敬健雄 馮春紅 張春燕 夏先明 李 洪 代榮陽

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川 瀘州 646000)

膽管癌細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6/Stat3通路對(duì)c-Met的調(diào)控作用

敬健雄 馮春紅 張春燕1夏先明 李 洪1代榮陽1

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川 瀘州 646000)

目的 探討膽管癌細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-6/Stat3和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/c-Met通路的活化情況及其相互調(diào)控作用。方法 體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810，應(yīng)用Western印跡檢測(cè)IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化及其相互調(diào)控，用ELISA試劑盒檢測(cè)HCCC-9810細(xì)胞IL-6和HGF的分泌，RT-PCR檢測(cè)IL-6/Stat3對(duì)c-Met轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果 膽管癌細(xì)胞HCCC-9810中Stat3和c-Met均呈高度磷酸化，HCCC-9810細(xì)胞有較高水平IL-6分泌，無HGF分泌。IL-6/Stat3通路通過增強(qiáng)c-Met的穩(wěn)定性維持膽管癌細(xì)胞c-Met的高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致c-Met的異?；罨＝Y(jié)論 膽管癌細(xì)胞中IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)c-Met的異?；罨鹬匾饔?，IL-6/Stat3信號(hào)通路能通過c-Met信號(hào)通路發(fā)揮促膽管癌作用。

白細(xì)胞介素(IL)-6/Stat3信號(hào)通路；c-Met信號(hào)通路；膽管癌細(xì)胞

膽道慢性炎性損傷及其誘發(fā)的膽管上皮細(xì)胞炎性增殖是膽管癌(CCA)發(fā)生的重要基礎(chǔ)〔1～4〕。CCA惡性程度高、預(yù)后差，雖然手術(shù)切除是目前CCA治療的有效手段，但絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)，而根治性手術(shù)切除后患者的5年生存率也僅為20%～40%〔1～4〕。CCA細(xì)胞的高增殖能力是促成其高度惡性的兩大危險(xiǎn)因素，然而目前對(duì)其增殖的分子機(jī)制還知之甚少，因而研究調(diào)控CCA細(xì)胞增殖的信號(hào)分子和通路有望為CCA的治療提供新的分子靶點(diǎn)和臨床策略。白細(xì)胞介素(IL)-6參與多種生物學(xué)功能調(diào)控，主要包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控〔5～7〕。已有較多研究表明IL-6信號(hào)的異常與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展關(guān)系密切〔8～10〕。在CCA中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了IL-6信號(hào)通路的異?；罨襂L-6對(duì)維持CCA細(xì)胞的惡性表型起重要作用〔11～13〕。然而，IL-6如何參與調(diào)控CCA過程的機(jī)制還很不清楚。已經(jīng)明確肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的受體c-Met屬于促癌基因，c-Met的異?；罨虲CA的惡性增殖密切相關(guān)〔14,15〕，但是c-Met在CCA中異常活化的機(jī)制尚不明確。IL-6與c-Met在CCA中的調(diào)控關(guān)系尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究CCA細(xì)胞中IL-6與c-Met信號(hào)通路的活化狀態(tài)及其相互調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料 Stat3抑制劑(Stattic)，蛋白質(zhì)合成抑制劑Cycloheximide(CHX)和細(xì)胞因子IL-6購自Sigma公司；c-Met抑制劑PF-2341066(PF)購自Selleck Chemicals公司；IL-6和HGF ELISA試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；抗β-actin一抗購自Santa Cruz公司；抗phospho-Met(Tyr1234/1235)、c-Met、phospho-Stat3(Tyr705)、Stat3和gp130一抗購自Cell Signaling公司；二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將人CCA細(xì)胞系HCCC-9810以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中(5%CO2、95%空氣、37℃)，視情況換液。培養(yǎng)細(xì)胞分別用Stattic(10 μmol/L)、IL-6(50 ng/ml)及PF(100 nm/L)處理，并按對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。

