凌宏艷， 賀 娟,2+， 楊絲絲， 張愷芳， 何劍琴， 朱責(zé)梅， 奉水東

(1. 南華大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室， 3. 南華大學(xué)社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂代謝的影響*

凌宏艷1， 賀 娟1,2+， 楊絲絲1， 張愷芳1， 何劍琴1， 朱責(zé)梅1， 奉水東3Δ

(1. 南華大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室， 3. 南華大學(xué)社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的：觀察檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂代謝的影響并探討其可能機(jī)制。方法：采用經(jīng)典的“雞尾酒”法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟，隨后用不同濃度的檳榔堿(0、25、50、100 μmol/L)處理成熟脂肪細(xì)胞72 h。72 h后，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的活性；油紅 O 染色觀察胞漿內(nèi)脂滴情況；Western blot檢測(cè)脂肪酸合成酶(FAS)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表達(dá)。結(jié)果：誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量脂滴；MTT顯示：0～100 μmol/L檳榔堿對(duì)脂肪細(xì)胞活力無(wú)顯著影響；油紅O染色后脂質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果表明檳榔堿能減少成熟脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)含量；Western blot結(jié)果顯示：與0 μmol/L組(對(duì)照組)相比，檳榔堿可顯著降低脂肪細(xì)胞內(nèi)FAS的蛋白表達(dá)，增加ATGL和HSL的蛋白表達(dá)；其中以50 μmol/L組最為顯著。結(jié)論：檳榔堿使脂肪細(xì)胞脂解增強(qiáng)，可能與降低脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶FAS的表達(dá)，增加脂質(zhì)分解代謝關(guān)鍵酶ATGL和HSL的表達(dá)有關(guān)。

檳榔堿；3T3-L1脂肪細(xì)胞；脂代謝

【DOI】 10.12047/j.cjap.5355.2017.005

脂肪細(xì)胞是體內(nèi)重要的能量?jī)?chǔ)存庫(kù)，目前認(rèn)為脂肪細(xì)胞的代謝異常與多種疾病相關(guān)，如肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等[1]。因此，脂肪細(xì)胞正成為治療肥胖等代謝性疾病的藥物靶點(diǎn)。檳榔堿是從天然植物檳榔中提取的生物堿，具有殺菌、促消化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2-4]。流行病學(xué)研究表明咀嚼檳榔與口腔癌及2型糖尿病和代謝綜合癥的發(fā)生有

關(guān)[3-7]，本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：檳榔堿可改善2型糖尿病SD大鼠的糖、脂代謝紊亂和胰島素抵抗，降低高糖環(huán)境對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化[8-10]。提示檳榔堿與2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但檳榔堿是否參與脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝，目前尚不清楚。因此，本研究以成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響并探討其作用機(jī)制，從而在細(xì)胞水平上為檳榔堿改善糖尿病以及肥胖患者的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC 公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，檳榔堿、地塞米松(dexamethasone, Dex) 、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine, IBMX) 、胰島素、MTT和 油紅 O染料均購(gòu)于Sigma公司，蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物公司；抗FAS、ATGL和HSL抗體購(gòu)于細(xì)胞信號(hào)公司。

1.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

用含10%新生小牛血清的L-DMEM，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后2 d(第0天) 時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)分化，將培養(yǎng)液換成含10%胎牛血清、0.5 mmol/L IBMX 、10 μg/ml 胰島素、1.0 μmol/L Dex的L-DMEM刺激，2 d后撤去IBMX和地塞米松等誘導(dǎo)劑，換用只含10 μg/ml胰島素、10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)2 d，之后每2天換用含10%胎牛血清的L-DMEM，至第9天90%3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，倒置顯微鏡拍照。

1.3 MTT檢測(cè)檳榔堿對(duì)脂肪細(xì)胞活性的影響

將 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔體積150 μl，按1.2方法將細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟，隨后加入不同濃度的檳榔堿(0、25、50、100 μmol/L)處理72 h，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液倒盡吸干，每孔加入150 μl DMSO，37℃振蕩15 min，使結(jié)晶溶解后用于比色。在酶標(biāo)儀上選擇570 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光密度值。

1.4 油紅O染色及脂質(zhì)含量測(cè)定

采用不同濃度的檳榔堿(0、25、50、100 μmol/L)處理分化成熟的脂肪細(xì)胞72 h，隨后進(jìn)行油紅O染色，拍照，異丙醇裂解細(xì)胞后通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)脂滴著色程度進(jìn)行比色，570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，定量分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量。

1.5 Western blot檢測(cè)脂肪細(xì)胞FAS, ATGL和HSL蛋白的表達(dá)

不同濃度的檳榔堿處理分化成熟的脂肪細(xì)胞72 h后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次，倒盡殘留PBS，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液70～100 μl，置冰上裂解5～10 min，待細(xì)胞樣品完全破碎后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液移至準(zhǔn)備好的 1.5 ml的EP管中，冰上超聲20～30 s以剪切基因組DNA，4℃，12,000/min離心10 min,取上清，采用BCA比色法進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣品30 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)抗體孵育，洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞

