決登偉 桑雪蓮 舒波 劉麗琴 王一承 石勝友

摘要：【目的】分析WRKY基因在玉米生長發(fā)育及逆境脅迫下的功能，為闡明WRKY家族基因在玉米生長和逆境響應機制中的功能和作用打下基礎?！痉椒ā坷蒙镄畔W技術從玉米基因組中得到3個進化關系較近的WRKY基因，應用在線預測軟件對3個基因的功能和結(jié)構(gòu)進行分析，并運用熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析3個基因在玉米不同組織及在高鹽、低溫和干旱脅迫下的表達模式。【結(jié)果】從玉米基因組中得到ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like 3個玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因，預測表明3個蛋白均定位于細胞核。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，3個基因在玉米的不同器官中均有表達，但具有組織表達特異性。高鹽處理24 h，ZmWRKY55-like基因的表達量上升為對照的4.5倍；低溫處理24 h，ZmWRKY74-like基因的表達量上升為對照的2.1倍?！窘Y(jié)論】ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因可能在玉米果實發(fā)育過程中起到一定作用，其中ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因可能分別參與植物對鹽和低溫脅迫的響應。

關鍵詞： 玉米；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；功能分析；非生物脅迫

中圖分類號： S512 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-0945-07

Functional analysis for maize WRKY gene

Abstract：【Objective】The function of maize WRKY gene in growth and stress was studied， in order to lay a foundation for researching the function of WRKY family genes in the growth and response mechanisms of stress in maize. 【Method】 Three WRKY genes which showed a close evolutionships in maize genome were found by using bioinformatics technology. Meanwhile， the structure and function of those ZmWRKY genes were analyzed. In addition， the expression levels of ZmWRKY genes in different maize tissues and under high salt， low temperature and drought stress were analyzed by fluore-

scence quantitative RT-PCR（qRT-PCR）. 【Result】Three WRKY transcription factor genes（ZmWRKY22-like，ZmWRKY55-

like and ZmWRKY74-like） in maize were identified. It was predicted that these three proteins were all localized in nucleus. Fluorescence quantitative PCR assay showed that ZmWRKY22-like，ZmWRKY55-like and ZmWRKY74-like expressed in all tested maize tissues and had differential expressions. The expression of ZmWRKY55-like was up-regulated about 4.5 times under high salinity treatment for 24 h and that of ZmWRKY74-like was up-regulated about 2.1 times under low temperature stress. 【Conclusion】ZmWRKY22-like， ZmWRKY55-like and ZmWRKY74-like genes might play a role in maize fruit growth. ZmWRKY55-like and ZmWRKY74-like may be involved into plant response to salt and low temperature stress respectively.

Key words： maize； WRKY transcription factor； functional analysis； abiotic stress

0 引言

【研究意義】WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，因其N-末端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名，是高等植物中10個最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一。WRKY蛋白的N-端均含有1個或2個由近60個氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，C-端均含有1個鋅指結(jié)構(gòu)，二者是WRKY特異性與啟動子中W-box序列（C/T）TGAC（T/C）結(jié)合必不可少的組件，其中WRKY結(jié)構(gòu)域中含有一段高度保守的WRKYGQK七肽序列（或為WRKYGEK、WRKYGKK），鋅指結(jié)構(gòu)根據(jù)序列的不同可分為C2H2型（C-X4-5-C-

X22-23-H-X-H）或C2HC型（C-X7-C-X23-H-X-C）。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)序列的特點，WRKY蛋白可劃分為3個主要類型，第Ⅰ類有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2；第Ⅱ類只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2；第Ⅲ類也只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC。根據(jù)進化關系及WRKY結(jié)構(gòu)域中某些氨基酸基序不同，又可將第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子細分為5個小類（a～e）（Eulgem et al.， 2000）。作為轉(zhuǎn)錄因子，WRKY蛋白參與對細胞內(nèi)特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而產(chǎn)生相應的細胞反應來應答不同的外界刺激，這些刺激包括非生物脅迫，如高溫、低溫、紫外線、干旱或機械損傷等，也有可能是生物脅迫，包括細菌、真菌或病毒侵染等。同樣，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也廣泛參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，如種子發(fā)育過程、胚胎形成、葉片衰老和新陳代謝過程等。因此，研究玉米WRKY基因在不同組織及不同逆境脅迫下的表達特性對揭示其功能作用具有重要意義。【前人研究進展】自1994年第一個WRKY cDNA（SPF1）從甘薯（Ipomoea batatas）中被克隆以來，在不同植物中的WRKY基因也相繼報道，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Dong et al.， 2003）、水稻（Oryza sativa）（Ross et al.， 2007）、油菜（Brassica napus L.）（Deyholos et al.， 2009）、黃瓜（Cucumis sativus）（Ling et al.， 2011）、白楊（Populus trichocarpa）（He et al.， 2012）、蓖麻（Ricinus communis L.）（Li et al.， 2012）、玉米（Zea may L.）（Wei et al.， 2012）、麻風樹（Jatropha curcas）（Xiong et al.， 2013）、大豆（Glycine max）（Yin et al.， 2013）、棉花（Go-

