于德欽， 陳 薇， 殷盛明△， 安 冬， 趙 丹， 孟 旭， 徐 紅， 王冬梅， 孫藝平,， 趙 杰, 張萬(wàn)琴

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116044)

蝎源活性肽對(duì)早期帕金森病大鼠腦源性營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的影響*

于德欽1， 陳 薇1， 殷盛明1△， 安 冬1， 趙 丹1， 孟 旭1， 徐 紅2， 王冬梅， 孫藝平1,2， 趙 杰1, 張萬(wàn)琴1

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116044)

目的：研究蝎源活性肽對(duì)早期帕金森病(PD)大鼠腦源性營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及神經(jīng)肽Y(NPY)的影響。方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組(n= 11)，分為早期PD模型組、假手術(shù)對(duì)照組和蝎源活性肽治療組。將6羥多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗壞血酸生理鹽水)注射到SD大鼠右側(cè)紋狀體制備早期PD模型，注射2周后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠，和相應(yīng)的對(duì)照組腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)處理1周。3周后，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦源性營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性。結(jié)果：在6-OHDA給藥側(cè)，PD動(dòng)物與假手術(shù)對(duì)照組相比較，BDNF免疫反應(yīng)活性明顯增強(qiáng)，NPY免疫反應(yīng)活性明顯減少，蝎源活性肽處理可以逆轉(zhuǎn)這些異常改變。結(jié)論：改變PD早期中腦內(nèi)NPY與BDNF的免疫反應(yīng)活性是蝎源活性肽對(duì)早期PD大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制之一。

帕金森病；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；神經(jīng)肽Y；蝎源活性肽；大鼠

Patkinson’s disease； brain-drived neurotrophic factor； neuropeptide Y； rat

【DOI】 10.12407/j.cjap.5387.2017.007

帕金森病(Parkinson＇s disease, PD)是慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，常見于中老年人。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是是指由于神經(jīng)元變性所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其影響運(yùn)動(dòng)功能和廣泛的認(rèn)知領(lǐng)域包括執(zhí)行功能[1]，目前尚無(wú)有效的治療手段。PD的發(fā)病主要是因?yàn)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)進(jìn)行性變性，進(jìn)而導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺水平顯著降低[2]。PD起病緩慢，有報(bào)道PD的早期發(fā)病可能長(zhǎng)達(dá)10年之久[3]。早期PD的發(fā)病原因尚不清楚,與年齡和環(huán)境等其它因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制與自由基、炎癥、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏和凋亡等相關(guān)，這些因素相互作用最終引起神經(jīng)元死亡[4]。蝎源活性肽具有抗氧化活性并減輕PD動(dòng)物線粒體損傷，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在大腦內(nèi)分布廣泛，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)即神經(jīng)肽酪氨酸，由36個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一種活性多肽，屬于胰多肽家族，在腦內(nèi)和胃腸道含量豐富。NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，在重要的生理功能和病理?xiàng)l件如癲癇、慢性疼痛、焦慮和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的作用[5]?，F(xiàn)已知的NPY受體亞型為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，共5種，都為G蛋白偶聯(lián)受體。 研究顯示，神經(jīng)肽通過(guò)作用于Y1、Y2受體，可參與情緒的調(diào)節(jié)，如抑郁大鼠模型腦組織YI受體顯著減少，Y2受體顯著增加[6]。

神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6 hydroxydopamine,6-OHDA)結(jié)構(gòu)類似于多巴胺,注射6-OHDA于大鼠紋狀體內(nèi)，會(huì)使黑質(zhì)發(fā)生退行性變，作用于多巴胺能神經(jīng)元，常用于PD模型的制備[7,8]。本課題組前期工作已發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽對(duì)MPTP處理小鼠及6-OHDA處理的大鼠PD模型動(dòng)物的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用[9,10]。本實(shí)驗(yàn)制備早期6-OHDA大鼠PD模型，觀察PD模型的中腦內(nèi)BDNF及NPY的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽的神經(jīng)保護(hù)作用。為早期PD的發(fā)病機(jī)制及診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PD動(dòng)物模型制備與分組

(1)實(shí)驗(yàn)分組及處理：蝎源活性肽(提取于東亞鉗蝎，以提取物的蛋白測(cè)定量為注射劑量依據(jù)，本課題組專利，ZL01161169)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組(n= 11)，分為早期PD模型組、假手術(shù)對(duì)照組和蝎源活性肽治療組。將6羥多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗壞血酸生理鹽水)注射到大鼠右側(cè)紋狀體制備早期PD模型，注射2周后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)處理1周。3周后，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦源性營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性健康SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXX Ⅱ2008002)，體重為170～230 g。

