鄧時莉 金 海 文國容 庹必光

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

幽門螺桿菌感染對十二指腸黏膜上皮細(xì)胞碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的影響

鄧時莉 金 海 文國容 庹必光

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

目的 探究幽門螺桿菌(HP)感染對小鼠十二指腸上皮細(xì)胞碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的影響。方法 C57小鼠隨機(jī)分為四組，三組分別給予HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639感染，一組僅給予同等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃(對照組)，2 w后收集組織。體外培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞，與HP菌株共培養(yǎng)，其中對照組給予等量PBS干預(yù)，收集細(xì)胞。應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western印跡檢測組織及細(xì)胞中碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 HP感染小鼠后，由吉姆薩染色鏡檢見，感染后可見大量紫藍(lán)色小體，呈逗點狀、短棒狀；細(xì)胞實驗：HP菌株NCTC11637與十二指腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增HP16srRNA，小鼠及細(xì)胞實驗均目的基因為單一擴(kuò)增，擴(kuò)增良好。小鼠及細(xì)胞實驗均3種HP菌種囊性纖維跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)、離子交換體(SLC)26A3及SLC26A6感染2 w后，碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 從體內(nèi)到體外，HP可通過調(diào)控碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白含量來干預(yù)疾病的進(jìn)展。

幽門螺桿菌；十二指腸潰瘍；碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白；囊性纖維跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)；離子交換體(SLC)26A3；SLC26A6

十二指腸潰瘍主要的致病因素是幽門螺桿菌(HP)感染，其是通過細(xì)菌和宿主共同作用誘發(fā)疾病。HP侵襲腸黏膜上皮細(xì)胞，侵害黏膜自身防御和碳酸氫鹽修復(fù)平衡，從而誘發(fā)潰瘍疾病〔1〕。多種碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白，如囊性纖維跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)、離子交換體(SLC)26A3、26A6可通過干預(yù)碳酸氫鹽分泌參與腸黏膜上皮細(xì)胞正常調(diào)控，從而減弱胃腸分泌物及蛋白酶對消化系統(tǒng)的損害〔2〕。HP提取物可抑制腸黏膜上皮細(xì)胞碳酸氫鹽分泌，提示HP可能參與碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白合成過程〔3〕。本實驗通過體內(nèi)和體外試驗闡明HP感染腸黏膜上皮細(xì)胞的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年6～11月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)鏡科檢查患者20例取正常十二指腸球部黏膜組織，男11例，女9例，年齡34～58歲。HP標(biāo)準(zhǔn)株SS1、NCTC11637、NCTC11639購于中國疾病預(yù)防控制中心。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus及Prime ScriptTMRT Reagent Kit試劑購于TaKaRa寶生物公司；iQTM SYBR Green Supermix購于Bio-Rad公司；吉姆薩(Giemsa)染液購于貴陽恒因公司；CFTR、SLC26A3、SLC26A6抗體購于CST公司，引物設(shè)計由寶生物公司完成。

1.3 HP感染小鼠模型 30只雄性C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華公司)，6～7周齡，18～20 g體重，隨機(jī)分為實驗組和對照組各15只。HP培養(yǎng)3 d后，滅菌后調(diào)整濃度為1×109CFU/ml，0.5 ml灌胃，對照組給予同等劑量磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃，2 d/次，共4次。分別予HP灌胃2 w時采集十二指腸近心端0.3 cm長腸段，-80℃保存后備用。同時取胃標(biāo)本，進(jìn)行感染程度鑒定。對照組給予同等劑量PBS灌胃。

1.4 吉姆薩染色 取模型十二指腸及胃標(biāo)本的黏膜直接涂片，然后滴入吉姆薩染液，作用8 min，沖去多余浮色后，顯微鏡觀察并拍片。采用修訂好的悉尼標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行十二指腸HP感染密度判定：無，標(biāo)本未見HP；輕度，小于標(biāo)本全長的1/3有少量HP浸潤；中度，標(biāo)本全長的1/3～2/3有HP浸潤；重度，HP大量存在，浸潤達(dá)標(biāo)本全長。

1.5 mRNA 表達(dá)檢測 引物序列見表1。所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實驗均在冰塊上操作，降低溫度對結(jié)果的影響。取保存的十二指腸段，加入1 ml TRIZOL，應(yīng)用勻漿機(jī)裂解5 min；取培養(yǎng)好的腸上皮細(xì)胞，加入1 ml TRIZOL裂解5 min。然后依次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進(jìn)行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測定濃度及純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，嚴(yán)格按照說明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并嚴(yán)格按照擴(kuò)增試劑反應(yīng)要求，進(jìn)行PCR體系的擴(kuò)增及反應(yīng)，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 用于擴(kuò)增的各基因引物序列

1.6 蛋白印跡實驗 取培養(yǎng)后的腸黏膜細(xì)胞，加入含1%苯甲基磺酰氨(PMSF)的蛋白裂解液，12 000 r/min，4℃，離心30 min取上清，應(yīng)用蛋白定量檢測蛋白濃度后，將各樣品濃度配齊，并加入上樣緩沖液煮沸變性。上樣跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，加CFTR，SLC26A3，SLC26A6及內(nèi)參β-actin一抗4℃過夜，第2天辣根過氧化物酶二抗常溫孵育2 h，在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影定影，結(jié)果應(yīng)用Image-plus軟件測量灰度值。