ssypium）（Cai et al.， 2014）、白梨（Pyrus bretschneideri）（Huang et al.， 2015）和谷子（Setaria italica）（Mutha-

milarasan et al.， 2015）等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物多種生理生化過程，如水稻OsWRKY89基因過表達促進植株對紫外線的抵御（Wang et al.， 2007）；擬南芥的AtWRKY25和AtWRKY33基因受鹽促進表達，且異源表達這兩個基因增強了植物對NaCl的耐性（Zheng et al.，2006，2007）；在水稻中，過表達OsWRKY45促進擬南芥對干旱的耐性，OsWRKY8異源表達促進擬南芥對滲透的耐性，OsWRKY72異源表達則會影響根的生長和逆境耐性（Qiu and Yu， 2009）；在白梨的103WRKY基因中，44個PbWRKY在干旱處理下呈上調(diào)表達（Huang et al.， 2015）；在高粱（Panicum miliaceum L.）中，10個PmWRKY基因的表達受干旱脅迫誘導，16個PmWRKY基因的表達受低溫脅迫誘導（Yue et al.， 2016）。【本研究切入點】WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及逆境脅迫響應中均起重要作用，目前關于該家族基因在玉米基因組中的數(shù)量、分布研究已有報道，但關于ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因?qū)Ω啕}、低溫和干旱脅迫下的響應模式尚無文獻報道。【擬解決的關鍵問題】運用生物信息學技術從玉米基因組中得到3個進化關系較近的WRKY基因，應用在線預測軟件對3個基因的功能和結(jié)構(gòu)進行分析，并利用熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析3個基因在玉米不同組織及在高鹽、低溫和干旱脅迫下的表達模式，以期為揭示W(wǎng)RKY家族基因在玉米植株生長發(fā)育及響應逆境脅迫中的功能和作用打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為玉米自交系B73，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所保存提供。所用植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑及Realtime PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；其他試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗材料取樣 玉米組織根、莖、葉、穗、幼果和穗絲取自大田種植的玉米植株，采樣時期為乳熟期。逆境處理所用材料為B73種子萌發(fā)而來的幼苗，育苗方法：種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中（28±2）℃、14 h光照10 h黑暗下培養(yǎng)，3周后選擇長勢均一的幼苗進行下步試驗。試驗設3個處理：（1）鹽脅迫處理，將幼苗放入含200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣；（2）干旱脅迫處理，將幼苗放入含20% PEG-6000的1/2 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣；（3）低溫脅迫處理，將幼苗放入溫度設定為4 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣。每處理3次重復，取樣部位為葉片。所有樣本剪成2 cm左右的小段，立即放入液氮速凍并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存、備用。

1. 2. 2 玉米WRKY基因獲得及生物信息學分析 玉米WRKY基因序列從Phytozome（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza/）數(shù)據(jù)庫中獲得，并在玉米基因組數(shù)據(jù)庫（MaizeGDB，http：//www. maizegdb.

org/）中進行驗證。玉米WRKY基因的ORF、氨基酸長度和染色體定位信息從Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得。應用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）預測蛋白結(jié)構(gòu)域，蛋白等電點和分子量在ExPASy（http：//expasy.org/tools/）上進行分析，蛋白的亞細胞定位通過Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/

cgibin/PlantmPLoc.cgi）在線預測，基因的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)利用Gene Structure Display Server（GSDS） （http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）在線軟件分析。用Clustal X進行多重序列對比，同時利用MEGA 6.0進行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建Neighbor-Joining進化樹，1000次重復，其他均為默認設置。

1. 2. 3 植物總RNA提取及qRT-PCR分析 采用北京華越洋生物科技有限公司的植物RNA提取試劑盒提取不同材料的葉片RNA，然后用TaKaRa公司的PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，具體操作步驟參照說明。根據(jù)本研究中玉米WRKY基因的CDS序列設計qRT-PCR引物，并以Actin基因為內(nèi)參基因，具體引物序列見表1。

qRT-PCR反應所用儀器為Roche的LightCycler 480，qRT-PCR反應酶為TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。反應體系20 μL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，其余用ddH2O補齊。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)后作熔解曲線（95→65 ℃，0.1 ℃/s）。利用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。所有樣品進行3次重復，均設陰性對照。在分析基因的表達時，上調(diào)或下調(diào)大于2倍時才認為存在差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ZmWRKY基因生物信息學分析結(jié)果

