林 清 賈永森 張艷麗 楊曉利 秦麗娟 馬會霞 江春花

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

血瘀型噎膈患者血清對食管癌EC9706細(xì)胞周期及核因子-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響

林 清 賈永森 張艷麗1楊曉利2秦麗娟3馬會霞 江春花

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

目的 通過觀察血瘀型噎膈患者血清對食管癌EC9706細(xì)胞周期及核因子(NF)-κB介導(dǎo)的信號通路蛋白表達(dá)的影響。方法 將EC9706細(xì)胞于37℃，5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，饑餓24 h，分別加入倍比梯度的血瘀證、脾氣虛證患者和健康人血清，MTT染色法檢測細(xì)胞增殖變化；PI染色法觀察細(xì)胞周期變化； Western印跡法檢測NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果 血瘀型噎膈患者血清刺激細(xì)胞的50%增殖率為711 μl/10 ml培養(yǎng)液體積；細(xì)胞周期分析，患者血清刺激的EC9706細(xì)胞(38.85±3.11)% 處于S增殖期，與各對照組有顯著差異(P<0.05)；在NF-κB信號通路中，血瘀型噎膈患者血清對EC9706細(xì)胞蛋白IKK-β、NF-κB、磷酸化NF-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)具有特征性促表達(dá)作用，與其他各血清干預(yù)的細(xì)胞比較有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 噎膈血瘀證患者血清提供利于細(xì)胞增殖的微環(huán)境，該證候的分子機(jī)制與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和NF-κB信號通路蛋白超表標(biāo)達(dá)密切相關(guān)。

食管癌；血瘀證；血清；EC9706細(xì)胞；核因子-κB；信號通路

噎膈是以進(jìn)食時吞咽困難、哽咽不順、飲食難下或食入即吐為主癥的疾病，與現(xiàn)代疾病的食管癌的表現(xiàn)十分相似〔1〕。中醫(yī)臨床研究表明食管癌患者幾乎都有血行不暢、瘀血內(nèi)停的病機(jī)變化，表現(xiàn)為腫、痛、舌質(zhì)暗紫或瘀斑等。實驗室檢查也顯示患者血液流變學(xué)指標(biāo)增高，患者血液處于明顯高凝狀態(tài)〔2〕，因此血瘀是食管癌形成發(fā)展的主要病機(jī)之一。研究表明，食管癌細(xì)胞的增殖、浸潤與核因子(NF)-κB介導(dǎo)的信號通路蛋白超表達(dá)有關(guān)〔3，4〕。本研究進(jìn)一步從食管癌血瘀病機(jī)的角度，觀察了臨床確診的血瘀型噎膈患者血清對食管癌EC9706細(xì)胞周期及NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 人血清 從遵化市人民醫(yī)院、遷安燕山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科篩選病理確診食管癌患者，3名獨立調(diào)查員按照擬定的“噎膈證候調(diào)查表”執(zhí)行辨證，確定血瘀證、脾氣虛證患者各10例；另選取健康志愿者10例，所有入選病例均簽署患者知情同意書，并取得華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會審查報告。抽取患者和健康人晨起空腹血10 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min 4℃離心15 min，56℃水浴滅活，去除補體等成分，上清液于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(BCS)、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT、DMSO(Amresco公司)；RNase A、碘化丙啶(PI，Sigma公司)；IKK-β多克隆抗體；NF-κB多克隆抗體；磷酸化NF-κB (Phospho-NF-κB)多克隆抗體；腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體(CST公司)；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP(華美生物工程公司)。

1.3 細(xì)胞 人食管癌EC9706細(xì)胞株(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。

1.4 儀器 1100型單人超凈工作臺(Forma公司)，NOVAPATH 450酶標(biāo)光度計(Bio-Tek公司)，JY92-IID超聲波細(xì)胞破碎儀(新芝公司)，3336 CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)，TMD-2倒置式顯微鏡(Nikon公司)，3MK型低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)；Facscdlibur流式細(xì)胞儀(BD公司),垂直電泳儀(AE-6531,Atto公司)；凝膠掃描分析系統(tǒng)(Gel-doc-2000，Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以10%BCS RPMI1640培養(yǎng)液10 ml，接種EC9706細(xì)胞于Φ100 mm培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育。

