趙美平, 馬迎春, 張聰聰, 黃林靜, 鄭夢(mèng)曉, 黎關(guān)龍, 應(yīng) 磊,2, 王萬鐵,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 3. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科， 甘肅 蘭州 7300504； 4. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所毒理學(xué)研究室， 杭州 310013)

ERK1/2通路在低氧上調(diào)大鼠PASMCs鈣激活性氯離子通道表達(dá)的作用*

趙美平1, 馬迎春3+, 張聰聰1, 黃林靜1, 鄭夢(mèng)曉1, 黎關(guān)龍4, 應(yīng) 磊1,2, 王萬鐵1,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 3. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科， 甘肅 蘭州 7300504； 4. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所毒理學(xué)研究室， 杭州 310013)

目的：探討鈣激活性氯離子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中mRNA和蛋白表達(dá)的變化及其與ERK1/2信號(hào)通路的關(guān)系。方法：PASMCs隨機(jī)分為：常氧組(N組)，低氧組(H組)，DMSO對(duì)照組(D組)， U0126干預(yù)組(U組)，Staurosporine aglycone干預(yù)組(SA組)，采用免疫印跡法檢測(cè)CLCA2蛋白的表達(dá)；選用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測(cè)定CLCA2 mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果：PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表達(dá)量,H組較N組明顯上調(diào)(P<0.01)；U組較D組明顯上調(diào)(P<0.01)；SA組較D組mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，蛋白的表達(dá)輕微下調(diào)。結(jié)論：低氧可上調(diào)CLCA2中 mRNA和蛋白在PASMCs的表達(dá)；ERK1/2通路激活劑-Staurosporine aglycone能下調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量；ERK1/2通路抑制劑-U0126可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量。

鈣激活性氯離子通道；低氧； PASMCs；ERK1/2；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5436.2017.011

研究表明[1]，存在于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的氯離子通道，大多是鈣激活性氯離子通道(calcium activated chloride channel, CLCA2)和容量激活性氯離子通道(volume activated chloride channel，C1swell)。慢性低氧會(huì)誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的鈣激活性氯離子通道，增強(qiáng)血管持續(xù)收縮，產(chǎn)生細(xì)胞增殖、血管重建進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成。而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2)表達(dá)的變化主要見于肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[2]。以往研究發(fā)現(xiàn)[3]，低氧能激活肺動(dòng)脈平滑肌上的氯離子通道和ERK。那么鈣激活性氯離子通道與ERK1/2之間是否存在一定聯(lián)系呢? ERK1/2是否為鈣激活性氯離子通道的上下游信號(hào)通路呢?為了闡明這一問題，本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)細(xì)胞法觀察了CLCA2在大鼠低氧性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中mRNA和蛋白表達(dá)的變化，初步探討了CLCA2與 ERK1/2信號(hào)通路之間的關(guān)系,為臨床低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究及其防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)健康雄性SD大鼠14只, 體重(body weight, BW) 200±50 g, 由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(浙)2010-0101號(hào)]

1.2 試劑及儀器

U0126(美國, Sigma公司); Staurosporine aglycone(美國,Sigma公司); 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，上海申工生物技術(shù)有限公司); α-SM actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(英國,abcam公司);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶/EDTA(美國,Gibco公司);CLCA2兔抗人多克隆抗體(美國,Sigma公司);HRP標(biāo)記β-actin(上海,康城公司);50 bp DNA Marker、RT-PCR試劑盒(Fermentas life sciences公司);RT-PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);PVDF膜(美國,Milipore公司);彩色預(yù)染蛋白maker(MBI，F(xiàn)ermentas公司);BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國,Pierce公司)。

生物倒置相差顯微鏡XDS-1B(重慶光學(xué)儀器設(shè)備廠);低氧培養(yǎng)箱(Herareus, 美國);顯微外科用顯微鏡(Olympus, 日本); 恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國); 722N分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司); EXL-808酶標(biāo)儀(USA); 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-3型，北京六一儀器廠); 蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad公司);凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad公司);PCR儀(Thermo Hybaid, 美國)。

