周翔宇 林峰 徐莉 李衛(wèi)正

摘要：【目的】測(cè)定5種鼠尾草植物C值，為鼠尾草屬的基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和種質(zhì)資源研究提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳园呋ㄊ笪膊荨⑸钏{(lán)鼠尾草、天藍(lán)鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草的嫩葉為材料，以已知基因組的水稻日本晴為內(nèi)標(biāo)，建立適合于鼠尾草基因組的流式細(xì)胞術(shù)C值測(cè)定方法?！窘Y(jié)果】經(jīng)解離液篩選，LB01解離液為鼠尾草屬植物的最佳選擇，測(cè)定5種鼠尾草和對(duì)照水稻的變異系數(shù)（CV）均小于5.0%；細(xì)胞懸浮液在加入碘化丙啶（PI）染色5 min左右即可上機(jī)檢測(cè)。斑花鼠尾草、深藍(lán)鼠尾草、天藍(lán)鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草的1C值分別為0.555、1.170、1.515、1.031和0.884 pg，存在顯著差異（P<0.05）?！窘Y(jié)論】測(cè)定的5種鼠尾草C值可豐富鼠尾草屬植物的C值庫(kù)；基于流式細(xì)胞術(shù)建立的鼠尾草屬植物C值測(cè)定方法可為該屬其他植物的相關(guān)研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞： 鼠尾草；基因組C值；流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）06-0960-06

Measurement of genomic C value of five Salvia species

by flow cytometry

Abstract：【Objective】The genomic C value of five Salvia species were determined in order to provide reference for further study on genomics， cytobiology and germplasm resource of Salvia species. 【Method】Fresh leaves of S. forskaohlei， S. guaranitica， S. uliginosa， S. hierosolymitana and S. viscosa were taken as samples. The known genome of Oryza sativa subsp. japonica‘Nipponbare was set as internal standard. Genomic C value detection by flow cytometry（FCM） was established for Salvia. 【Result】Screened by dissociation liquid， LB01 dissociation liquid was the optimal one for Salvia species. The detected variable coefficient（CV） of five Salvia species and control were smaller than 5.0%. Cell suspension could be tested on equipment after adding propidium iodide（PI） for 5 min staining. The genomic C value of S. forskaohlei， S. guaranitica， S. uliginosa， S. hierosolymitana and S. viscosa were 0.555， 1.170， 1.515， 1.031 and 0.884 pg respectively. And there was significant defference between the C values（P<0.05）. 【Conclusion】The detected C values of five Salvia species can enrich C value database of Salvia. The C value detection method established based on FCM for Salvia species can provide reference for the related research on other Salvia species.

Key words： Salvia； genomic C value； flow cytometry

0 引言

【研究意義】鼠尾草屬（Salvia）隸屬于唇形目（Lamiales）唇形科（Labiatae），是一年生或多年生草本或小灌木，包含約1000種，我國(guó)有84種，在全國(guó)各地均有分布，以西南地區(qū)分布較多（Li and Hedge，1994）。其中藥用植物43種（不包括變種），是一個(gè)重要的藥用植物類(lèi)群，屬內(nèi)的許多植物具有極高藥用價(jià)值，可用于治療肺結(jié)核、感冒、嘔吐、癲癇等多種疾?。ɡ顣F輝等，2011）。鼠尾草屬植物還可用于提取精油，且有一定的觀賞價(jià)值，具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。因此，研究鼠尾草屬的基因組對(duì)更好地利用該屬植物具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】生物體不復(fù)制的單倍體細(xì)胞核（無(wú)論倍性水平）所含DNA數(shù)量稱(chēng)為C值（Dole？觩el et al.，2003），一般認(rèn)為DNA的量1 pg相當(dāng)于978 Mb（Bennett and Leitch，2011）。C值與植物的種群進(jìn)化、物種分類(lèi)及分布、遺傳信息總量等有密切關(guān)系，是各種植物的一項(xiàng)重要特征參數(shù)。目前測(cè)定基因組的方法主要有3種，即孚耳根微顯影（Feulgen microdensitometry）、基因組測(cè)序法和流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM），其中流式細(xì)胞術(shù)制樣簡(jiǎn)單、分辨率和準(zhǔn)確率高，成為近年來(lái)測(cè)定基因組含量最常用的方法之一（汪艷等，2015；金亮等，2016）。至今，全世界關(guān)于鼠尾草植物C值的報(bào)道共有10個(gè)，分別為：一串紅（S. splendens）0.85 pg（Olszewska and Osiecka，1983）、長(zhǎng)毛鼠尾草（S. broussonetii）0.43 pg（Suda et al.，2003）、加拿利鼠尾草（S. canariensis）0.50 pg（Suda et al.，2005）、短齒鼠尾草（S. brachyodon）0.48 pg、藥用鼠尾草（S. officinalis）0.49 pg（Maksimovi■ et al.，2007）、林下鼠尾草（S. nemorosa）0.55 pg、南歐丹參（S. sclarea）0.58 pg、圓盔鼠尾草（S. ringens）0.61 pg、輪葉鼠尾草（S. verticillata）0.70 pg（Siljak-Yakovlev et al.，2010）和膠質(zhì)鼠尾草（S. glutinosa）1.07 pg（Temsch et al.，2010）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于鼠尾草基因組C值的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用流式細(xì)胞儀對(duì)5種鼠尾草的基因組進(jìn)行測(cè)定分析，以期為鼠尾草屬的基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和種質(zhì)資源研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