1.5.2 MTT法測定人血清影響EC9706細(xì)胞的半數(shù)增殖量 以1×104個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，含10%BCS培養(yǎng)液使細(xì)胞貼壁24 h后，去除BCS，饑餓細(xì)胞24 h，隨機(jī)選取血瘀證、脾氣虛證患者和健康志愿者血清各1例，以RPMI1640培養(yǎng)液配制如下梯度濃度：31.25，62.50，125.00，250.00，500.00，1 000.00 μl/10 ml孵育細(xì)胞；空白對照組以不含血清培養(yǎng)液孵育細(xì)胞作為平行對照。每組均設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去上清液，每孔加100 μl含有0.2 mg/ml MTT自由培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，加入150 μl DMSO溶解MTT，搖床上混勻15 min，酶標(biāo)儀上以570 nm/630 nm測定光密度值(OD值)。隨后再隨機(jī)選取各組人血清，重復(fù)實驗4次。按照公式：腫瘤細(xì)胞生長增殖率=(實驗組OD值/對照組OD值-1)×100%，計算各血清組對腫瘤細(xì)胞生長的增殖率，求出3組人血清的50%細(xì)胞增殖濃度值(PI50)。

1.5.3 細(xì)胞周期測定 以1×106/皿細(xì)胞密度接種EC9706細(xì)胞于Φ100 mm培養(yǎng)皿中，貼壁24 h，分別加入含有PI50濃度的三組人血清RPMI1640培養(yǎng)液，孵育24 h，收集入15 ml離心管中，PBS 2 ml重懸細(xì)胞，加入70%乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。棄掉乙醇，并在3 ml預(yù)冷的PBS中重懸細(xì)胞，再離心,棄掉PBS，依次加入PBS 850 μl，10 g/L RNaseA 10 μl，1%Triton X-100 100 μl，1 g/L PI 40 μl,37℃下避光孵育5 min〔5〕。400目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，并用Modifit LT軟件分析結(jié)果，得出不同組別細(xì)胞在各細(xì)胞周期的百分比率。

1.5.4 蛋白提取 將空白對照組、3組人血清干預(yù)的細(xì)胞冰上收集，離心，裂解細(xì)胞；15 000 r/min離心20 min；取上清。Bradford法測蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。?%SDS-PAGE(分離膠)和積層膠。

1.5.5 Western印跡分析方法 灌膠、上樣、電泳，轉(zhuǎn)移過夜。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加麗春紅染料染色，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。加封閉液在搖床上振搖1 h，阻斷膜上的非特異性結(jié)合位點；抗原抗體反應(yīng)；加入ECL顯色液，X線攝片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行F檢驗，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清對食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響 6個不同梯度的人血清濃度加入RPMI1640培養(yǎng)液中孵育細(xì)胞，3組血清干預(yù)的食管癌EC9706細(xì)胞均呈增殖態(tài)勢，但血瘀證組、脾氣虛證組人血清濃度與細(xì)胞增殖呈近似立方關(guān)系，而健康志愿者血清組呈近似線性關(guān)系。血瘀證組PI50=711 μl/10 ml，脾氣虛證組PI50=1 180 μl/10 ml，健康志愿者組PI50=1 243 μl/10 ml。見表1。

2.2 人血清對EC9706細(xì)胞生長周期的影響 細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對照組、脾氣虛證患者血清組和健康志愿者血清組細(xì)胞周期分布無顯著性差異(P>0.05)。血瘀型噎膈患者血清組細(xì)胞G1期細(xì)胞明顯減少；S期細(xì)胞比率明顯增高，與其他三組比較有顯著差異(P<0.05)。見表2。

表1 人血清對食管鱗癌EC9706細(xì)胞增殖影響的量效關(guān)系

表2 人血清對EC9706細(xì)胞周期的影響

與其他三組比較：1)P<0.05；下表同

2.3 人血清對EC9706細(xì)胞NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響 Western印跡法分析顯示，兩組噎膈患者血清干預(yù)的食管癌EC9706細(xì)胞，NF-κB信號通路蛋白表達(dá)均不同程度地增強(qiáng)。血瘀證組與空白對照組比較，IKK-β、NF-κB、磷酸化NF-κB和TNF-α蛋白相對灰度值均顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與脾氣虛證組比較， 4個蛋白表達(dá)相對值呈顯著差異(P<0.05)。結(jié)果表明，血瘀型噎膈患者血清對EC9706細(xì)胞NF-κB通路蛋白條帶表達(dá)具有較強(qiáng)促進(jìn)作用。見表3和圖1。

表3 人血清影響EC9706細(xì)胞NF-κB信號通路各蛋白表達(dá)相對灰度值

A.空白對照組；B.血瘀證組；C.脾氣虛證組；D.健康志愿者組 圖1 人血清對EC9706細(xì)胞 NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

