張慶瀅 郭蓉 陳璇 許艷萍 郭孟璧 郭鴻彥 楊明

摘要：【目的】分析野生大麻居群的合理取樣樣本量，為全面了解我國(guó)大麻資源的遺傳多樣性及制定野生大麻保護(hù)策略提供參考依據(jù)?！痉椒ā侩S機(jī)抽取96個(gè)遼寧科爾沁沙地野生大麻自然居群個(gè)體，采用計(jì)算機(jī)模擬方法從中隨機(jī)抽取不同樣本量（分別為5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和96個(gè)個(gè)體）的抽樣群體各20次，利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，確定合理的取樣樣本量?！窘Y(jié)果】利用從60條ISSR引物中篩選出的9條引物對(duì)隨機(jī)抽取的96個(gè)野生大麻個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得76個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)48個(gè)，多態(tài)率達(dá)63.16%，觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為1.632，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.250，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.156，Shannons信息指數(shù)（I）為0.245。由各遺傳參數(shù)擬合曲線變化趨勢(shì)分析結(jié)果可知，初始的4種抽樣群體（分別為5、10、15和20個(gè)個(gè)體）遺傳多樣性水平呈急速增加趨勢(shì)，之后隨著樣本量的加大，遺傳多樣性水平增加趨勢(shì)明顯變緩。當(dāng)抽樣群體樣本量超過(guò)25個(gè)個(gè)體時(shí)，Na、Ne、H和I均包含了野生大麻居群90%以上的遺傳變異?！窘Y(jié)論】采用ISSR分子標(biāo)記評(píng)估野生大麻群體遺傳多樣性時(shí)，群體取樣樣本量不宜小于25個(gè)個(gè)體才能較好地反映該居群總體的遺傳多樣性水平。

關(guān)鍵詞： 野生大麻；ISSR；遺傳多樣性；取樣策略

中圖分類號(hào)： S563.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）06-0973-06

Sampling strategy for genetic diversity ISSR analysis of wild

Cannabis sativa L. population

Abstract：【Objective】Reasonable sampling size for wild Cannabis sativa L. was analyzed and determined to provide reference for comprehensive understanding of genetic diversity of domestic C. sativa L. resources and formulating protection strategies for it. 【Method】Ninety-six representative individuals of wild C. sativa L. population from Horqin sandy land were randomly selected. Using computer simulation method， each sampling group with different individuals（5，10， 15，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，96） were randomly sampled 20 times. ISSR molecular marker method was carried out to estimate the genetic diversity and determine the proper sampling size. 【Result】PCR amplification was conducted on 96 sampled C. sativa L. individuals by 9 primers screened out of 60 ISSR primers. The results showed that 76 loci with 48 polymorphic loci were identified， and polymorphic rate was 63.16%. Observed average alleles（Na） number was 1.632， effective alleles（Ne） number was 1.250， Neis gene diversity index（H） was 0.156，and Shannons information index（I） was 0.245. Fitted curves of different genetic parameters indicated that the genetic diversity increased sharply for the first four sampling groups（5，10，15 and 20 individuals respectively）. As sampling size enlarged， the increasing trend of genetic diversity was slowed. When the sampling size was over 25 individuals， Na，Ne，H and I contained over 90% of genetic diversity of wild C. sativa L population. 【Conclusion】The sampling size should be no less than 25 individuals when using ISSR molecular marker to evaluate genetic diversity of C. sativa L.，as it can reflect the genetic diversity of the population.

