胡添源　蘇平　張逸風(fēng)　關(guān)紅雨　周家偉　童宇茹　高偉　黃璐琦

[摘要] 該研究克隆得到1條雷公藤單萜合酶基因TwMS。其完整開放閱讀框?yàn)? 797 bp，編碼579個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為69.75 kDa、理論等電點(diǎn)為5.37。生物信息學(xué)分析表明，TwMS具有單萜合酶的特征結(jié)構(gòu)域，屬于萜類合酶TPSb亞家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后，TwMS的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并在24 h達(dá)到最高。此外，該研究在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)TwMS蛋白，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤； 單萜合酶； 生物信息學(xué)分析； 基因表達(dá)分析； 蛋白表達(dá)

Cloning and protein expression analysis of monoterpene synthase gene TwMS in Tripterygium wilfordii

HU Tianyuan1， SU Ping2， ZHANG Yifeng1，2， GUAN Hongyu 1，2， ZHOU Jiawei1 ，

TONG Yuru1，2， GAO Wei1*， HUANG Luqi2

（1.Key Laboratory of Collateral Diseases， School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University，

Beijing 100069， China；

2.State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Chinese

Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] In this study， we cloned a monoterpene synthases， TwMS from Tripterygium wilfordii suspension cells. TwMS gene contained a 1 797 bp open reading frame （ORF）， encoding a polypeptide of 579 amino acids， which deduced isoelectric point （pI） was 6.10 and the calculated molecular weight was 69.75 kDa. Bioinformation analysis showed that the sequence of TwMS was consistent with the feature of monoterpene synthases. Differential expression analysis revealed that the relative expression level of TwMS increased significantly after being induced by methyl jasmonate （MeJA）. The highest expression level occurred at 24 h. TwMS protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）， which laid the foundation for identifying the function of T. wilfordii monoterpene synthases.

[Key words] Tripterygium wilfordii； monoterpene synthases； bioinformatics analysis； mRNA expression analysis； protein expression

中藥雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.來源于衛(wèi)矛科植物雷公藤的根或根的木質(zhì)部，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、活血消腫，殺蟲解毒等功效?，F(xiàn)代研究表明，雷公藤的藥用活性成分萜類物質(zhì)具有顯著的抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[1]，其主要活性成分包括二萜類成分雷公藤甲素和三萜類成分雷公藤紅素等。其中雷公藤甲素可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)胰腺癌的治療效果顯著[23]，此外，雷公藤甲素還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，是治療帕金森和老年癡呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤紅素除了具有神經(jīng)保護(hù)作用和抗遺傳性疾病等作用外，近年來還被報(bào)導(dǎo)是一種瘦素增敏劑，可以起到減肥的作用[6]。

單萜化合物是由2個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)單元組成的鏈狀或環(huán)狀化合物，廣泛存在于植物揮發(fā)油和樹脂中[7]。 單萜化合物多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，在植物種群競(jìng)爭(zhēng)、吸引昆蟲傳粉、防御植食性動(dòng)物和控制病蟲害發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用[810]。植物單萜由質(zhì)體內(nèi)的4磷酸2甲基赤蘚糖 （2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途徑合成，其前體物質(zhì)為牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）。單萜合酶 （monoterpenesynthases，monoTPS）是單萜生物合成的關(guān)鍵酶，單萜合酶基因的表達(dá)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中所必須的，具有明顯的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，其基因家族的不同成員往往在組織或器官的特定發(fā)育階段表達(dá)，以合成植物通訊和生物防御所需的化感物質(zhì)[1112]。單萜合酶基因的表達(dá)對(duì)環(huán)境的影響極為敏感，生物脅迫等外在壓力可激活單萜合酶基因表達(dá)生成相應(yīng)的單萜化合物，以對(duì)付食草動(dòng)物、病蟲害和病原菌等，很多單萜是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分[10，13]，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

