥MADS-box A類基因的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建基于CmAP1基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖7）。從圖7可看出，所有的CmAP1基因可分為三大分支，甘野菊的CsAFL1基因（AB679273）和CsM8基因（AB770472）、菊花的CmAFL1基因（AB451218）和cdm8基因（AY173056）、甘菊（C. lavandulifolium）的AP1-like基因（HM130686）及擬南芥AGL8基因（ATU33473）同屬euFUL分支；甘野菊的AP1/FUL-like基因（AB839770）、菊花的cdm41基因（AY173055）和CmFUL基因（KT894379）及擬南芥AGL79基因（NM_113925）同屬FUL-like分支；其他菊花AP1基因則與擬南芥AP1基因（NM_105581）及CAL基因（NM_102395）同屬euAP1分支。在euAP1分支中，向日葵的3個(gè)euAP1基因（AF462152、GU985592和GU985583）自成一個(gè)小分支，另一個(gè)分支則全部為菊科的euAP1類基因，說明euAP1基因的進(jìn)化具有明顯種屬特異性。

2. 5 CmAP1基因在不同組織部位的表達(dá)情況

用Trizol法提取各組織部位的總RNA，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)菊花花期不同組織部位CmAP1基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，各溶解曲線峰單一；CmAP1基因在花蕾中表達(dá)豐度最高，其次是管狀花和舌狀花，在根莖葉中均為痕量表達(dá)（圖8）。說明CmAP1基因可能在花的發(fā)育及形成中發(fā)揮重要作用。

2. 6 CmAP1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序成功的質(zhì)粒pGEM-CmAP1經(jīng)Xba I和Sma I限制性內(nèi)切酶酶切后，得到兩個(gè)目的片段，分別為756和約3000 bp（圖9），切膠回收小片段；質(zhì)粒pCAMBIA1300經(jīng)Xba I和Sma I酶切后，切膠回收大片段。將回收的pCAMBIA1300大片段與pGEM-CmAP1的小片段用T4 DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定，得到一條長(zhǎng)756 bp的小片段和一條長(zhǎng)約10000 bp的pCAMBIA1300載體片段（圖10）；測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明，植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmAP1構(gòu)建成功。用凍融法將pCAMBIA1300-CmAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)2 d后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果（圖11）顯示，約在750 bp處有很亮的目的條帶，說明轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性，CmAP1基因已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

3 討論

通過同源克隆從菊花中克隆獲得的AP1同源基因（命名為CmAP1），其ORF長(zhǎng)741 bp，編碼246個(gè)氨基酸；CmAP1蛋白屬于親水性蛋白，分子質(zhì)量約28.3 kD、理論等電點(diǎn)（pI）為8.76，預(yù)測(cè)該蛋白內(nèi)含10個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)；利用SWISS- MODEL同源建模方法對(duì)CmAP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以3p57.1.A為模板，二者序列一致性為50.68%，表明CmAP1蛋白由α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成；氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，CmAP1基因?qū)儆贛ADS- box的AP1/FUL亞家族，與菊花CDM111序列一致性為98%，與向日葵HAM75序列一致性為93%。Litt和Irish（2003）、Shan等（2007）研究認(rèn)為，AP1/FUL-like基因經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化和基因復(fù)制產(chǎn)生euAP1、euFUL和FUL-like（AGL79）三大分支，本研究中的CmAP1基因?qū)儆谄渲衑uAP1基因進(jìn)化枝，euAP1類基因的進(jìn)化具有明顯的種屬特異性，表明AP1基因在進(jìn)化上具有高度保守性。Becker和Thei？茁en（2003）、Kaufman等（2005）研究表明，MADS-box基因依據(jù)進(jìn)化及結(jié)構(gòu)可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅱ型又分為動(dòng)物和真菌的MEF2-like型和植物的MIKC型，多數(shù)已知植物的MADS-box基因均屬于MIKCC型，其編碼蛋白具有典型M、I、K和C結(jié)構(gòu)。本研究通過對(duì)CmAP1蛋白進(jìn)行在線分析，結(jié)果表明該蛋白屬于植物MADS-box超家族，具有該家族特有的MADS_MEF2_like高度保守結(jié)構(gòu)域及半保守K-box域，MADS_MEF2_like域是序列特異的DNA結(jié)合基元，K-box域是蛋白分子間相互作用的區(qū)域（Yang and Jack，2004）；C端可變最不保守，但MADS-box蛋白常含有一些保守基序，這些基序在蛋白復(fù)合體的形成和轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用（Honma and Goto，2001），同時(shí)C端不同的基序代表了MADS-box蛋白不同的功能（Lamb and Irish，2003），CmAP1基因在進(jìn)化上屬于euAP1分支，euAP1類基因編碼的氨基酸序列在C末端具有典型的euAP1基序，常以CFAA結(jié)尾。

本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)菊花花期CmAP1基因在不同部位的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CmAP1基因在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量很低，在花蕾中表達(dá)量最高，在舌狀花和管狀花中表達(dá)量無(wú)明顯差異。梁芳等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，菊花品種獅子頭CmFUL基因在管狀花和舌狀花中表達(dá)模式明顯不同，在管狀花中的表達(dá)量是舌狀花中的12倍，表明同為AP1/FUL亞家族基因其功能存在差異。本研究構(gòu)建了以CaMV 35S為啟動(dòng)子、GUS為報(bào)告基因、含有CmAP1目的基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-CmAP1，經(jīng)雙酶切及PCR鑒定確定CmAP1基因已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。

4 結(jié)論

CmAP1基因在花的發(fā)育及形成過程中發(fā)揮重要作用，成功構(gòu)建獲得的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300- CmAP1可為后期利用基因工程手段改變菊花花形態(tài)結(jié)構(gòu)、調(diào)控花期及遺傳改良打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 思利華）