1.2.2 RT-PCR 6孔板細(xì)胞加1 ml TRIzol并置于DEPC水處理過的1.5 ml EP管中室溫5 min。加氯仿1/5體積(0.2 ml)，輕柔充分混勻，室溫靜置3～5 min。4℃，12 000 r/min離心，15 min。轉(zhuǎn)移上層水相(約400 μl)于另一DEPC水處理過的1.5 ml EP管中，加異丙醇500 μl，混勻后室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心，10 min。棄上清，加75%乙醇1 ml洗沉淀。4℃，7 500 r/min離心，5 min，棄上清，空氣干燥沉淀5～10 min。沉淀溶于10～20 μl DEPC水中，電泳觀察，測(cè)濃度。1 μl隨機(jī)引物+2 μg RNA+DEPC水(總體積為15 μl)，70℃，5 min。加入1 μl dNTP，5 μl緩沖液,1.25 μl RNasin,1 μl M-MLV,1.75 μl DEPC水(總體積為25 μl)，37℃，60 min。產(chǎn)物用于PCR檢測(cè)。

1.2.3 Western印跡分析 提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，SDS-PAGE電泳分離。利用半干式電轉(zhuǎn)移儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜加入5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，室溫1 h。封閉結(jié)束后，將印跡有目的蛋白的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜與其抗體稀釋液置于4℃孵育過夜。用1×TBST洗膜3次(5 min/次)，印跡有目的蛋白的PVDF膜與二抗稀釋液室溫振搖孵育1 h。用1×TBST洗膜3次(5 min/次)。最后將化學(xué)發(fā)光劑浸透PVDF膜，并置于凝膠成像系統(tǒng)，放射自顯影5 min，即得到目的蛋白的免疫印跡圖譜。

1.2.4 ELISA分析 依據(jù)說明書提供的方法，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和HGF的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

圖1 CCA細(xì)胞中IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化

2.1 CCA細(xì)胞IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化 如圖1A所示，在無IL-6刺激(對(duì)照組)時(shí)CCA細(xì)胞HCCC-9810已經(jīng)有較高水平的Stat3磷酸化，而IL-6刺激能夠進(jìn)一步增強(qiáng)Stat3的磷酸化。此外，在無HGF刺激(對(duì)照組)的CCA細(xì)胞HCCC-9810中也檢測(cè)到了較高水平的c-Met磷酸化，而HGF刺激也明顯增強(qiáng)了c-Met的磷酸化(圖1B)。CCA細(xì)胞HCCC-9810的培養(yǎng)液中可以檢測(cè)到IL-6，其值為150±12.5。實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到CCA細(xì)胞HCCC-9810有HGF分泌，表明CCA細(xì)胞HCCC-9810有IL-6/Stat3和HGF/c-Met信號(hào)通路的高水平活化。

2.2 CCA細(xì)胞中IL-6/Stat3通路對(duì)c-Met活化的影響 在Stat3抑制劑Stattic的作用下，CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的磷酸化水平明顯下調(diào)，在作用3 h以后Stattic對(duì)c-Met磷酸化的抑制效果類似于c-Met抑制劑PF。值得注意的是，在Stat3抑制劑Stattic的作用下，CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的蛋白水平也出現(xiàn)了顯著下調(diào)，而c-Met抑制劑PF對(duì)c-Met的蛋白水平則無影響(圖2A)。在給予IL-6刺激時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞HCCC-9810中c-Met蛋白水平有明顯上調(diào)(圖2B)，表明CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的異常高表達(dá)與活化與IL-6/Stat3通路密切相關(guān)。

2.3 IL-6/Stat3通路對(duì)CCA細(xì)胞c-Met穩(wěn)定性的影響 如圖3所示，CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的轉(zhuǎn)錄水平不受IL-6刺激和Stat3抑制劑Stattic作用的影響，對(duì)照組為1.0±0.25，Stattic組為1.16±0.06，IL-6組為1.23±0.07，提示CCA細(xì)胞HCCC-9810中IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)c-Met表達(dá)的影響不在轉(zhuǎn)錄水平，Stat3抑制劑Stattic促進(jìn)了c-Met蛋白的降解，表明CCA細(xì)胞HCCC-9810中IL-6/Stat3信號(hào)通路的異?；罨瘜?dǎo)致了c-Met的異常高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致了c-Met的異?；罨?。

圖2 CCA細(xì)胞中IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)c-Met信號(hào)的調(diào)控