本研究首次克隆得到1條雷公藤的單萜合酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)分析，以及IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)分析等研究，為深入研究雷公藤單萜合酶基因功能以及對(duì)雷公藤植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 雷公藤懸浮細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)所用材料來源于本實(shí)驗(yàn)室繼代保存的懸浮細(xì)胞。培養(yǎng)方法：在含有 0.5 mg·L-1 2，4D （2，4二氯苯氧乙酸） +0.1 mg·L-1 KT （激動(dòng)素） + 0.5 mg·L-1 IBA （吲哚丁酸） 的MS 液體培養(yǎng)基中，于25 ℃，120 r·min-1黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。

1.2 菌株

實(shí)驗(yàn)中使用的 Escherichia coli trans 5α及E.coli BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑及儀器

2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASYT3 Cloning Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA 純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Fast Quant RT Kit （With gDNase） 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司； KAPA SYBR FAST Universal 2×qPCR MasterMix 購(gòu)自 KAPA Biosystems 公司；Dnase I，Phusion HF PCR Master Mix，BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶，PstⅠ 限制性內(nèi)切酶及 T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司； IPTG 為 Sigma 品牌，購(gòu)自泰科蘭博生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR 擴(kuò)增儀型號(hào)為 ABIverity；實(shí)時(shí)定量 PCR 儀型號(hào)為 ABI 7300 系統(tǒng)；蛋白電泳儀型號(hào)為BIORAD Mini PROTEAN Tetra System；蛋白掃描儀型號(hào)為 UMAX PowerLOOK 21OOXLUSB；引物合成及測(cè)序服務(wù)由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

2 方法

2.1 雷公藤總RNA提取

取培養(yǎng) 10 d的雷公藤懸浮細(xì)胞，加入 MeJA誘導(dǎo)子，使之終濃度為 50 μmol·L-1。分別于誘導(dǎo)后 0，4，12，48，72 h 后取材，液氮速凍后置于-80 ℃ 冰箱保存。利用 CTAB 法提取雷公藤懸浮細(xì)胞總 RNA，并用 DNase （NEB） 和 RNA 純化試劑盒去除基因組污染，將純化的 RNA用液氮速凍后置于-80 ℃ 冰箱保存。

2.2 雷公藤單萜合酶基因克隆與測(cè)序

參考雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） BLAST，獲得雷公藤單萜合酶TwMS基因序列和開放閱讀框（open reading frame，ORF），設(shè)計(jì)cDNA克隆引物（表1）。利用FastQuant RT Kit （With gDNase）將純化得到的雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將各時(shí)間點(diǎn)的cDNA取出少量混合，作為單萜合酶全長(zhǎng)基因克隆的模板。根據(jù) Phusion HF PCR Master Mix 說明書配制PCR體系：cDNA 2 μL，2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2.5 μL （10 μmol·L-1），ddH2O 補(bǔ)足到50 μL。反應(yīng)程序： 98 ℃ 30 s； 98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，重復(fù) 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5min。 將 PCR產(chǎn)物切膠回收后連接 pEASYT3 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 trans5α克隆感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌液PCR挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2.3 TwMS基因序列的生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到序列通過InterPro在線軟件（http：// www.ebi.ac.uk /Tools/InterProScan）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabi.ibcp.fr/）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，TargetP1.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進(jìn)行信號(hào)肽分析，ExPAS ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)，TRMHMM server v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）進(jìn)行跨膜域分析，Psort（http：//psort.hgc.jp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsort.org/）分析亞細(xì)胞定位，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/） 進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維同源建模。根據(jù)NCBI BLAST結(jié)果下載同源序列，分別使用DNAMAN軟件和MEGA 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2.4 TwMS基因的表達(dá)分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的MeJA 誘導(dǎo)不同時(shí)間的cDNA為模板，選取βactin 作為看家基因，檢測(cè)雷公藤懸浮細(xì)胞中單萜合酶TwMS基因表達(dá)量的變化，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物（表2）。反應(yīng)體系如下：2×SYBR green Mix 10 μL，ROX 校正染料 0.4 μL，正反向引各 0.4 μL （10 μmol·L-1），ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào)，65～95 ℃ 做溶解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線。每個(gè)樣品做技術(shù)重復(fù)3次，并通過2-ΔΔCT法[14]分析TwMS基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 TwMS 的蛋白表達(dá)分析

