馬立 李豐甜 劉波 陳瑞華 汝長海

(1.上海大學 機電工程與自動化學院, 上海 20007; 2; 蘇州大學 附屬第一醫(yī)院, 江蘇 蘇州 215001;3.蘇州大學 機器人與微系統(tǒng)研究中心, 江蘇 蘇州 215001)

染色體核型分析是指染色體組在有絲分裂中期的表型分析,該階段染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異可以為染色體異常引起的疾病診斷提供很好的依據(jù),因此,核型分析在遺傳學研究及醫(yī)學診斷中都具有重要的價值[1- 2].

基于原子力顯微鏡(AFM)的染色體早期研究[3- 5]發(fā)現(xiàn),染色體表面的高度分布并不均勻,波峰與波谷交替分布,且沿染色體分布的峰谷與顯帶后的染色體顯隱帶區(qū)域之間存在對應關(guān)系[6- 7].這一結(jié)果表明,顯帶是染色體的固有結(jié)構(gòu),顯帶處理只是使這種結(jié)構(gòu)在光鏡下可見[8].因此,在染色體核型分析中,沿染色體中心線的高度曲線最常被用來與光學顯微鏡(OM)的成像結(jié)果進行對比分析.目前許多研究中使用的高度曲線提取及相應的顯帶分析方法[9- 10]是:首先通過軟件對形貌圖進行處理,然后基于操作者的視覺,沿染色體中心線方向畫一條直線并提取該目標直線上的高度分布,最后將其與對應的顯帶區(qū)段進行對比研究[11].這種高度曲線與OM顯帶結(jié)果之間的對應分析存在兩個問題:第一,忽視了染色體樣品制備過程中產(chǎn)生的變形,導致所提取的高度曲線不準確;第二,由于受分辨率及其他差異的影響,在基于操作者視覺的高度曲線分析中,雖然很多研究都提到了顯隱帶與峰谷間的對應關(guān)系,但是這種關(guān)系并不嚴謹.

考慮到傳統(tǒng)方法的不足,文中參考等高線在地形分析中的應用,以染色體表面峰值點與顯帶的對應關(guān)系為前提,在現(xiàn)有AFM[12- 14]研究的基礎(chǔ)上提出一種基于等高線的染色體高度曲線提取方法,并通過實驗進行驗證.

1 實驗樣品及設(shè)備

液體環(huán)境下的染色體表面柔軟且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,相對而言,空氣中干燥的染色體,其表面的結(jié)構(gòu)剛性與穩(wěn)定性都更為理想.利用AFM對空氣中干燥的染色體樣品進行成像能夠獲得更高的分辨率,且樣品的顯帶處理過程通常在空氣中完成.為了更好地分析染色體的表面形貌結(jié)構(gòu)并與顯帶結(jié)果形成對應,選用空氣中制備的染色體樣品作為研究對象,采集健康供體外周靜脈血5 mL,抽取肝素0.2 mL抗凝,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.終止培養(yǎng)前2～4 h加入秋水仙素,使溶液最終質(zhì)量濃度達0.2 μg/mL.細胞懸液經(jīng)離心、低滲、固定后,滴2～3滴于冰水浸泡過的載玻片上,吹散,過火后氣干.

為了實現(xiàn)染色體目標區(qū)域的定位,染色體樣品制備結(jié)束后用記號筆在載玻片的背面做多個標記點.利用相差顯微鏡對載玻片進行觀察,從中挑選分散較好的染色體區(qū)域用于后續(xù)的AFM成像.調(diào)整分辨率,確定標記點區(qū)域后截圖,并將目標區(qū)域用玻璃刀分別切下5 mm×5 mm～10 mm×10 mm大小的方塊.實驗系統(tǒng)實物如圖1所示,研究中選用了Nanonic公司的多功能型AFM(Multiview 1000),水平和豎直方向的測量分辨率分別為0.005和0.002 nm,該顯微鏡配備了一個高分辨率的光學顯微鏡,可對樣品表面進行高分辨率的光學成像.在利用AFM對制備的染色體樣品進行成像前,將配套光鏡的成像結(jié)果與之前保存的相差顯微鏡成像結(jié)果進行對比,確定目標區(qū)域所處的位置.掃描頭用于放置樣品并完成掃描過程,集成控制系統(tǒng)負責掃描過程中的運動控制,電腦及相關(guān)軟件用于完成相關(guān)參數(shù)的設(shè)置以及掃描結(jié)果的處理、顯示.AFM以輕敲模式進行成像,設(shè)定點為探針共振峰值的80%.成像用探針為Nanonic公司的NanoToolKit光纖探針,針頭直徑為20 nm左右,探針的彈性系數(shù)為1 N/m,推薦諧振頻率為25～70 Hz.WSxM[15]為掃描探針顯微鏡配套的圖像處理軟件,用于完成高分辨率形貌圖的處理,文中采用WSxM完成對AFM所得到圖像的預處理及輔助完成染色體輪廓的分析測量.