Key words： wild Cannabis sativa L.； ISSR； genetic diversity； sampling strategy

0 引言

【研究意義】大麻（Cannabis sativa L.）是世界上最古老、分布最廣泛的栽培作物之一，為一年生草本植物，通常為雌雄異株。大麻在我國(guó)種植歷史悠久，是我國(guó)傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物，也因其含有具致幻成癮作用的四氫大麻酚（THC）而被聯(lián)合國(guó)禁毒公約列為毒品源植物之一。近年來(lái)，由于工業(yè)大麻在造紙、紡織、食用及藥用等方面具有突出優(yōu)勢(shì)，在高附加值原料產(chǎn)品大麻二酚（CBD）的開發(fā)利用和生態(tài)保護(hù)方面也具有多種優(yōu)勢(shì)（如抗病蟲草害性能強(qiáng)、對(duì)重金屬的高吸附作用、可用作環(huán)保新材料和農(nóng)業(yè)碳匯等）（張慶瀅等，2011；Amaducci et al.，2015），在國(guó)內(nèi)外已成為倍受關(guān)注的熱點(diǎn)經(jīng)濟(jì)作物。野生大麻資源作為大麻研究與利用的天然基因庫(kù)和寶貴資源，保存著栽培大麻不具備或已消失的遺傳基因，是培育低THC含量、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病（蟲）及抗逆大麻新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國(guó)是大麻的重要起源地之一（Gilmore et al.，2007），擁有豐富的大麻資源，但由于人口壓力、生境惡化及禁毒鏟除等因素影響，野生大麻面臨資源嚴(yán)重散失的窘境。因此，全面了解我國(guó)大麻資源的遺傳多樣性，對(duì)制定野生大麻保護(hù)策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，RAPD、ISSR、AFLP、SRAP和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳分析等方面已得到廣泛應(yīng)用（倪先林等，2015；肖政等，2015；周娜等，2015）。Hakki等（2007）、Kayis等（2010）在利用RAPD、ISSR分子標(biāo)記對(duì)毒品大麻和工業(yè)大麻進(jìn)行鑒別、毒品來(lái)源地追溯等方面均獲得了理想效果。湯志成等（2013）利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)12份野生大麻資源進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)價(jià)，但未涉及對(duì)群體內(nèi)部遺傳變異和結(jié)構(gòu)等內(nèi)容。Gao等（2014）利用SSR分子標(biāo)記成功將115份大麻栽培品種分成四大類群。宗成堃等（2015）研究認(rèn)為，聯(lián)合利用SSR、SRAP和ISSR 3種分子標(biāo)記技術(shù)可有效地構(gòu)建高密度、高飽和性丹參分子遺傳圖譜。張影波等（2016）研究認(rèn)為，SRAP和AFLP標(biāo)記技術(shù)均可用于艾納香遺傳多樣性分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】進(jìn)行群體遺傳多樣性分析時(shí)需首先解決代表某一群體總體遺傳多樣性水平的樣本采集問(wèn)題，但目前針對(duì)野生大麻自然居群或大麻群體研究樣本量選擇的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用ISSR分子標(biāo)記方法分析遼寧科爾沁沙地野生大麻自然居群的遺傳多樣性，通過(guò)隨機(jī)抽取不同樣本量和進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，確定可代表居群總體遺傳多樣性水平的樣本量，為開展野生大麻群體遺傳和保護(hù)利用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

以遼寧科爾沁沙地的野生大麻自然居群為研究對(duì)象，在居群約4 km2范圍內(nèi)隨機(jī)選取96個(gè)野生大麻單株，采集樣本時(shí)選取干凈、無(wú)病蟲害的正常葉片，及時(shí)用硅膠進(jìn)行干燥，進(jìn)行總DNA提取并保存于-80 ℃冰箱中備用。取樣時(shí)取樣植株樣本間的最小直線距離不低于10 m，96個(gè)樣本盡量覆蓋4 km2的取樣范圍。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 試驗(yàn)采用CTAB法（Doyle，1991）提取大麻基因組DNA。由于大麻葉片含有大量酚類物質(zhì)，為獲得較高純度的基因組DNA，對(duì)該方法進(jìn)行改良，增加Buffer洗滌（200 mmol/L Tris-Cl，250 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA）步驟以去除酚類等雜質(zhì)（陳璇等，2015）。對(duì)96 份單株材料進(jìn)行總DNA提取，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 引物篩選及PCR反應(yīng)條件 以試驗(yàn)居群的8個(gè)野生大麻植株單株基因組DNA為模板，對(duì)60條ISSR引物進(jìn)行篩選，其中18條來(lái)自Hakki等（2007）的研究，4條來(lái)自Kojoma等（2002）的研究，38條隨機(jī)選自英國(guó)哥倫比亞大學(xué)ISSR引物試劑盒。同時(shí)對(duì)擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)各引物進(jìn)行退火溫度梯度（47、50、53、56、58和60 ℃）PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，以確定每條引物的相應(yīng)退火溫度。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系25.0 μL，包含1.5 μL引物（母液濃度10 μmol/L），2.0 μL dNTP（母液濃度10 mmol/L），2.0 μL DNA模板（25～30 ng/μL），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2.5 μL 10×Buffer（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl），以ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 45 s，47～60 ℃退火（根據(jù)不同引物有所不同）50 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在0.5倍TBE緩沖液中用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓4 V/cm。每條引物2次重復(fù)擴(kuò)增。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