2.5.1 TwMS 表達(dá)載體構(gòu)建 選擇重組蛋白表達(dá)載體pMALc2X，對(duì)載體和基因序列的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，選取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作為載體構(gòu)建的連接位點(diǎn)。在雷公藤單萜合酶基因TwMS的ORF兩端設(shè)計(jì)添加限制性酶切位點(diǎn)的引物（表3），使用NEB Phusion HF PCR Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，將回收得到已添加酶切位點(diǎn)的目的片段與載體分別進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，載體或片段5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為37 ℃，1 h。反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，回收產(chǎn)物測(cè)濃度后按照NEB T4 DNA 連接酶說明書配制反應(yīng)體系，并于16 ℃，連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 trans5α克隆感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，選取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并將陽性結(jié)果送公司測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，保菌、提取質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的pMALc2XTwMS。

2.5.2 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 將重組質(zhì)粒pMALc2XTwMS與空載體pMALc2X分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆于2 mL LB+100 mg·L-1Amp的液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r·min-1培養(yǎng)至A600為 0.6～1.0，取1 mL離心收集菌體，棄上清，用新的培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至50 mL 的LB+100 mg·L-1Amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r·min-1搖到A600約 0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropylbetaDthiogalactopyranoside，IPTG）至終濃度 1 mmol·L-1，20 ℃，200 r·min-1誘導(dǎo)12 h。將誘導(dǎo)完的菌液4 ℃，3 000 r·min-1離心20 min收集菌體，用新制的TrisHCl 緩沖液（50 mmol·L-1 Tris/HCl （pH 7.5），500 mmol·L-1 KCl，1 mmol·L-1 MnCl2，5 mmol·L-1 dithiothreitol，0.05% NaHSO3，10% glycerol）清洗2次，最后用5 mL TrisHCl 緩沖液重懸菌體。將重懸菌液置于冰中，超聲破碎5 min（功率30%，超聲5 s，暫停5 s），重復(fù)破碎1次后4 ℃，12 000 r·min-1離心 30 min，分離上清與沉淀，取上清再離心20 min，再次取上清，即為蛋白粗提物。

以含有空載體pMALc2X的大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)的蛋白粗提物為對(duì)照，與上述含有重組質(zhì)粒大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)的蛋白粗提物上清共同進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 雷公藤TwMS全長(zhǎng) cDNA 的獲得

設(shè)計(jì)特異性引物以雷公藤懸浮細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 800 bp附近有明亮單一的條帶（圖1），與預(yù)期目的條帶大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，TwMS的ORF大小為1 797 bp，編碼579個(gè)氨基酸。

3.2 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到序列在NCBI上進(jìn)行 BLAST，發(fā)現(xiàn)TwMS與其他植物的單萜合酶具有較高的同源性，與毛果楊Populus trichocarpa、葡萄Vitis vinifera、冬青櫟Quercus ilex、黑楊Populus nigra、蓖麻Ricinus communis等植物單萜合酶的相似度均大于50%。通過Editseq軟件將TwMS序列翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示， TwMS基因含有多個(gè)萜類合酶基因的高度保守結(jié)構(gòu)域，包括富含天冬氨酸的底物結(jié)合基序DDxxD，N末端精氨酸富集基序RRx8W，C末端NSE/DTE基序以及DDxxD上游35個(gè)氨基酸處的高度保守域RxR基序（圖2），符合被子植物單萜合酶序列特征[15]。

將TwMS與其他15個(gè)不同來源的單萜合酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過軟件 MEGA 5.0相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。在萜類合酶7個(gè)亞家族（TPSag）中，單萜合酶分布于b，d，f，g 4個(gè)亞家族[1516]。裸子植物單萜合酶歸屬于TPSd亞家族，均包含一個(gè)RRx8W基序，譜系分化小；被子植物單萜合酶進(jìn)化較快，分化較大，其中TPSg 亞家族單萜合酶缺少RRx8W基序，催化產(chǎn)物形成非環(huán)狀、易揮發(fā)單萜[17]；大多數(shù)被子植物單萜合酶屬于TPSb 亞家族，包含1個(gè)RRx8W基序；而TPSf亞家族是比較古老的分枝，主要成員包括仙女扇單萜合酶和擬南芥單萜合酶TPS04。進(jìn)化樹分析表明，雷公藤單萜合酶TwMS與被子植物黑楊P. nigra親緣關(guān)系最近，歸屬于被子植物單萜合酶TPSb亞家族，與TPSf亞家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.3 理化性質(zhì)與 3 D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