1.3 方法

1.3.1 PASMCs的培養(yǎng) 具體操作步驟詳見參考文獻(xiàn)[4]。

1.3.2 PASMCs的鑒定 普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)鑒定：倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片；免疫熒光染色法鑒定：先將細(xì)胞以合適密度接種于蓋玻片上，放入常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1～2 d，用PBS清洗細(xì)胞爬片，4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10～15 min，PBS漂洗3次，用3% H2O2去離子水封閉后結(jié)合血管平滑肌α-SM actin單抗(用PBS稀釋1∶100)，4℃過夜后避光加入FITC標(biāo)記的濃度為1∶100的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫避光孵育20～30 min。PBS漂洗后滴加細(xì)胞核染色液DAPI(1∶1 000稀釋)，室溫避光孵育3～5 min，PBS洗3次，免疫熒光顯微鏡下對(duì)同一視野以不同激發(fā)波長(FITC：激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光峰值525 nm；DAPI：358 nm的激發(fā)光波長，461 nm的發(fā)射光峰值)觀察并拍照。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前將SD大鼠4～6代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于無血清的DMEM培養(yǎng)液中24 h，分為5組，每組6皿細(xì)胞；分別為：(1)常氧組(N): 21% O2, 5% CO2，37℃,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h; (2)低氧組(H): 2% O2, 5% CO2, 37℃, DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h; (3) DMSO對(duì)照組(D): 2% O2, 5% CO2, 37℃,0.05% DMSO培養(yǎng) 48 h; (4) U0126干預(yù)組(U): 2% O2, 5% CO2, 37℃, 10 μmol/L U0126,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng), 48 h; (5)Staurosporine aglycone干預(yù)組(SA):2% O2, 5% CO2, 37 ℃, 30 μmol/L Staurosporine aglycone,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.3.4 蛋白免疫印跡法及RT-PCR法檢測(cè)PASMCs CLCA2的蛋白及mRNA含量 具體操作步驟詳見參考文獻(xiàn)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠PASMCs的培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)生長特點(diǎn) 選取預(yù)先準(zhǔn)備好的SPF級(jí)SD雄性大鼠，從其身上分離出原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[5]，離體培養(yǎng)后的2～3 d開始增殖，6～7 d開始融合呈典型的“峰谷”狀生長，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，呈長梭形，鏡下觀察可見其折光性較好，細(xì)胞核可為多個(gè)(圖1)。

2.1.2 免疫細(xì)胞熒光法鑒定PASMCs 染色后在免疫熒光顯微鏡下觀察，約99%呈陽性反應(yīng)，胞漿內(nèi)細(xì)絲狀發(fā)綠色熒光且與PASMCs長軸平行的為FITC標(biāo)記的平滑肌α-actin，實(shí)為平滑肌α-肌動(dòng)蛋白，僅平滑肌細(xì)胞呈陽性反應(yīng)；經(jīng)DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(圖2)。

Fig. 1 Rat PASMCs by primary culturing(×100)

Fig. 2 Immunobiochemical identification of rat PASMCs(×400)

2.2 各組PASMCs上CLCA2 mRNA表達(dá)的變化

2.2.1 低氧對(duì)PASMCs上CLCA2 mRNA表達(dá)的影響 與N組(0.841±0.039)相比 ，H組(1.116±0.013)CLCA2 mRNA表達(dá)量顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3、圖4)。

Fig. 3 Expression of CLCA2 mRNA in all groups

2.2.2 低氧條件下U0126對(duì)PASMCs上CLCA2 mRNA表達(dá)的影響 與N組(0.841±0.039)比較, D組(1.121±0.038)、U組(1.812±0.013)、SA組(1.051±0.041)CLCA2 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)；與H組(1.116±0.013)比較，D組(1.121±0.038)CLCA2 mRNA表達(dá)無明顯差異)；與D組(1.121±0.038)比較，U組(1.812±0.013)CLCA2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，SA組(1.051±0.041)CLCA2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01，圖3、圖4)。