圖1 實驗系統(tǒng)實物圖

2 高度曲線提取方法

等高線是高度相同的點連接所形成的封閉曲線,可以清晰地反映形貌圖中的高度變化及波峰波谷的分布情況.基于等高線的高度曲線提取方法的原理為:將等高線描述地貌的原理用于染色體,即通過封閉曲線將染色體表面的三維形貌描述出來,進而得到所研究染色體的形貌走勢,并提取所需的峰值點.

圖2(a)所示為未經(jīng)仔細篩選且表面在一定程度上受到細胞漿質(zhì)干擾的染色體樣品.傳統(tǒng)的高度曲線提取方法為:沿染色體的中心線畫一條直線(如圖2(b)所示),然后通過計算直線上各點的坐標及相對位置得到最終的高度曲線(如圖2(c)所示).這種方法在染色體樣品比較直的情況下能夠得到與模式圖對應較好的高度曲線.然而在染色體干燥過程中,染色體表面在應力作用下會發(fā)生不規(guī)則的收縮,收縮后的染色體形狀不規(guī)則,如果仍采用畫直線的方法,所得到的染色體中心線高度曲線不準確.

基于等高線的高度曲線提取方法的原理如圖2(d)所示.具體步驟如下：

1)利用WSxM處理掃描結(jié)果,經(jīng)分析得到所研究染色體的等高線圖;

2)通過等高線分辨出染色體干燥過程中的收縮方向,同時,利用顯微鏡配套處理軟件中的像素彩色查找方法來反映染色體形貌圖中的高度變化,再結(jié)合等高線較為方便地確定輪廓,并清晰顯示干燥后染色體樣品的波峰點;

3)在確定染色體收縮方向的情況下,通過反復調(diào)節(jié)等高線的高度間隔和等高線數(shù),直到等高線圖上出現(xiàn)的波峰個數(shù)與相應染色體顯帶模式圖上的波峰個數(shù)相近或相等時,停止調(diào)整,從而較精確地找到其幾何中心點(即峰值點);

4)通過一條折線連接染色體收縮方向上所有的峰值點,將其作為染色單體的中心線;

5)通過提取并分析沿著中心線的高度及坐標信息,得沿染色單體中心線的高度曲線,如圖2(e)所示.

圖2 基于等高線的高度曲線提取方法原理圖

調(diào)節(jié)等高線的高度間隔和等高線數(shù)等參數(shù)不一定能夠得到理想的峰值點分布圖,以圖3所示染色體為例對染色體峰值點分布情況進行介紹.圖3為經(jīng)WSxM預處理去除背景干擾后,顯示等高線所得到的染色體形貌圖,其中由虛線標示出來的區(qū)域分別對應3種峰值點分布情況,黑點為等高線輪廓的幾何中心,配合顯微鏡處理軟件的像素彩色查找可確定為沿染色體分布的峰值點.區(qū)域f內(nèi)的峰值點分布較為接近且連接線與染色單體的輪廓中心較為匹配,因此可直接連接.區(qū)域g內(nèi)的峰值點分布較為分散,如果將其直接連接,連接線與單體的輪廓中心偏差較大,因此,區(qū)域g內(nèi)峰值點間應依照輪廓邊緣的趨勢,通過一條折線進行連接.區(qū)域h內(nèi)的峰值點分布雖然較為接近,但是它們的連線與染色單體的輪廓中心偏差較大,這些峰值點由染色體表面所存在的干擾結(jié)構(gòu)所導致,在連接時應當舍去.端點選擇在染色單體兩端附近的位置,并且使折線的最前面兩段與最后面兩段在方向上保持一致.以上基于等高線的峰值點判斷方法所得到的峰值點數(shù)與顯帶后染色體顯隱帶的個數(shù)基本符合,因此能保證充分且準確的染色體高度信息.

圖3 沿染色體表面的峰值點分布

3 實驗結(jié)果與分析

圖4 染色體3D效果圖

圖4為利用AFM對實驗過程中制備的染色體進行閉環(huán)掃描成像所得到的形貌圖.掃描模式為輕敲模式，每行掃描點數(shù)為300,圖像行數(shù)為300,空間分辨力為X0.005 nm、Y0.005 nm、Z0.002 nm,掃描時間為18 min.觀察圖像發(fā)現(xiàn),染色體周邊分布著大量細小的顆粒狀結(jié)構(gòu),這是樣品制備過程中細胞器等雜質(zhì)及載玻片表面顯微結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果.在染色體區(qū)域可以較明顯地看到高低起伏結(jié)構(gòu),測量發(fā)現(xiàn)染色體的平均高度為150～300 nm,染色體表面分布的波峰與波谷間的平均高度差約為10 nm.