斑花鼠尾草、深藍(lán)鼠尾草、天藍(lán)鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草和腺毛鼠尾草均為上海辰山植物園科研苗圃所栽培。對(duì)照水稻日本晴（Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbare）由福建農(nóng)林大學(xué)提供，將種子置于20 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后備用。鼠尾草和水稻日本晴均采摘?jiǎng)偝槌龅挠啄廴~片作為試驗(yàn)材料。熒光染料、濾膜和鞘液均購(gòu)自南京博巧生物科技有限公司，Influx流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 解離液選擇與熒光染料配制 分別采用LB01、Galbraiths（簡(jiǎn)寫(xiě)Gal）、WPB、GPB、Tris-MgCl2、Otto等多種配方進(jìn)行試驗(yàn)，找出測(cè)定鼠尾草基因組的最佳裂解液配方。將熒光染料碘化丙啶（PI）配成終濃度50 μg/mL，置于4 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 細(xì)胞核懸液制備與DNA特異性染色 分別選取鼠尾草和水稻的嫩葉約1 g，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的解離液1.0 mL（LB01），用鋒利的刀片一次性快速切碎，在整個(gè)過(guò)程中材料需浸沒(méi)在解離液中；用0.5 mL冰解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的材料流至皿底半弧側(cè)，用槍頭輕吸打液體，放置約1 min；吸取培養(yǎng)皿中的解離液（棄去碎材料）置于1.5 mL EP管，用400目濾膜過(guò)濾，并置于冰中孵育5 min。于4 ℃下1100 r/min離心5 min，棄上清液，再加入150.0 μL冰解離液，將待測(cè)樣品與標(biāo)樣等比例混合，在250.0 μL解離液中加入0.5 μL PI儲(chǔ)備液，使終濃度達(dá)100 μg/mL；再加入終濃度為10 μg/mL的RNase，避光，在冰箱孵育20 min。上機(jī)檢測(cè)：低速收集8000～10000個(gè)顆粒。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用488 nm藍(lán)光激發(fā)，收集670/30通道的熒光并檢測(cè)PI發(fā)射的熒光強(qiáng)度。變異系數(shù)（CV）控制在5%以?xún)?nèi)。使用BD Influx自帶軟件FACSTM Sortware 1.0.0.650進(jìn)行分析。

待測(cè)樣本細(xì)胞核DNA含量=對(duì)照樣本細(xì)胞核DNA含量×■。每個(gè)樣本進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 解離液的選擇

在細(xì)胞核懸液制備過(guò)程中，不同解離液對(duì)不同植物的解離效果存在明顯差異，故在試驗(yàn)前需對(duì)常用的LB01、Gal、WPB、GPB、Tris-MgCl2、Otto等解離液進(jìn)行逐一對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPB解離液對(duì)水稻的解離效果最佳，對(duì)鼠尾草的解離效果一般，而LB01解離液對(duì)二者的解離效果均表現(xiàn)為噪音少、分離得到的峰形最佳。由表1可知，除LB01解離液對(duì)5種鼠尾草和水稻均適用外（CV<5.0%），其他解離液則存在不適宜或CV過(guò)大的情況，考慮到試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可對(duì)比性，故最終統(tǒng)一采用LB01解離液，即15 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA-Na2、0.5 mmol/L四鹽酸精胺、80 mmol/L KCl、20 mmol/L NaCl、0.1%（v/v）TritonX-100、pH 7.0～8.0。