(2)麻醉(4%水合氯醛，ip)、固定(腦立體定位儀)、選取靶點(diǎn)(根據(jù)George Paxinos&Charles Watson大鼠腦定位圖譜)。早期 PD組的注射靶點(diǎn)為紋狀體，坐標(biāo)定位為AP=+1.0(前囟前)， R=3.0 mm(向右旁開)，H =-4.5 mm(硬膜下)。早期PD模型組和蝎源活性肽治療組的動(dòng)物腦內(nèi)注射溶解于Vehicle(0.1%抗壞血酸，0.9% NaCl)的6-OHDA，注射劑量為20 μg/3 μl。緩慢注射，留針3 min后，慢慢退出。在相同條件下假手術(shù)對(duì)照組動(dòng)物，將同等容積的Vehicle注入靶點(diǎn)。蝎源活性肽單獨(dú)對(duì)照組和治療組在完成行為學(xué)測(cè)試后給予2.20 mg/kg·d的蝎源活性肽腹腔注射1周，其余兩組則給予NS。

1.2 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)

術(shù)后2周，于SD大鼠頸背部注射阿樸嗎啡(0.5 mg/kg，ih)，溶于0.4 ml NS中，誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)(30 min)，記錄旋轉(zhuǎn)次數(shù)，每分鐘7轉(zhuǎn)以下的左旋鼠是成功的早期PD大鼠模型。檢測(cè)過(guò)程中環(huán)境安靜，切勿嘈雜喧鬧。

邁步實(shí)驗(yàn)：(1)適應(yīng)環(huán)境：大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境3 d，將1.1 m長(zhǎng)木板傾斜30°放置與鼠籠相連，訓(xùn)練大鼠爬回籠中。(2)開始實(shí)驗(yàn)：將大鼠雙后肢固定并緩慢輕輕上提，使其離開木板，隨后將一側(cè)前肢固定，另一側(cè)前肢不離開木板，觀察待其前肢自動(dòng)移動(dòng)時(shí)，開始計(jì)時(shí)。(3)記錄時(shí)間：記錄大鼠從邁步開始到返回鼠籠所用總時(shí)間與大鼠走過(guò)整個(gè)桌面斜面的總步數(shù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的測(cè)驗(yàn)順序：左→右，并且重復(fù)2次。

1.3 免疫組織化學(xué)反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)第3周，進(jìn)行腦組織灌流固定，之后蔗糖脫水，冰凍切片后，選取中腦黑質(zhì)腦片，采用漂浮法法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用PBS漂洗3次后用含1%過(guò)氧化氫的PBS處理以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。山羊血清封閉2 h。分別加入BDNF(Sigma，1∶500)和NPY(Sigma，1∶500)抗體。4℃孵育過(guò)夜。用生物素化二抗進(jìn)行室溫孵育2 h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液進(jìn)行室溫孵育1 h，充分漂洗后，用新鮮配制的顯色劑(DAB)進(jìn)行顯色，適時(shí)終止反應(yīng)。將腦片晾干后，再用二甲苯透明，使用中性樹脂封片。對(duì)照組使用PBS代替一抗。實(shí)驗(yàn)中加以陰性對(duì)照組(不加入一抗)以確認(rèn)BDNF和NPY免疫反應(yīng)陽(yáng)性的結(jié)果。

1.4 免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)

定量分析BDNF-IR和NPY-IR的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，采用病理圖文分析系統(tǒng)。各組選取大鼠6只。根據(jù)George Paxinos &Charles Watson的The RateBrain選取定位，首先在低倍物鏡下觀察，定位黑質(zhì)致密部(SNR)，測(cè)量面積是20 000 μm2(100 μm×200 μm)，選取四個(gè)部位計(jì)數(shù)并取其平均值。計(jì)算框內(nèi)BDNF-IR和NPY-IR陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，而后隨機(jī)選6個(gè)BDNF-IR和NPY-IR陽(yáng)性細(xì)胞，將其胞漿的平均灰度測(cè)出。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

邁步實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，早期PD大鼠回到鼠籠時(shí)間與總步數(shù)無(wú)明顯差異(表1)。

GroupTime(S)1std2ndd3rddStep1std2ndd3rddControl5.00±0.564.83±0.563.42±0.349.00±0.9010.00±0.759.00±0.67PD5.14±0.645.00±0.464.07±0.979.00±0.529.00±0.368.00±0.73

PD: Parkinson’s disease

2.2 BDNF和NPY免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA處理的早期PD大鼠黑質(zhì)BDNF免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量和平均光密明顯度增多，而黑質(zhì)致密部NPY免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞平均光密度明顯減少；而蝎源活性肽一定程度上逆轉(zhuǎn)了異常的BDNF和NPY免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)活性(圖1，表2，圖1見彩圖頁(yè)Ⅱ)。單獨(dú)蝎源活性肽對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，所以結(jié)果中未展示。

GroupBDNFNPYControl8.34±0.525.50±1.10PD14.00±0.894.00±0.05Scorpionvenom5.33±0.055.50±0.29

PD: Parkinson’s disease; BDNF: Brain-derived neurotrophic factor; NPY: Neuropeptide Y

3 討論

PD是慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，常見于中老年人。發(fā)病主要是因?yàn)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)進(jìn)行性變性。蝎源活性肽具有抗氧化活性并減輕PD動(dòng)物線粒體損傷，進(jìn)而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[11]。