以Trans2K PlusⅡ DNA Marker（100～8000 bp）為相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，按照擴(kuò)增DNA片段的有（1）或無(wú)（0）構(gòu)建ISSR數(shù)據(jù)矩陣。采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)抽樣，從科爾沁沙地野生大麻居群96個(gè)單株總體樣本中形成由5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和96個(gè)個(gè)體組成的14個(gè)抽樣群體，每個(gè)抽樣群體各20次重復(fù)，將獲得的[0，1]數(shù)據(jù)矩陣在POPGENE 1.32中進(jìn)行分析，計(jì)算用于評(píng)價(jià)居群遺傳多樣性的相關(guān)指標(biāo)，包括觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）。

計(jì)算不同抽樣群體20次重復(fù)的遺傳多樣性參數(shù)平均值，并將各平均值轉(zhuǎn)換為占總體遺傳多樣性參數(shù)值的百分比，用SPSS 17.0中的S曲線模型對(duì)抽樣群體的遺傳多樣性水平隨樣本量增加而增加的趨勢(shì)進(jìn)行擬合分析，擬合公式為lnY=b0+（b1/t），其中b0和b1為擬合參數(shù)，t為樣本量，Y為各抽樣群體的遺傳參數(shù)百分比。

將5種遺傳參數(shù)值占居群總體遺傳多樣性的百分比與樣本量的5條擬合曲線用SPSS 17.0進(jìn)行協(xié)方差分析（ANCOVA），檢驗(yàn)截距和斜率的差異，分析Na、Ne、H、I和P 的擬合曲線差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物篩選結(jié)果

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，基于擴(kuò)增條帶數(shù)目適中（6～20條條帶）、清晰度高及重復(fù)性好等原則，最終優(yōu)選出9條適合野生大麻群體遺傳多樣性分析的ISSR引物，并確定其最佳退火溫度（表1）。其中，1～6號(hào)引物來(lái)自Hakki等（2007）的研究，7～9號(hào)引物篩選自英國(guó)哥倫比亞大學(xué)ISSR引物試劑盒。圖1為9條ISSR引物對(duì)科爾沁野生大麻居群第1～10號(hào)植株個(gè)體樣本的擴(kuò)增結(jié)果。

2. 2 群體遺傳多樣性分析結(jié)果

使用篩選出的9條ISSR引物對(duì)科爾沁沙地野生大麻居群96個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，在DNA片段長(zhǎng)度250～ 2500 bp間共檢測(cè)出76個(gè)清晰、可重復(fù)的有效位點(diǎn)，其中48個(gè)位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)，占63.16%。由表2可知，14個(gè)抽樣群體遺傳參數(shù)的變化范圍：Na為1.289～1.632，Ne為1.176～1.250，H為0.102～0.156，I為0.153～0.245，P為28.881%～63.160%。依據(jù)對(duì)96個(gè)個(gè)體的計(jì)算機(jī)抽樣及計(jì)算結(jié)果（表2），各抽樣群體的遺傳多樣性參數(shù)隨著樣本量的增加而增加，而標(biāo)準(zhǔn)差隨著樣本量的增加而減少。

2. 3 抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關(guān)系

對(duì)14個(gè)抽樣群體樣本量與其遺傳多樣性參數(shù)（Na、Ne、H、I和P）占總體遺傳多樣性參數(shù)的百分比進(jìn)行S曲線擬合分析，結(jié)果顯示，其R2分別為0.911、0.986、0.988、0.984和0.980，擬合度較好。當(dāng)抽樣群體樣本量為20個(gè)個(gè)體時(shí)，Na達(dá)90.3%；當(dāng)抽樣群體樣本量為25個(gè)個(gè)體時(shí)，Na達(dá)91.7%，Ne達(dá)98.6%，P達(dá)85.0%，H和I分別達(dá)90.4%和89.8%。從各遺傳參數(shù)擬合曲線（圖2）可看出，初始的4種抽樣群體（5、10、15和20個(gè)個(gè)體）遺傳多樣性水平呈急速增加趨勢(shì)，之后隨著樣本量的加大，遺傳多樣性水平的增加趨勢(shì)明顯變緩。當(dāng)樣本量達(dá)25個(gè)個(gè)體時(shí)，Na、Ne、H和I均超過(guò)總體樣本遺傳多樣性的90.0%，P也達(dá)到總體樣本遺傳多樣性的85.0%。