2.3 各組PASMCs上CLCA2蛋白表達(dá)的變化

2.3.1 低氧對(duì)CLCA2蛋白表達(dá)的影響 與N組(0.424±0.010)相比，H組(0.530±0.017)CLCA2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5、圖6)。

2.3.2 低氧條件下U0126對(duì)PASMCs上CLCA2蛋白表達(dá)的影響 與N組(0.424±0.010)比較，D組(0.533±0.007)、U組(0.568±0.007)、SA組(0.505±0.026)CLCA2蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)；與H組(0.530±0.017)比較，D組(0.533±0.007)CLCA2蛋白的表達(dá)無顯著差異；與D組(0.533±0.007)比較，U組(0.568±0.007)CLCA2蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),SA組(0.505±0.026)CLCA2蛋白的表達(dá)下調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖5、圖6)。

Fig. 5 Expression of CLCA2 protein in all groups

3 討論

研究表明[6,7]，鈣激活性氯離子通道在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的興奮機(jī)制中起到重要作用，慢性低氧會(huì)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的鈣激活性氯離子通道上調(diào)，導(dǎo)致血管反應(yīng)增強(qiáng)，收縮增加，在調(diào)控血管張力和收縮性方面起重要作用。細(xì)胞膜氯離子的靜息通透性相對(duì)較大，血管平滑肌細(xì)胞靜息膜電位約-55 mv，氯離子平衡電位約-34 mv，故激活CLCA2可引起肺動(dòng)脈血管強(qiáng)烈收縮等去極化效應(yīng)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，在生理狀態(tài)下，CLCA2參與了苯腎上腺素引起的肺主動(dòng)脈收縮，PASMCs上CLCA2的重要性是由于有相對(duì)高的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度，[Ca2+]i升高是激活此通道的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)：CLCA2在 PASMCs中mRNA和蛋白的表達(dá)量，低氧較常氧環(huán)境明顯升高。表明低氧可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量，其機(jī)制尚不完全明確，可能與低氧環(huán)境下PASMCs 膜通透性增加，[Ca2+]i升高進(jìn)而激活CLCA2，引起細(xì)胞內(nèi)氯離子外流，被激活的CLCA2使細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，更多Ca2+內(nèi)流進(jìn)而引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、增殖等一系列反應(yīng)[10]。

有文獻(xiàn)指出[11]，間歇低氧可引起ERK蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活ERK信號(hào)通路。本室先前的研究[12]也表明，在低氧高二氧化碳條件下，ERK1/2通路抑制劑-U0126可抑制二級(jí)肺動(dòng)脈的Ⅱ期持續(xù)收縮反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用ERK1/2通路抑制劑-U0126后，CLCA2在大鼠PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量高于對(duì)照組DMSO組，應(yīng)用Staurosporine aglycone后，CLCA2在大鼠PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)水平不同程度下調(diào)，均低于對(duì)照組DMSO組。除SA組CLCA2蛋白表達(dá)結(jié)果較D組而言未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，U0126組CLCA2mRNA及蛋白、SA組CLCA2mRNA較對(duì)照組D組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，ERK1/2通路可參與調(diào)控SD大鼠低氧性PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表達(dá)， ERK1/2可能是CLCA2的上游調(diào)控分子，但具體情況有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，低氧可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量；ERK1/2通路激活劑-Staurosporine aglycone能下調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量；ERK1/2通路抑制劑-U0126可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達(dá)量。

[1] 馬建法. 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞離子通道在肺動(dòng)脈高壓中的作用[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2014, 43(12): 1518-1520.

[2] We C, Li HZ, Wang YH,etal. Exogenous spermine inhibits the proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells caused by chemically-induced hypoxia via the suppression of the ERK1/2- and PI3K/AKT-associated pathways[J].IntJMolMed, 2016, 37(1): 39-46.

[3] Young KC, Torres E, Hehre D,etal. Antagonism of Stem Cell Factor/c-kit Signaling Attenuates Neonatal Chronic Hypoxia-Induced Pulmonary Vascular Remodeling[J].PediatrRes, 2016, 79(4): 637-646.