TwMS蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為69.75 kDa、理論等電點(diǎn)為5.37，為親水性蛋白。信號(hào)肽分析顯示無信號(hào)肽，跨膜域分析結(jié)果表明其為非膜蛋白，無分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TwMS可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜上。結(jié)構(gòu)域分析表明，TwMS在62～270 aa 處含有萜環(huán)化酶/異戊烯基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，65～245 aa處編碼N末端結(jié)構(gòu)域，276～540 aa處含有1個(gè)金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域。TwMS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：無規(guī)則卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)是其主要結(jié)構(gòu)原件，無規(guī)則卷曲占49.41%，α螺旋結(jié)構(gòu)占39.36%，剩余11.22%是長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)。蛋白三維結(jié)構(gòu)以4Slimonene synthase 2ong.1.A [18]為同源建模模板，建模范圍為 56～596位氨基酸殘基，序列同源性為44.80%（圖4）。

3.4 MeJA 誘導(dǎo)TwMS基因表達(dá)分析

利用MeJA對(duì)雷公藤懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)以及 2-ΔΔCt 分析對(duì)TwMS基因進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析表明，雷公藤單萜合酶基因TwMS對(duì)MeJA的誘導(dǎo)非常敏感，誘導(dǎo)后12 h，MeJA 處理組中基因的表達(dá)量上升到0 h的670倍，并于24 h達(dá)到最高誘導(dǎo)水平，處理組基因表達(dá)水平是同期對(duì)照組的1 172.3倍，240 h時(shí)TwMS基因的表達(dá)恢復(fù)至正常水平。

3.5 IPTG 誘導(dǎo) TwMS蛋白表達(dá)分析

TwMS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDSPAGE 掃描結(jié)果表明，在 IPTG 誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)后，含有pMALc2X空載質(zhì)粒的菌株在 42 kDa 處表達(dá)了MBP 標(biāo)簽蛋白，含有重組質(zhì)粒pMALc2XTwMS的菌株在約112 kDa 處有蛋白條帶，而空載體菌株在相同的位置無蛋白表達(dá)，說明雷公藤單萜合酶基因PtTPS.terpene synthase. Populus trichocarpa （AII32476）；Vvter1.（-）alphaterpineol synthase. Vitis vinifera （Q6PWU2）；Vvter2.（-）alphaterpineol synthase V. vinifera （NP001268216）；QiMYR. Myrcene synthase. Quercus ilex （Q93X23.1）；PnTPS.monoterpene synthase. P. nigra （AHY21666）；紅色標(biāo)識(shí)表示特征結(jié)構(gòu)域。

4 討論

單萜合酶催化GPP合成種類繁多、功能各異的單萜類化合物，在植物種群競(jìng)爭(zhēng)、吸引昆蟲傳粉、生物防御等方面發(fā)揮著極其重要的作用。本研究首次在重要藥用植物雷公藤中克隆得到單萜合酶，并通過生物信息學(xué)分析等手段對(duì)該基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有典型的單萜合酶結(jié)構(gòu)域，屬于萜類合酶TPSb亞家族，但由于單萜合酶基因家族