圖3 IL-6/Stat3對(duì)CCA細(xì)胞c-Met蛋白水平的影響

3 討 論

已經(jīng)有較多報(bào)道指出c-Met參與了結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和CCA的過程〔14～17〕。前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷c-Met明顯抑制了CCA細(xì)胞的增殖，我們推測(cè)c-Met能夠通過促增殖作用在CCA中發(fā)揮促癌效應(yīng)〔14〕。研究明確提出HGF過度表達(dá)和分泌及c-Met的過表達(dá)在c-Met的異?；罨衅鹬匾饔谩?6〕，提示CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的異?；罨cHGF的分泌無關(guān)，CCA中c-Met的異?；罨c其過表達(dá)有關(guān)。

近年來對(duì)炎癥反應(yīng)與腫瘤關(guān)系的研究十分活躍。IL-6/Stat3信號(hào)通路不僅是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路之一，也在腫瘤過程中扮演了重要角色〔8～10〕。Stat3是IL-6的核心效應(yīng)分子，此外，IL-6也通過MEK/ERK和PI3K/AKT等信號(hào)途徑發(fā)揮其生物學(xué)功能〔5～10〕。本文結(jié)果表明CCA細(xì)胞中Stat3和c-Met的異?；罨瘷C(jī)制不一致，Stat3的異常活化與IL-6表達(dá)分泌有關(guān)，而c-Met的異?；罨瘎t不依賴于HGF。阻斷Stat3抑制了CCA細(xì)胞中c-Met的磷酸化水平，而阻斷c-Met則對(duì)Stat3的磷酸化無明顯影響。由此可以推測(cè)，在CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的活化受到了IL-6/Stat3信號(hào)通路的調(diào)控。Stat3的阻斷不僅抑制了c-Met的磷酸化，也下調(diào)了c-Met的蛋白水平，這提示IL-6/Stat3是通過調(diào)控c-Met的表達(dá)水平達(dá)到對(duì)c-Met磷酸化的調(diào)控。IL-6刺激可以上調(diào)c-Met的蛋白水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IL-6/Stat3是通過調(diào)控c-Met的表達(dá)水平達(dá)到對(duì)c-Met磷酸化的調(diào)控。

由于基因表達(dá)調(diào)控受控于轉(zhuǎn)錄和蛋白兩個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)分析了膽管癌細(xì)胞中IL-6/Stat3對(duì)c-Met的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。本文結(jié)果說明CCA細(xì)胞中IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)c-Met的表達(dá)調(diào)控發(fā)生在蛋白水平。本文結(jié)果表明IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met蛋白的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。上述結(jié)果均表明IL-6/Stat3信號(hào)通路通過促進(jìn)c-Met蛋白的穩(wěn)定性達(dá)到對(duì)c-Met信號(hào)的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)了CCA細(xì)胞HCCC-9810中c-Met的異?；罨?，至于IL-6/Stat3是通過何種機(jī)制調(diào)控c-Met蛋白的穩(wěn)定性需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6/Stat3信號(hào)通路的活化導(dǎo)致了CCA細(xì)胞中c-Met蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致c-Met異常高表達(dá)。由于CCA細(xì)胞中未檢測(cè)到HGF分泌，因而CCA細(xì)胞中c-Met的異?；罨灰蕾囉贖GF，而是依賴于c-Met的異常高表達(dá)。鑒于c-Met信號(hào)通路在CCA中的促癌作用，可以推測(cè)IL-6/Stat3信號(hào)途徑能夠通過促進(jìn)c-Met信號(hào)的活化而發(fā)揮促CCA作用。對(duì)IL-6/Stat3和c-Met信號(hào)通路的異常及其調(diào)控機(jī)制在CCA細(xì)胞中的促癌作用及其分子機(jī)制開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究有望為CCA的分子靶向治療提供新的策略。

1 Figueras J,Valls C,Jaurrieta E.Biliary tract cancers〔J〕.N Engl J Med,2000；342(9):663-4.

2 Olnes MJ,Erlich R.A review and update on cholangiocarcinoma〔J〕.Oncology,2004;66(3):167-79.

3 Patel T.Cholangiocarcinoma〔J〕.Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol,2006；3(1):33-42.

4 Farazi PA,Zeisberg M,Glickman J,etal.Chronic bile duct injury associated with fibrotic matrix microenvironment provokes cholangiocarcinoma in p53-deficient mice〔J〕.Cancer Res,2006；66(13):6622-7.

5 Rose-John S.IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6 receptor:importance for the pro-inflammatory activities of IL-6〔J〕.Int J Biol Sci,2012；8(9):1237-47.