1.7 十二指腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 清洗十二指腸黏膜后，將組織剪碎放入0.5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的RPMI1640培養(yǎng)基(NRM)溶液中，充分搖勻。取組織碎片，加入含酶的NRM溶液，37℃水浴，終止消化后離心取細(xì)胞沉淀，應(yīng)用含20 ng/ml的表皮生長因子及0.2 U/ml的胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取HP菌株培養(yǎng)72 h收獲，刮取菌落，混于滅菌PBS混勻，加入十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，按細(xì)菌細(xì)菌和細(xì)胞數(shù)量比為的比為100∶1培養(yǎng)，混合培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞備用。其中對照組予等量PBS溶液干預(yù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠HP感染的鑒定 胃竇黏膜切片，由吉姆薩染色鏡檢見，HP感染后可見大量紫藍(lán)色小體，呈逗點狀、短棒狀，見圖1；取胃竇黏膜組織，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增HP 16srRNA，可見，目的基因為單一擴(kuò)增，擴(kuò)增良好，退火溫度為60℃，其中擴(kuò)增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖見圖2。

圖1 小鼠胃竇黏膜HP感染鑒定

2.2 HP感染對小鼠碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白mRNA的影響 應(yīng)用RT-PCR檢測HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表達(dá)變化。CFTR、SLC26A3及SLC26A6均為單一擴(kuò)增，擴(kuò)增良好，且與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表達(dá)顯著低于對照組(均P<0.05)，見表2，圖3。

2.3 HP感染對小鼠碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的影響 應(yīng)用Western印跡檢測HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表達(dá)變化。與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)，見圖4。

圖2 小鼠16srRNA的擴(kuò)增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖

2.4 HP感染小鼠模型定值密度 各型菌株感染小鼠模型，其定值密度無明顯差異(P>0.05)，見表3。因此隨機(jī)選取標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實驗。

2.5 原代培養(yǎng)的十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng) 正常培養(yǎng)的十二指腸上皮細(xì)胞，以取出細(xì)胞開始培養(yǎng)為0 h，24～48 h細(xì)胞開始貼壁，7～8 d細(xì)胞開始增殖，10～14 d時細(xì)胞開始融合，見圖5。取十二指腸上皮細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增HP 16srRNA，可見，目的基因為單一擴(kuò)增，擴(kuò)增良好，退火溫度為60℃，其中擴(kuò)增曲線，溶解曲線及溶解曲線峰圖見圖6。

2.6 HP感染對十二指腸上皮細(xì)胞碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白mRNA的影響 應(yīng)用RT-PCR檢測HP與十二指腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表達(dá)變化。與對照組相比，NCTC11637菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

2.7 HP感染對十二指腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的影響 與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表達(dá)顯著低于對照組(均P<0.05)，見圖7。

表2 HP感染小鼠后2 w碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白mRNA的表達(dá)水平

與對照組比較：1)P<0.05；表4同

表3 各菌株HP感染小鼠定值密度分析〔n(%),n=12〕

圖3 HP感染小鼠后2 w CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表達(dá)水平

圖4 HP感染小鼠后2 w碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平

圖5 原代培養(yǎng)正常十二指腸黏膜上皮細(xì)胞

圖6 原代培養(yǎng)的人16srRNA的擴(kuò)增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖

組別CFTRSLC26A3SLC26A6對照組339±011179±071169±019實驗組031±0011)059±0211)061±0101)

圖7 HP與十二指腸黏膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

1 高 文,胡伏蓮,成 虹，等.國產(chǎn)藥物組成的四聯(lián)療法對胃炎及十二指腸潰瘍患者幽門螺桿菌感染根除效果的前瞻性多中心隨機(jī)對照研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2016；96(4):260-4.

2 Tarnawski AS，Ahluwalia A，Jones MK.Increased susceptibility of aging gastric mucosa to injury：the mechanisms and clinical implications〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(16)：4467-82.

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6 方健松，馬媛萍，劉 暢，等.自噬介導(dǎo)腸黏膜屏障維持腸道穩(wěn)態(tài)在炎癥性腸病中的作用〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016；32(8)：1367-9.

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〔2015-07-19修回〕

(編輯 苑云杰)

The regulation of H.pylori infection on the expression of bicarbonate transporter proteins in duodenal mucosa epithelial cells

DENG Shi-Li, JIN Hai, WEN Guo-Rong,etal.

Department of Digestion, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou, China

Objective To investigate the influence of bicarbonate transporter proteins expression on duodenal mucosa epithelial cells of the H.pylori (HP) infected mice.Methods C57 mice were randomly divided into four groups. Three groups were given HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 to be infected, and the control group was given the same dose of PBS gavage. The organs were collected after 2 weeks. In vitro, duodenal epithelial cells were cultured and given HP strain to be infected, and the control group was given the same dose of PBS. Then, cells were collected. The expression of bicarbonate transporter proteins of organs and cells were detected by RT-PCR and Western blot.Results In animal experiment, after the infection, a large number of purple blue bodies were found, which were funny and short by Giemsa staining. After HP strain-NCTC11637 infection on duodenal epithelial cells, the amplification of HP 16srRNA was both simple and well by RT-PCR in mice and cells.After 2 weeks of HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 infection on mice, the mRNA and protein expressions of bicarbonate transporter proteins were significantly lower than those of control group in mice and cells.Conclusions In vivo and in vitro, HP can intervene disease progression by regulating the expression of bicarbonate transporter proteins.

H.pylori；Duodenal ulcer；Bicarbonate transporter proteins；Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)；Anion exchanger pendrin(SLC)26A3；SLC26A6

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81160054)

庹必光(1963-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事胃腸上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運研究。

鄧時莉(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸道離子通道的研究。

R656.6+2

A

1005-9202(2017)09-2086-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.003