對(duì)5條擬合曲線用SPSS 17.0進(jìn)行協(xié)方差分析（ANCOVA），通過(guò)檢驗(yàn)截距與斜率的差異，發(fā)現(xiàn)3種遺傳多樣性參數(shù)（Na，He和I）的擬合曲線間差異不顯著 （α=0.05水平）。

3 討論

取樣策略是生物多樣性有效保護(hù)和利用研究面臨的最基本問(wèn)題，關(guān)系到植物總體和各居群遺傳多樣性評(píng)價(jià)的正確性和估算的準(zhǔn)確性，對(duì)制定有效的保護(hù)及利用策略意義重大（趙茹等，2006）。在生物多樣性研究中，H和I是兩個(gè)最常用的遺傳多樣性評(píng)價(jià)參數(shù)（李鈺瑩和董寬虎，2014；李紹臣等，2016；王夢(mèng)亮等，2016）。本研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)抽樣群體進(jìn)行分析，所獲得的H和I均在取樣樣本量為25個(gè)個(gè)體時(shí)達(dá)到總體樣本遺傳多樣性的90.0%，在樣本量超過(guò)25個(gè)個(gè)體后，H和I兩個(gè)遺傳多樣性參數(shù)隨樣本量的增加呈微幅上升，而在樣本量達(dá)到25個(gè)個(gè)體前，5個(gè)遺傳多樣性參數(shù)均呈快速上升趨勢(shì)。由此判斷，ISSR分子標(biāo)記在樣本量不小于25個(gè)個(gè)體時(shí)才能代表總體90%以上的遺傳變異。

野生大麻在我國(guó)云南、西藏、內(nèi)蒙古、新疆和東北等地區(qū)均有分布，這些地區(qū)的野生大麻是我國(guó)大麻種質(zhì)資源的重要組成部分。合理取樣是野生大麻群體遺傳學(xué)研究的前提，在很大程度上受大麻植株自身生物學(xué)特性、分布范圍、生態(tài)環(huán)境及取樣目的等因素的影響。通常認(rèn)為植物居群水平上遺傳多樣性受繁育系統(tǒng)因素的影響最大，風(fēng)媒傳粉異交>動(dòng)物傳粉異交>混交>自交，居群內(nèi)的雜合程度越高，等位基因在個(gè)體間的分布越均勻，較少的個(gè)體即可代表整個(gè)居群的遺傳變異（金燕和盧寶榮，2003）。陳堅(jiān)等（2015）對(duì)異花授粉、種子繁殖植物紫云英進(jìn)行SSR分子標(biāo)記取樣量研究，認(rèn)為取樣30個(gè)個(gè)體時(shí)遺傳多樣性指數(shù)達(dá)最佳值。譚龍濤等（2012）對(duì)中苧1號(hào)（苧麻為雌雄同株異花植物，兼有無(wú)性繁殖和種子繁殖）的研究結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記在中苧1號(hào)樣本量達(dá)50個(gè)以上個(gè)體時(shí)遺傳參數(shù)值變化不明顯，而SRAP分子標(biāo)記在中苧1號(hào)樣本量達(dá)60個(gè)以上個(gè)體時(shí)結(jié)果才較穩(wěn)定。從上述研究結(jié)果可看出，不同的植物由于其生物學(xué)特性不一樣，在進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究時(shí)，要求抽取的樣本量通常不同。就大麻而言，由于具有雌雄異株、異花授粉、風(fēng)媒等特性，其群體內(nèi)個(gè)體間差異較明顯，基因雜合程度高，與自花授粉植物或無(wú)性繁殖植物相比，在進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估時(shí)其取樣量可相對(duì)較小。

大麻通常為雌雄異株（在人工選擇壓力下可形成雌雄同株品種）植物，具異花授粉、風(fēng)媒、種子繁殖和一年生等生物學(xué)特性。雌雄異株、異花授粉植物群體內(nèi)遺傳多樣性豐富，個(gè)體間差異較明顯，基因雜合程度高，與自花授粉植物或無(wú)性繁殖植物相比，在對(duì)遺傳多樣性評(píng)估時(shí)其取樣量相對(duì)較小。

4 結(jié)論

采用ISSR分子標(biāo)記評(píng)估野生大麻群體的遺傳多樣性時(shí)，群體取樣樣本量不宜小于25個(gè)個(gè)體才能較好地反映該居群總體的遺傳多樣性水平。

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（責(zé)任編輯 思利華）