6 Mihara M,Hashizume M,Yoshida H,etal.IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions〔J〕.Clin Sci(Lond),2012；122(4):143-59.

7 Guk KD,Kuprash DV.Interleukin-11,an IL-6 like cytokine〔J〕.Mol Biol(Mosk),2011；45(1):44-55.

8 Nguyen DP,Li J,Tewari AK.Inflammation and prostate cancer:the role of interleukin 6(IL-6)〔J〕.BJU Int,2014；113(6):986-92.

9 Ghosh S,Ashcraft K.An IL-6 link between obesity and cancer〔J〕.Front Biosci(Elite Ed),2013；5:461-78.

10 Ataie-Kachoie P,Pourgholami MH,Morris DL.Inhibition of the IL-6 signaling pathway:a strategy to combat chronic inflammatory diseases and cancer〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev,2013；24(2):163-73.

11 Isomoto H.Epigenetic alterations in cholangiocarcinoma-sustained IL-6/STAT3 signaling in cholangio-carcinoma due to SOCS3 epigenetic silencing〔J〕.Digestion,2009；79(Suppl 1):2-8.

12 Zhu H,Han C,Lu D,etal.miR-17-92 cluster promotes cholangiocarcinoma growth:evidence for PTEN as downstream target and IL-6/Stat3 as upstream activator〔J〕.Am J Pathol,2014；184(10):2828-39.

13 Zheng T,Hong X,Wang J,etal.Gankyrin promotes tumor growth and metastasis through activation of IL-6/STAT3 signaling in human cholangiocarcinoma〔J〕.Hepatology,2014；59(3):935-46.

14 Dai R,Li J,Fu J,etal.The tyrosine kinase c-Met contributes to the pro-tumorigenic function of the p38 kinase in human bile duct cholangiocarcinoma cells〔J〕.J Biol Chem,2012；287(47):39812-23.

15 Miyamoto M,Ojima H,Iwasaki M,etal.Prognostic significance of overexpression of c-Met oncoprotein in cholangiocarcinoma〔J〕.Br J Cancer,2011；105(1):131-8.

16 You H,Ding W,Dang H,etal.c-Met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,2011；54(3):879-89.

17 Goetsch L,Caussanel V,Corvaia N.Biological significance and targeting of c-Met tyrosine kinase receptor in cancer〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2013；18:454-73.

〔2016-02-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

Role of IL-6/Stat3 pathway in the regulation of c-Met in cholangiocarcinoma cells

JING Jian-Xiong,FENG Chun-Hong,ZHANG Chun-Yan,etal.

Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China

Objective To investigate the activation of the interleukin (IL)-6/signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) and hepatocyte growth factor/c-Mer (HGF/c-Met) pathways in human cholangiocarcinoma cells and assess the cross-talk between the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in human cholangiocarcinoma cells.Methods Cholangiocarcinoma cells HCCC-9810 were cultured in vitro.The activation of the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in cholangiocarcinoma cells was measured by Western blot.The cross-talk between the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in cholangiocarcinoma cells was measured by Western blot.The secretion in IL-6 and HGF in cholangiocarcinoma cells was measured by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The effect of the IL-6/Stat3 pathway on c-Met mRNA levels was assessed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Results HCCC-9810 cells showed strong expression of phosphated Stat3 and phosphated c-Met.The secretion in of IL-6, but not HGF, was detected in HCCC-9810 cells.The IL-6/Stat3 pathway resulted in the abnormal activation of c-Met through enhancing the stability of c-Met.Conclusions In cholangiocarcinoma cells, the IL-6/Stat3 pathway plays an important role in sustaining the abnormal activation of c-Met.Thus, c-Met is involved in the effect of IL-6/Stat3 on cholangiocarcinoma promotion.

IL-6/Stat3 pathway;c-Met pathway;Cholangiocarcinoma cells

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81472312)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(No.NCET-11-1058);四川省優(yōu)秀青年基金培育項(xiàng)目(No.2013JQ0045);瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合項(xiàng)目(No.2013LZLY-J06);四川省-瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合項(xiàng)目(No.14JC0082;No.14ZC0070)

代榮陽(1975-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝膽腫瘤研究。

敬健雄(1989-)，男，碩士，主要從事肝膽腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2095-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.006

1 瀘州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室