血液中多種物質(zhì)直接影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展，近年來有關(guān)研究多集中在單一血液成分如細(xì)胞因子等對腫瘤作用的機(jī)制，也有用含藥動物血清觀察其對腫瘤干預(yù)的研究，但從整體上研究血液內(nèi)環(huán)境對腫瘤患者中醫(yī)證候形成作用的報道甚少。如同其他惡性腫瘤一樣，食管癌的發(fā)生、不同證候的形成與患者血液微環(huán)境關(guān)系密切。中醫(yī)認(rèn)為，血行脈中賴氣以推動，故有氣以行血之論。氣虛則不能行血，血流滯澀而導(dǎo)致血瘀證，這種內(nèi)在機(jī)制為血瘀的形成奠定了基礎(chǔ)。臨床資料也表明食管癌患者大多存在脾氣虛的證候特征，可以看出，脾氣虛證與血瘀證在食管癌病變中存在密切關(guān)系。本研究表明脾氣虛證患者和健康人的血清對癌細(xì)胞的刺激作用較小。

細(xì)胞周期調(diào)控異常是癌變的重要機(jī)制，惡性腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控失控使細(xì)胞正常分化受阻，從而處于過度增殖狀態(tài)〔6〕。周期中S期的比例反映了腫瘤細(xì)胞群體中處于增殖階段的數(shù)量，從一定程度上代表了細(xì)胞增殖狀態(tài)〔7〕。本研究結(jié)果表明，血瘀證噎膈患者血液內(nèi)環(huán)境刺激食管癌細(xì)胞增殖與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān)，它有力促進(jìn)了細(xì)胞進(jìn)入活躍S期。

在許多人類癌癥包括食管癌在內(nèi)，NF-κB信號通路的激活對腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用〔7〕。該蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種基啟動子部位的κB位點發(fā)生

特異性的結(jié)合從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。很多胞外刺激信號都可以引起NF-κB 信號通路的激活，如：促炎癥細(xì)胞因子白介素IL-1，病毒雙鏈RNA 以及各種物理和化學(xué)壓力等〔8〕。雖然這些胞外刺激所產(chǎn)生的胞內(nèi)早期信號途徑各不相同，但一般認(rèn)為，大多數(shù)此類胞外刺激起始的信號傳遞反應(yīng)將最終激活I(lǐng)KK復(fù)合物，其中IKK-β是促炎癥反應(yīng)因子刺激誘導(dǎo)NF-κB 的激活的主要激酶。NF-κB被激活后，可啟動下游分子如TNF-α等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤。

本研究結(jié)果表明，以脾氣虛證為代表的噎膈常見證候患者血清對食管癌細(xì)胞的NF-κB信號通路刺激作用較弱，與之相對的，血瘀型噎膈患者的血清對NF-κB信號通路各蛋白具有特征性促表達(dá)作用。

1 周岱翰.臨床中醫(yī)腫瘤學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：152.

2 毛元英,何 蘭,楊紅英.腫瘤患者血液流變學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果分析〔J〕.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2014；11(3):337-8.

3 田同德,儲真真,陳信義.惡性腫瘤高凝狀態(tài)與血瘀證相關(guān)性及中醫(yī)防治對策研究〔J〕.北京中醫(yī)藥,2009；28(6):425-7.

4 賈永森,李繼安,杜 寧,等.通蓮I號方對食管癌Eca109細(xì)胞NF-κB信號通路影響的研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2012；23(10):2534-5.

5 Xue JY，Zhou GX，Chen T，etal.Desacetyluvaricin induces S phase arrest in SW480 colorectal cancer cells through superoxide overproduction〔J〕.J Cell Biochem，2014；115(3):464-75.

6 Jin J,Lin G,Huang H,etal.Capsaicin mediates cell cycle arrest and apoptosis in human colon cancer cells via stabilizing and activating p53〔J〕.Int J Biol Sci，2014；10(3):285-95.

7 Tian F,Zang WD,Hou WH,etal.Nuclear factor-κB signaling pathway constitutively activated in esophageal squamous cell carcinoma cell lines and inhibition of growth of cells by small interfering RNA〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin,2006;38(5):318-26.

8 趙 靜.EGFR和NF-κB p65在食管癌組織中的表達(dá)及其它們的相互關(guān)系〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2009.

〔2015-08-21修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省自然科學(xué)基金(H2013209053)

賈永森(1978-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤疾病中醫(yī)方證基礎(chǔ)研究。

林 清(1983-)，女，講師，碩士，主要從事中醫(yī)基本理論與臨床應(yīng)用研究。

R273

A

1005-9202(2017)09-2107-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.011

1 遷安燕山醫(yī)院 2 遵化市人民醫(yī)院 3 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院