在Phytozome和MaizeGDB獲得3個在進化關系上較近的玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因，分別為ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like，3個基因的基因id、locus和染色體定位等信息見表2和圖1。其中，ZmWRKY22-like基因序列開放閱讀框為729 bp，編碼242個氨基酸，其分子量為27.42 kD，理論等電點為5.67，位于玉米第Ⅷ號染色體；ZmWRKY55-like基因序列開放閱讀框為645 bp，編碼214個氨基酸，其分子量為23.28 kD，理論等電點為8.94，位于玉米第Ⅰ號染色體；ZmWRKY74-like基因序列開放閱讀框為996 bp，編碼331個氨基酸，其分子量為34.78 kD，理論等電點為6.09，位于玉米第Ⅱ號染色體。預測表明3個基因均定位于細胞核。對3個基因的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like蛋白均含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，ZmWRKY55-like的七肽序列被修飾為WRKYGEK，其余2個蛋白為WRKYGQK。3個蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)同為C-X7-C-X23-H-X1-C型，根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子分類原則，ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like蛋白均屬于第Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

利用MEGA 6.0將玉米ZmWRKY22-like、ZmWR-

KY55-like和ZmWRKY74-like蛋白序列與擬南芥、水稻、小米、小麥的部分WRKY蛋白序列進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），結(jié)果顯示，ZmWRKY22-like與SiWRKY29、TuWRKY38，ZmWRKY55-like與SiWR-

KY35、OsWRKY55，ZmWRKY74-like與SiWRKY70、OsWRKY74的親緣關系最近，同源性最高；而與同分支中擬南芥的WRKY蛋白的親緣關系較遠。

2. 2 ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRK-

Y74-like的組織表達分析結(jié)果

運用qRT-PCR分析ZmWRKY22-like、ZmWRKY-

55-like和ZmWRKY74-like基因在玉米植株的根、莖、葉、穗、幼果和穗絲中的表達情況，結(jié)果顯示，3個基因在玉米不同組織中均有表達，但存在差異表達（圖3）。ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因分別在穗絲、莖和根中的相對表達量最低；ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因在幼果中的相對表達量均明顯高于在其他組織中的相對表達量，分別是其在莖和根中相對表達量的6.1和22.5倍；ZmWRKY22-like基因在葉片和幼果中的相對表達量較高，分別是其在穗絲中相對表達量的19.7和12.5倍。

2. 3 ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRK-

Y74-like的非生物逆境脅迫表達分析結(jié)果

以3周苗齡的玉米苗為材料，分別用含200 mmol/L NaCl、20% PEG-6000的培養(yǎng)液和4 ℃模擬高鹽、干旱和低溫逆境脅迫，利用qRT-PCR分析ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因在不同逆境處理下的表達情況。圖4結(jié)果顯示，鹽脅迫及干旱脅迫下，ZmWRKY22-like基因在6 h時均呈下調(diào)表達，分別為對照的0.28和0.35倍，但在24 h時恢復到對照水平；干旱和低溫處理時，其表達未出現(xiàn)顯著變化。圖5結(jié)果顯示，鹽脅迫下，ZmWRKY55-like基因在24 h時出現(xiàn)上調(diào)表達，為對照的4.5倍；干旱和低溫處理時，其表達未呈顯著變化。圖6結(jié)果顯示，ZmWRKY74-like基因只在低溫脅迫下呈上調(diào)表達，在24 h時表達量為對照的2.1倍；在干旱和鹽脅迫下，其表達均未出現(xiàn)顯著變化。

3 討論

WRKY是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，也是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一（顏君等，2015）。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物的多種生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、葉片和根系生長、開花、衰老等。許多研究結(jié)果表明，WRKY家族基因在植物體不同器官中并不是組成型表達。谷彥冰等（2015）對42個蘋果WRKY基因進行了組織表達分析，結(jié)果顯示12個MdWRKY在根、莖、葉、花和果中均有表達，呈多種表達模式；MdWRKY18、MdWRKY27、MdWRKY32、MdWRKY-