BDNF在大腦內(nèi)分布廣泛，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元受到損傷時(shí)，可能引起其代償性的表達(dá)增多，進(jìn)而試圖以此來(lái)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元避免或加重其損傷。蝎源活性肽通過(guò)早期保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元后，降低了BDNF的這種代償性的表達(dá)增多。NPY即神經(jīng)肽酪氨酸，由36個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一種活性多肽，屬于胰多肽家族，在腦內(nèi)和胃腸道含量豐富。近年研究顯示，采用PD藥物治療的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與BDNF密切相關(guān)。Baquet ZC 等[12]發(fā)現(xiàn)，BDNF對(duì)于中腦多巴胺能神經(jīng)元的生存和分化有促進(jìn)作用。BDNF能改善6-OHDA造成的PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少及超微結(jié)構(gòu)影響[13]。BDNF基因工程方法制備的PD大鼠模型，PD大鼠紋狀體內(nèi)DA代謝率顯著降低，DA水平有所提高，改善了PD大鼠的主動(dòng)活動(dòng)性[14]。NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，在重要的生理功能和病理?xiàng)l件如癲癇、慢性疼痛、焦慮和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的作用[15]。

臨床上多采用影像學(xué)檢測(cè)和回顧性PD患者尸檢等方法[16]研究PD臨床期。動(dòng)物模型更適用于PD早期研究[13]。將6-OHDA注入腦內(nèi)，改變注藥部位和注藥量的不同，可以模擬PD患者的病理改變，已被廣泛用于PD研究[11]?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，本研究觀察早期PD模型的中腦內(nèi)BDNF及NPY的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽的神經(jīng)保護(hù)作用。這為早期PD的發(fā)病機(jī)制及診治提供理論依據(jù)。

[1] Habak C, Noreau A, Nagano-Saito A,etal. Dopamine transporter SLC6A3 genotype affects cortico-striatal activity of set-shifts in Parkinson's disease[J].Brain, 2014, 137(Pt 11): 3025-3035.

[2] 彭 巖， 殷盛明， 于德欽， 等. 早期帕金森病大鼠血清抗氧化能力降低[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(5)： 218-220.

[3] Tansey MG, Frank-Cannon TC, McCoy MK,etal. McAlpine FE, Ruhn KA, Tran TA. Neuroinflammation in Parkinson's disease: is there sufficient evidence for mechanism-based interventional therapy[J].FrontBiosci, 2008, 13: 709-717.

[4] 閆 穎， 趙詠梅. 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與帕金森治療研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011, 31(3): 527-530.

[5] Decressac M, Barker RA. Neuropeptide Y and its role in CNS disease and repair[J].ExpNeurol, 2012, 238(2): 265-272.

[6] Morales-Medina JC, Dumont Y, Benoit CE,etal. Role of neuropeptide Y Y1and Y2receptors on behavioral despair in a rat model of depression with co-morbid anxiety[J].Neuropharmacol, 2012, 62(1): 200-208.

[7] Brooks DJ. The early diagnosis of Parkinson's disease[J].AnnNeurol, 1998, 44(3 Suppl 1): S10-18.

[8] Na SJ, DiLella AG, Lis EV,etal. Stone DJ, Hess JF. Molecular profiling of a 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease[J].NeurochemRes, 2010, 35(5): 761-72.

[9] Yin SM, Yu DQ, Gao X,etal. Scorpion venom heat-resist ant protein decreases immunoreactivit y of OX-42-positive microglia cells in MPTP-treated mice[J].NeuralRegenRes, 2008, 3(9): 967-970.

[10]殷盛明， 于德欽， 彭 巖， 等. 神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)活性肽保護(hù)帕金森病大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)制[J]. 中草藥, 2010, 41(11)： 20-24.

[11]于德欽, 殷盛明, 彭 巖. 早期帕金森病大鼠線粒體損傷的研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志， 2010， (06)， 511-513.

[12]Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Brain-derived neurotrophic factor is required for the establishment of the proper number of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta[J].JNeurosci. 2005, 25(26): 6251-6259.

[13]牛 平， 王耀山， 呂永利， 等. 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)帕金森病大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志， 2000, 17(4).

[14]趙鋼勇， 崔 蕾， 高 娟， 等. BDNF基因工程細(xì)胞對(duì)帕金森大鼠紋狀體多巴胺及其代謝物影響的研究[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(1)： 82-85.

[15]胡春燕， 李英文. 神經(jīng)肽Y(NPY)的生理功能研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志， 2011， 28(2)： 66-68.

[16]Jenner P. Functional models of Parkinson's disease: a valuable tool in the development of novel therapies[J].AnnNeurol, 2008, 64(Suppl 2): S16-29.

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201724)；遼寧省大學(xué)生科研創(chuàng)新活動(dòng)(201310161008)

2015-12-01 【修回日期】2016-07-06

R742.5

A

1000-6834(2017)01-030-03

△【通訊作者】Tel: 0411-86110288; E-mail: dlshengming@163.com