誘導(dǎo)分化前3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，呈梭形，胞漿中無(wú)脂滴；至誘導(dǎo)分化第9天時(shí)，95%的3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞漿豐富，大量的體積較大的脂滴分布于細(xì)胞核周?chē)?，形成“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)，即為典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)(圖1)。

Fig. 1 Morphology of 3T3-L1 preadipocyte (A)and adipocyte (B)

2.2 檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞活性的影響

為明確檳榔堿是否影響成熟脂肪細(xì)胞的活性，我們用不同濃度的檳榔堿(0、25、50、100 μmol/L)處理細(xì)胞72 h，并用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示：不同濃度的檳榔堿對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著影響(表1)。

GroupRelativesurvivalrate(%)Control100±3.725μmol/L90±4.250μmol/L93±3.5100μmol/L88±4.8

2.3 檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂質(zhì)含量的影響

油紅O染色后異丙醇裂解細(xì)胞進(jìn)行OD值測(cè)定，結(jié)果顯示：對(duì)照組相比，不同濃度的檳榔堿組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著降低，其中50 μmol/L組降低最明顯，提示檳榔堿可抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚(圖2，表2)。

Fig. 2 Effects of arecoline on lipid content in 3T3-L1 adipocytes (oil red O staining, ×10) 1: Control group (0 μmol/L arecoline group); 2: 25 μmol/L arecoline group; 3: 50 μmol/L arecoline group; 4: 100 μmol/L arecoline group

GroupLipidContentControl100±4.325μmol/L43±3.8**50μmol/L11±2.6**100μmol/L21±2.9**

**P<0.01vscontrol group

2.4 檳榔堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞FAS, ATGL和HSL蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，25、50和100 μmol/L檳榔堿處理組可使FAS蛋白表達(dá)分別降低15.7%、46.2%和27.6%；使ATGL蛋白表達(dá)分別增加31.5%、99.2%和41.6%；使HSL總蛋白表達(dá)分別增加43.7%、81.8%和31.5%(圖3)。

3 討論

脂肪組織的脂質(zhì)代謝包括脂肪酸的合成和甘油三酯的水解。脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪細(xì)胞脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，能催化細(xì)胞以乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A為底物合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，內(nèi)源性脂肪酸以甘油三酯的形式儲(chǔ)存于細(xì)胞。FAS主要與細(xì)胞內(nèi)源性脂肪合成相關(guān)，參與脂肪細(xì)胞的分化，在脂肪細(xì)胞從纖維母細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程的后期高表達(dá)，與脂肪細(xì)胞中脂滴的形成密切相關(guān)。而甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)是水解甘油三酯和甘油二酯的主要水解酶，占白色脂肪組織中脂解酶活性的95%[12]。

本實(shí)驗(yàn)中，油紅O染色和脂質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示：檳榔堿可降低成熟脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的含量。在脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝過(guò)程中，內(nèi)源性脂肪酸的合成過(guò)程包括如下幾個(gè)步驟：(1)乙酰-CoA 在乙酰-CoA 羧化酶的催化下縮合成丙二酸單酰-CoA；(2)乙酰-CoA 與縮合成的丙二酸單酰-CoA 在FAS的催化下經(jīng)過(guò)縮合、還原、脫水、再還原的循環(huán)反應(yīng)過(guò)程，每循環(huán)一次增加兩個(gè)碳原子，最終合成長(zhǎng)鏈脂肪酸。在上述合成過(guò)程中FAS是合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶，當(dāng)FAS酶活性高時(shí)，機(jī)體合成大量的脂肪酸，脂肪酸與甘油酯化，形成脂肪，過(guò)量的脂肪在體內(nèi)蓄積，從而導(dǎo)致肥胖。因此，降低FAS酶活性可以減少脂肪合成。此外，當(dāng)在小鼠中樞神經(jīng)注射FAS的抑制劑C75后，小鼠食欲降低，脂肪酸氧化增加，小鼠體內(nèi)脂肪組織含量減少[13，14]。由此可知，抑制FAS的表達(dá)可減少機(jī)體脂肪形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)檳榔堿可顯著降低分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中FAS的蛋白表達(dá)，表明檳榔堿通過(guò)降低FAS的表達(dá)從而抑制脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的合成，降低脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積。