[4] 黃林靜, 黎關(guān)龍, 何金波, 等. 鈣激活性氯離子通道在大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs中的表達(dá)及與MAPK通路的關(guān)系[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(9): 1321-1327.

[5] 王 靜, 戴愛國. 原代大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的提取和鑒定以及缺氧對(duì)其增殖的影響[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志, 2012, 11(02):147-152.

[6] Sun H, Xia Y, Paudel O,etal. Chronic hypoxia-induced upregulation of Ca2+-activated Cl-channel in pulmonary arterial myocytes: a mechanism contributing to enhanced vasoreactivity[J].JPhysiol, 2012, 590(15): 3507-3521.

[7] 劉建華, 張曉蕓, 李 鑫, 等. CaCCs通道鈣離子依賴性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 15(29): 5782-5785.

[8] 王 蕊, 李 麗, 馬克濤, 等. 鈣激活氯通道對(duì)大鼠腦基底動(dòng)脈舒縮活動(dòng)的影響[J]. 生理學(xué)報(bào), 2014, 66(03): 295-301.

[9] 楊 朝. 急性低氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號(hào)的變化及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(10): 2016-2019.

[10]潘宣任, 王 凱, 龐玉生. 鈣激活性氯離子通道抑制劑對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌作用的研究進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2015, 44(26): 3699-3701.

[11]張盼盼, 韓曉慶, 李 琳, 等. 間歇低氧大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶與認(rèn)知功能變化[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志, 2014, 40(9): 517-521.

[12]朱阿楠, 王萬鐵, 林麗娜, 等. MAPK通路抑制劑對(duì)低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈收縮的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(8): 1538-1542.

The effects of ERK1/2 pathway on the expression of calcium activated chloride channel in hypoxia in PASMCs rat model

ZHAO Mei-ping1, MA Ying-chun3+, ZHANG Cong-cong1, HUANG Lin-jing1, ZHENG Meng-xiao1, LI Guan-long4, YING Lei1,2, WANG Wan-tie1,2△

(1. Department of Pathophysiology, Wenzhou Medical University, 2. Research Institute of Wenzhou Medical University in ischemia-reperfusion injury, Wenzhou 325035; 3. Department of Pathology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050; 4. Zhejiang Provincial Academy of Medical Sciences and Health Research Institute of Toxicology Laboratory, Hangzhou 310013, China)

Objective: To investigate the expression of mRNA and protein of Calcium activated chloride channel (CLCA2) in hypoxic pulmonary artery smooth muscle cell (PASMCs) of rat and it’s relationship with ERK1/2 signal pathway. Methods: PASMCs were randomly divided into 5 groups including normal group(N group), hypoxia group(H group), DMSO group(D group), U0126 group (U group) and Staurosporine aglycone group(SA group). The protein expression of CLCA2 in PASMCs was detected by Western blot．The mRNA expression of CLCA2 was detected by half quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The mRNA and protein expressions of CLCA2 in H group were significantly higher than N group (P<0.01). Comparing with D group,the mRNA and protein expressions of CLCA2 were significantly increased in U group (P<0.01),the mRNA expression of CLCA2 in SA group was obviously decreased (P<0.01) with slightly decreasing of its protein expression. Conclusion: Hypoxia promotes the expressions of mRNA and protein of CLCA2 in rat PASMCs. The ERK1/2 pathway activator Staurosporine aglycone reduces the mRNA and protein expression of CLCA2 in rats PASMCs and the ERK1/2 pathway inhibitor U0126 induces the upregulation of the mRNA and protein expressiosn of CLCA2 in rats PASMCs.

calcium activated chloride channel; hypoxia; ERK1/2; rat

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37121)

2016-03-11 【修回日期】2016-10-22

R363

A

1000-6834(2017)01-047-04

△【通訊作者】Tel: 0577-86689817； E-mail: wwt@wmu.edu.cn；+： 并列第一作者