基因種類繁多，通過序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等手段較難推測(cè)該單萜合酶的具體催化產(chǎn)物，因此命名為Tripterygium wilfordii monoterpene synthases，簡(jiǎn)稱TwMS。研究發(fā)現(xiàn)，TwMS基因?qū)eJA的誘導(dǎo)異常敏感，表達(dá)量可上調(diào)至1 000倍以上，而MeJA等誘導(dǎo)子誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的上調(diào)可有效提高雷公藤萜類成分的產(chǎn)量[19]，由此推測(cè)，TwMS基因很可能參與了雷公藤萜類產(chǎn)物的代謝。單萜合酶基因會(huì)因環(huán)境刺激、生物脅迫等原因迅速表達(dá)，由MeJA誘導(dǎo)的敏感程度來看，TwMS基因很有可能在雷公藤的應(yīng)激或生物防御過程中發(fā)揮作用。此外，本研究成功在大腸桿菌中對(duì)TwMS基因進(jìn)行了異源表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhou Z L， Yang Y X， Ding J， et al. Triptolide： structural modifications， structureactivity relationships， bioactivities， clinical development and mechanisms[J]. Nat Prod Rep， 2012， 29（4）：457.

[2] Titov D V， Gilman B， He Q L， et al. XPB， a subunit of TFIIH， is a target of the natural product triptolide[J]. Nat Chem Biol， 2011， 7（3）：182.

[3] Chugh R， Sangwan V， Patil S P， et al. A preclinical evaluation of minnelide as a therapeutic agent against pancreatic cancer[J]. Sci Transl Med， 2012， 4（156）：4085.

[4] Lu L， Li F， Wang X. Novel antiinflammatory and neuroprotective agents for Parkinson′s disease[J]. Cns Neurol DisordDr， 2010， 9（9）：232.

[5] Wang X， Liang X B， Li F Q， et al. Therapeutic strategies for Parkinson′s disease： the ancient meets the futuretraditional Chinese herbal medicine， electroacupuncture， gene therapy and stem cells[J]. Neurochem Res， 2008， 33（10）：1956.

[6] Junli L， Jaemin L， Mario Andres S H， et al. Treatment of obesity with celastrol[J]. Cell， 2015， 161（5）：999.

[7] Bohlmann J， MeyerGauen G， Croteau R. Plant terpenoid synthases： molecular biology and phylogenetic analysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（8）：4126.

[8] Lippert D， Chowrira S， Ralph S G， et al. Conifer defense against insects： proteome analysis of Sitka spruce （Picea sitchensis） bark induced by mechanical wounding or feeding by white pine weevils （Pissodes strobi）[J]. Proteomics， 2007， 7（2）：248.

[9] Holopainen J K. Multiple functions of inducible plant volatiles[J]. Trends Plant Sci， 2004， 9（11）：529

[10] Pichersky E， Gershenzon J. The formation and function of plant volatiles： perfumes for pollinator attraction and defense[J]. Curr Opin Plant Biol， 2002， 5（3）：237.

[11] Chen F， Tholl D， D'Auria J C， et al. Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from arabidopsis flowers[J]. Plant Cell， 2003， 15（2）：481.

[12] Chen F， Ro D K， Petri J， et al. Characterization of a rootspecific Arabidopsis terpene synthase responsible for the formation of the volatile monoterpene 1，8cineole[J]. Plant Physiol， 2004， 135（4）：1956.

[13] Steele C L， Katoh S， Bohlmann J， et al. Regulation of oleoresinosis in grand fir （Abies grandis）. Differential transcriptional control of monoterpene， sesquiterpene， and diterpene synthase genes in response to wounding[J]. Plant Physiol， 1998， 116（4）：1497.

[14] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT， method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402.

[15] Bohlmann J， MeyerGauen G， Croteau R. Plant terpenoid synthases： molecular biology and phylogenetic analysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（8）：4126.

[16] Natalia Dudareva， Diane Martin， Christine M Kish， et al. （E）βocimene and myrcene synthase genes of floral scent biosynthesis in snapdragon： function and expression of three terpene synthase genes of a new terpene synthase subfamily[J]. Plant Cell， 2003， 15（5）：1227.

[17] Aharoni A，Giri A P，Verstappen F W， et al. Gain and loss of fruit flavour compounds produced by wild and cultivated strawberry species[J]. Plant Cell， 2004， 16（11）：3110.

[18] Hyatt D C， Youn B， Zhao Y， et al. Structure of limonene synthase， a simple model for terpenoid cyclase catalysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104（13）：5360.

[19] 張萌， 蘇平， 劉雨佳，等. 雷公藤牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（6）：1066.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]