另一方面，脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的含量與脂質(zhì)分解代謝有關(guān)，ATGL和HSL是脂肪組織中甘油三酯水解為甘油和游離脂肪酸的主要脂解酶。ATGL在白色脂肪組織中大量表達(dá)，主要水解白色脂肪組織中甘油三酯為甘油二酯和游離脂肪酸。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠小腸內(nèi)缺乏ATGL時(shí)，小腸中甘油三酯水解酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加[15]。因此，ATGL在維持機(jī)體脂質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。另一個(gè)脂肪水解的限速酶是HSL，主要在脂肪組織中表達(dá)，其次在腎上腺、睪丸、肌肉中少量表達(dá)。研究顯示在HSL基因敲除小鼠中，脂肪細(xì)胞對(duì)兒茶酚胺誘導(dǎo)的甘油釋放和脂肪酸減少敏感性明顯降低[16]。因此，ATGL和HSL在脂肪細(xì)胞脂質(zhì)水解中起著十分重要的作用。本研究結(jié)果顯示：檳榔堿可顯著增加分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中ATGL和HSL的蛋白表達(dá)水平，表明檳榔堿可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中甘油三酯的水解，從而減少甘油三酯的含量。

總之，本研究結(jié)果顯示：不同濃度的檳榔堿可減少分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的含量，其中50 μmol/L檳榔堿組效果最好。可能原因是低濃度的檳榔堿通過(guò)降低FAS蛋白表達(dá)、增加ATGL和HSL蛋白表達(dá)從而抑制脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的合成，降低脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積；高濃度的檳榔堿也許對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，從而改變基因表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制，需進(jìn)一步研究。由此可見(jiàn)，50 μmol/L檳榔堿可減少成熟脂肪細(xì)胞中甘油三酯的合成，減少脂質(zhì)的蓄積，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水解，進(jìn)一步降低脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積，從而抑制脂肪細(xì)胞的肥大。但是，正常脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的合成和分解維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，任何一方面失調(diào)均可引起相關(guān)的疾病。檳榔堿可使機(jī)體脂肪細(xì)胞脂肪酸合成減少，分解增加，使機(jī)體游離脂肪酸增加，這將有可能引起脂肪的異位沉積，從而降低代謝相關(guān)器官的胰島素敏感性。由于代謝綜合征是一個(gè)復(fù)雜的疾病，它的形成包括環(huán)境與遺傳因素的相互作用，聯(lián)系檳榔堿與代謝綜合征之間的機(jī)制并不能通過(guò)某一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)完全闡釋清楚。本結(jié)果僅僅只能說(shuō)明檳榔堿對(duì)脂肪細(xì)胞在脂肪形成和分解中的一部分作用。檳榔堿在肥胖和代謝綜合征中的作用還需進(jìn)一步研究。

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The effects of arecoline on the lipid metabolism of 3T3-L1 adipocytes

LING Hong-yan1, HE Juan1,2+, YANG Si-si1, ZHANG Kai-fang1, HE Jian-qin1, ZHU Ze-mei1， FENG Shui-dong3Δ

(1. Department of Physiology, University of South China, 2. Department of Physiology, Hunan Institute of Medicine, 3. Department of Social Medicine and Health Service Management, University of South China， Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of arecoline on lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes and explore its possible mechanisms. Methods: 3T3-L1 pre-adipocytes were induced into adipocytes with the classic“cocktail” method, subsequently, adipocytes were treated with arecoline at the concentrations of 0, 25, 50 and 100 μmol/L for 72 hours. After 72 hours, cell vability was measured with MTT method, lipid droplet accumulation in the cytoplasm was observed with oil red O staining, the protein expression of fatty acid synthase (FAS), adipose triglyceride lipase (ATGL) and hormone-sensitive lipase (HSL) were detected by Western blot assay. Results: There were a large number of lipid droplets in the cytoplasm in the differentiated 3T3-L1 adipocytes. MTT results showed that 0～100 μmol/L arecoline had no significant effect on cell vability; oil red O staining found arecoline reduced lipid amount in 3T3-L1 adipocytes; Western blot results showed that compared with 0 μmol/L arecoline group (the control group), arecoline significantly reduced the protein level of FAS and increased the protein levels of ATGL and HSL, and 50 μmol/L arecoline group was the most significant. Conclusion: Arecoline significantly increased lipolysis of 3T3-L1 adipocyte, which might be associated with decreased the FAS expression of key enzyme of lipid synthesis and increased the ATGL and HSL expression of key enzyme of adipolysis.

arecoline; 3T3-L1 adipocyte; lipid metabolism

教育部留學(xué)歸國(guó)基金(教外司留[2014]1685號(hào))；湖南省科技廳(2015JC3085)；南華大學(xué)留學(xué)歸國(guó)基金(2013XQD49)；南華大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(2015XCX36)

2015-09-22 【修回日期】2016-06-12

R332；R977.15

A

1000-6834(2017)01-022-04

△【通訊作者】Tel: 86-0734-8281621; E-mail: shuidong f@hotmail.com；#+： 并列第一作者