47、MdWRKY85、MdWRKY120和MdWRKY131未能檢測出組織表達；MdWRKY1和MdWRKY110只在根中檢測到表達；MdWRKY16只在花中表達。石紅梅等（2015）的研究表明，PsWRKY基因主要在牡丹的葉片和心皮中表達，在其他器官中的表達量非常低。向小華等（2016）研究表明，煙草的164個WRKY基因大部分在根、莖、葉中有表達，但不同基因間的表達模式存在差異，如NtWRKY7、NtWRKY11、NtWRKY32、NtWRKY82、NtWRKY92、NtWRKY105和NtWRKY147在根、莖、葉中不表達或表達量較低；NtWRKY26和NtWRKY78在根中表達量最高；NtWRKY21和NtWR-

KY114在莖中表達量最高；NtWRKY28、NtWRKY81和NtWRKY163在葉片中表達量最高。相似的研究結(jié)果也在擬南芥（？譈lker and Somssich，2004）和番茄（Huang et al.， 2012）等WRKY基因家族中發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY-

74-like基因的表達量分別在玉米穗絲、莖、根中表達量最低，ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因在幼果中表達量最高，ZmWRKY22-like基因在葉片和幼果中的表達量較高，該結(jié)果表明這3個WRKY基因可能分別參與了玉米不同組織器官的發(fā)育過程。

玉米是當今世界重要的糧食作物之一，亦是重要的飼料和工業(yè)原料作物，在世界糧食總產(chǎn)量中處于第一位（周偉， 2013）。我國作為世界第二大玉米生產(chǎn)國，近30多年來玉米生產(chǎn)發(fā)展非常迅速，總產(chǎn)量也呈逐年上升趨勢。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫（FAOSTAT）顯示，2012年玉米產(chǎn)量超過稻谷產(chǎn)量，成為我國第一大糧食作物（楊今勝等， 2013）。2013年我國玉米常年種植面積達3510 萬ha，總產(chǎn)量約2.17億t，占糧食總產(chǎn)量的1/3。但在實際生產(chǎn)中玉米常受諸多不利環(huán)境因素的影響而大面積減產(chǎn)，如干旱、鹽脅迫和低溫等。

干旱和高鹽均會引起滲透脅迫，不但影響植物組織細胞的離子和滲透平衡，還會損壞細胞代謝平衡，導致活性氧（ROS）積累，從而嚴重影響植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量。自WRKY被發(fā)現(xiàn)至今，在多個植物中均有關于WRKY蛋白參與干旱和鹽脅迫響應的報道。如在擬南芥中，有近2000個干旱響應基因，其中包含不少WRKY基因（Huang et al.， 2008）；干旱和高鹽處理時，AtWRKY25和AtWRKY33的表達量會提高，而其異源表達增強了轉(zhuǎn)基因植株對NaCl的耐性（Jiang and Deyholos， 2009）；AtWRKY54和AtWRKY70則可通過調(diào)節(jié)氣孔開度來提高植株對滲透脅迫的耐性（Li et al.， 2013）；過表達OsWRKY45可增強轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱的耐受性（Qiu and Yu， 2009）；過表達VvWRKY11可增強轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱的耐受性（Liu et al.， 2011）。在小麥中也有許多與干旱脅迫相關的WRKY基因，包括TaWRKY16、TaWRKY17、TaWRKY19-C、TaWRKY24、TaWWRKY59、TaWRK-

Y61和TaWRKY82（Okay et al.， 2014）。與這些研究報道類似，在本研究中，高鹽處理下ZmWRKY55-like基因?qū)}脅迫出現(xiàn)特異響應，在處理后24 h呈上調(diào)表達，為對照的4.5倍，表明ZmWRKY55-like基因可能參與植物對鹽脅迫的響應過程。

高溫、低溫也是植物面對的一種重要非生物脅迫。許多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物對溫度脅迫的響應過程，如轉(zhuǎn)AtMBFlc基因增強過表達擬南芥植株對高溫的耐受性，而轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)AtWRKY18、AtWRKY33、AtWRKY40和AtWRKY46的表達量均呈上升趨勢（Suzuki et al.， 2005）；過表達GmWRKY21可增強轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低溫的耐受性（Zhou et al.， 2008）；高溫脅迫誘導AtWRKY25和AtWRKY26基因表達，但抑制AtWRKY33基因表達（Li et al.， 2011）。在本研究中，ZmWRKY74-like基因?qū)Φ蜏孛{迫出現(xiàn)特異響應，在處理后24 h時表達量上調(diào)為對照的2.1倍，表明ZmWRKY74-like基因可能參與植物對低溫脅迫的響應過程。

4 結(jié)論

ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY-

74-like基因可能在玉米果實發(fā)育過程中起到一定作用，ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因可能分別參與植物對鹽和低溫脅迫的響應。

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（責任編輯 麻小燕）