2. 2 基因組大小的測(cè)定結(jié)果

以水稻日本晴為內(nèi)標(biāo)，分別測(cè)定鼠尾草懸浮液、水稻懸浮液及兩者混合液，測(cè)試結(jié)果如圖1～圖7所示。在上機(jī)檢測(cè)時(shí)，先以日本晴與各鼠尾草單獨(dú)上機(jī)檢測(cè)，初步確定對(duì)照與待測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度范圍。熒光強(qiáng)度表現(xiàn)為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖種峰的位置，如圖1所示，水稻日本晴的熒光強(qiáng)度在12000附近，在同一檢測(cè)模板下，斑花鼠尾草的熒光強(qiáng)度在18000附近（圖2）。說(shuō)明在下一步混合樣品流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，機(jī)器設(shè)置條件一致的情況下，水稻日本晴的峰將出現(xiàn)在檢測(cè)圖的左側(cè)，而樣品在檢測(cè)圖的右側(cè)。在圖7中，左側(cè)的P1峰代表水稻日本晴的熒光強(qiáng)度，右側(cè)的P2（A-E）峰分別代表樣品：斑花鼠尾草、深藍(lán)鼠尾草、天藍(lán)鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草、腺毛鼠尾草。

水稻日本晴2C DNA含量為0.795 pg（Sasaki and Burr，2000）。5種鼠尾草的1C值見(jiàn)表2，其中以天藍(lán)鼠尾草的1C值最高（1.515 pg），其次是深藍(lán)鼠尾草（1.170 pg），最低的是斑花鼠尾草（0.555 pg），5種鼠尾草的1C值間存在顯著差異（P<0.05）。

3 討論

早在20世紀(jì)初，鼠尾草屬植物的觀賞和藥用價(jià)值已得到廣泛關(guān)注，從134個(gè)物種中分離獲得773種次生代謝化合物，具有巨大的應(yīng)用前景（Wu et al.，2012）。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于鼠尾草基因組C值的研究報(bào)道。本研究采用已知基因組大小的水稻日本晴為內(nèi)標(biāo)，結(jié)果顯示，水稻日本晴與5種鼠尾草樣品的測(cè)定峰區(qū)分度良好，DNA含量CV均控制在5.0%以?xún)?nèi)，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠。此外，CV只能在線性標(biāo)尺模式下計(jì)算，對(duì)于在數(shù)標(biāo)尺模式下的測(cè)定則無(wú)意義（Dole？觩el et al.，2003）。因此，本研究采用的是線性標(biāo)尺進(jìn)行測(cè)定。

植物樣品檢測(cè)過(guò)程中，解離液、材料選擇和染色時(shí)間是關(guān)鍵（Dole？觩el et al.，2003）。在解離液選擇方面，水稻對(duì)解離液要求不高，解離液LB01、Gal、WPB、GPB、Tris-MgCl2和Otto均能檢測(cè)出良好的峰形，其中以GPB解離液的效果最佳；鼠尾草由于葉片內(nèi)富含揮發(fā)油類(lèi)、二萜類(lèi)和酚酸類(lèi)等成分，碎片較多，僅LB01解離液的解離效果最佳，故最終選擇標(biāo)樣與待測(cè)樣本均適宜的LB01解離液進(jìn)行前處理。在供試葉片方面，水稻采用種子萌發(fā)后、在培養(yǎng)箱培育10 d的嫩葉，鼠尾草均采用新鮮的嫩葉，使用的葉面積不超過(guò)1 cm×1 cm，以減少碎片。懸浮液在加入PI后避光染色5～10 min再進(jìn)行流式檢測(cè)。

Greilhuber等（2005）提出了“1C值”的概念：1C值代表體細(xì)胞DNA含量（2C）的一半。本研究所用的內(nèi)標(biāo)水稻日本晴基因組大小為389 Mb，根據(jù)公式計(jì)算得到斑花鼠尾草、深藍(lán)鼠尾草、天藍(lán)鼠尾草、耶路撒冷鼠尾草及腺毛鼠尾草的1C含量分別為0.555、1.170、1.515、1.031和0.884 pg，與國(guó)外報(bào)道的同屬10種植物C值范圍（0.43～1.07 pg）相近（Olszewska and Osiecka，1983；Suda et al.，2003，2005；Maksimovi■ et al.，2007；Siljak- Yakovlev et al.，2010；Temsch et al.，2010）。方差分析結(jié)果表明，5種鼠尾草基因組C值存在顯著差異；這種差異較普遍，甚至在種內(nèi)也存在差異（Ramsey and Ellis，1996）?；蚪MC值既有種的特征，又具有生態(tài)適應(yīng)上的意義。已有研究表明，C值與被子植物中的多樣性、物種滅絕風(fēng)險(xiǎn)性等均有一定關(guān)系（Bancheva and Greilhuber，2006）。全世界有1000多種鼠尾草植物，但迄今為止僅有10種鼠尾草植物基因組C值被測(cè)定，本研究結(jié)果可為加快該屬植物的C值測(cè)定提供借鑒。

4 結(jié)論

測(cè)定的5種鼠尾草C值可豐富鼠尾草屬植物的C值庫(kù)；基于流式細(xì)胞術(shù)建立的鼠尾草屬植物C值測(cè)定方法可為該屬其他植物的相關(guān)研究提供借鑒。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）