實驗過程中,在利用等高線尋找染色體表面的峰值點時,需要多次調(diào)整等高線的高度間隔和等高線數(shù)等參數(shù),以獲得較好的結(jié)果.在調(diào)節(jié)等高線相關(guān)參數(shù)的過程中,前述圖3中區(qū)域g與h所示的情況占較大比例,而區(qū)域f所示的情況出現(xiàn)頻率較小.分析認為,這是由于染色體表面存在的特征峰值點與周邊區(qū)域的高度差較小而引起.從所制備的染色體樣品中挑選10條染色體進行方法有效性的對比,其中較直以及彎曲較為嚴重的染色體各5條.以圖5中所示的姐妹染色體為例,采用常規(guī)方法以及文中提出的方法分別提取上下兩條單體上的高度曲線.通過WSxM預處理去除形貌圖中的背景干擾,并顯示出形貌圖中的等高線分布,得到如圖5(a)所示結(jié)果.為得到較為理想的峰值分布圖,對等高線的參數(shù)進行了相應的調(diào)整,最大高度為231.161 nm,最小高度為0 nm,中間共有10層的等高線.圖5(a)中的a1、b1代表常規(guī)高度曲線提取方法,a2、b2代表基于等高線的高度曲線提取方法.采用上述兩種方法提取到的圖5(a)中上方與下方染色單體的高度曲線分別標記為a1、a2、b1、b2,如圖5(b)和5(c)所示.

如圖5(b)所示,a1與a2兩條高度曲線呈現(xiàn)出較多相似的特征,但是其中一些特征的位置及細節(jié)存在一定差異.分析認為,圖5(a)中上方的染色單體相對較直,從而導致兩種方法所得到的高度曲線存在較大相似性;而在單體的一些區(qū)段染色體出現(xiàn)變形,從而導致高度曲線的特征存在一定差異.從圖5(b)可以很明顯地看出,虛線框內(nèi)a1與a2之間的差異最大,a1偏離染色體的中心區(qū)域,但其路徑仍沿著染色體的中心區(qū)域.另外,圖5(b)虛線框區(qū)域中兩高度曲線所表現(xiàn)出來的特征差異明顯大于其他區(qū)段,其中a2呈現(xiàn)出更多的高度變化,且兩曲線所提取到的高度值相差也較大.由圖5(a)可以發(fā)現(xiàn),下方的染色單體存在較為嚴重的變形,因而上述差異在圖5(c)中表現(xiàn)得更為明顯——b1部分區(qū)段完全偏離了染色體的中心區(qū)域,而基于等高線提取的高度曲線b2與染色體所發(fā)生的變形保持了很好的一致性.另外,從圖5(c)中可以明顯看出高度曲線b1與b2之間的差異——b1存在明顯的特征錯誤,并且在偏離染色體的區(qū)域沒有得到有價值的高度信息;而b2與染色體的變形保持較好的一致性,所提取到的高度曲線能很好地反映下方染色單體的高度變化情況.

圖5 染色體及其高度曲線對比

姐妹染色單體是染色體復制的結(jié)果,理論上講,從兩條染色單體上提取到的高度曲線應當存在較大的相似性.圖5(b)所示的高度曲線a2與圖5(c)所示高度曲線b2是利用新方法得到的兩染色單體(如圖5(a)所示)上的高度曲線,經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn),兩曲線的高度特征存在明顯差異.通過分析染色體表面的細微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),染色體制備過程中樣品的收縮及雜質(zhì)的存在對染色體表面的高度分布情況造成了較大干擾.

空氣中干燥的染色體樣品表面平緩,表現(xiàn)出來的高度特征數(shù)目較少且不明顯,因而容易受到制片條件的影響.在對較直的染色體樣品進行對比分析時發(fā)現(xiàn),常規(guī)方法所提取到的高度曲線與基于等高線的方法所提取到的高度曲線相似水平較高.當所分析的染色體存在較大彎曲變形時,傳統(tǒng)的方法無法保證所有區(qū)段的取樣點都在染色體中心區(qū)域,文中所提出的方法則能夠保證取樣點所分布的折線與染色體中心輪廓保持良好的一致性.基于等高線的高度曲線提取方法所得到的折線與染色體的輪廓重合度較好,能夠更為準確地反映染色體的表面特征.

4 結(jié)語

文中提出了一種借助染色體形貌圖上等高線的分布情況獲取染色單體中心線上高度曲線的方法,并以空氣中制備的染色體樣品為研究對象,分別利用常規(guī)方法與基于等高線的方法提取目標染色體表面的高度曲線.通過對比兩種方法得到的高度曲線發(fā)現(xiàn),基于等高線的高度曲線能更準確地得到染色體中心區(qū)域的高度分布情況,并且得到的特征更為明顯.在染色體彎曲變形較嚴重的情況下,文中提出的高度曲線提取方法所得到的結(jié)果更為準確.但是,目前利用實驗中采用的樣品制備方法所得到的染色體樣品,其表面只有很少的可分辨特征,且表面受雜質(zhì)及變形的干擾較大,這對高度曲線分析造成了一定干擾.如何在不影響染色體結(jié)構(gòu)的前提下,盡可能地暴露出染色體內(nèi)部的高度差異,是未來樣品制備過程中需要解決的問題.

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