陳寶英，張英，黃勝超，顏澤銘，何敢

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心1、乳腺科2，廣東 湛江 524001)

FOXO1在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

陳寶英1，張英1，黃勝超2，顏澤銘2，何敢2

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心1、乳腺科2，廣東 湛江 524001)

目的 探討FOXO1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其臨床意義。方法選取2012年6月至2013年1月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織、乳腺良性病變組織分別50例、37例、20例，采用免疫組織化學(xué)法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測(cè)各組標(biāo)本的FOXO1蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果FOXO1蛋白在癌性組的染色陽(yáng)性率為46.0%，而在良性組和癌旁組中陽(yáng)性率分別為75.0%、70.2%；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，癌性組、癌旁組、良性組的FOXO1 mRNA表達(dá)量分別為(0.526±0.011)、(0.885±0.017)、(0.841±0.026)，F(xiàn)OXO1蛋白及FOXO1 mRNA在癌性組標(biāo)本中的表達(dá)均較癌旁組及良性組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌組織中FOXO1蛋白的表達(dá)及FOXO1 mRNA與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者絕經(jīng)狀態(tài)、年齡、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及Ki-67無(wú)關(guān)(P> 0.05)。結(jié)論FOXO1蛋白及mRNA的表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一。

乳腺癌；FOXO1；免疫組化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

FOXO1是具有潛在抗腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移的抑癌基因，它的表達(dá)缺失或下降與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。相關(guān)研究表明FOXO1在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和代謝等多種生理效應(yīng)中起重要作用。很多人類腫瘤，如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)腸癌、胃癌、甲狀腺癌等均發(fā)現(xiàn)FOXO1的表達(dá)缺失，并且與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-6]。而在乳腺癌中關(guān)于FOXO1的表達(dá)的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。本研究檢測(cè)乳腺癌組織中FOXO1的表達(dá)，探討FOXO1與乳腺癌的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6月至2013年1月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌標(biāo)本50例，癌旁乳腺組織標(biāo)本(病理證實(shí)無(wú)癌性病變的乳腺組織)37例，乳腺良性組織20例。所有乳腺癌患者均未接受任何化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療；乳腺良性病變的患者包括乳腺纖維腺瘤16例、纖維囊性乳腺病3例、乳腺腺病1例。50例乳腺癌患者年齡26～83歲，其中<50歲24例，≥50歲26例；乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌40例，浸潤(rùn)性小葉癌6例，乳腺黏液癌3例，混合型1例。乳腺癌分期根據(jù)2002年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：其中Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ期11例；27例患者腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移，23例患者腋窩淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑 兔抗人FOXO1單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒D9108B、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A均購(gòu)自大連寶生物工程公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè)FOXO1的表達(dá) 標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片；免疫組織化學(xué)SP染色按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。結(jié)果判斷采用IP評(píng)分[7-8]：①染色強(qiáng)度，細(xì)胞無(wú)染色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，染色細(xì)胞數(shù)< 10%：0分；染色細(xì)胞數(shù)10%～30%：1分；染色細(xì)胞數(shù)31%～60%：2分；染色細(xì)胞數(shù)>60%：3分。兩項(xiàng)乘積，計(jì)分>2分為陽(yáng)性，計(jì)分<2則為陰性。

1.3.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FOXO1 mRNA 在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed查找所需基因的序列，用Primer PREMIER5.0設(shè)計(jì)并篩選引物，到http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上將所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行同源性分析。設(shè)計(jì)引物FOXO1-F：5'-CCAGCCCAAA CTACCAAAAATA-3'和FOXO1-R：5'-GAGGAGAGTCAGAAGTCAGCAAC-3'。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度為165 bp。PCR的主要步驟：95℃5 s，60℃30 s，40 cycles；95℃5 s，60℃ 1 min，95℃1 cycle，50℃30 s。結(jié)果計(jì)算采用目前常用的2-ΔΔCt方法來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXO1蛋白的表達(dá)情況 FOXO1蛋白主要表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)，F(xiàn)OXO1蛋白在乳腺癌組織中的染色陽(yáng)性率為46.0%(23/50)，而在乳腺良性病變和癌旁乳腺組織中陽(yáng)性率分別為75.0%(15/20)、70.3% (26/37)。FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與在乳腺良性病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；FOXO1蛋白在乳腺癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)與在乳腺良性病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，見(jiàn)圖1。

圖1 FOXO1蛋白在不同乳腺組織中的表達(dá)(免疫組化SP法)

2.2 FOXO1表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系 FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腫瘤直徑大于2 cm較小于2 cm、腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移較無(wú)轉(zhuǎn)移、晚期較早期的乳腺癌組織中FOXO1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低；FOXO1蛋白表達(dá)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、Ki-67表達(dá)無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 FOXO1 mRNA的表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，癌性組、癌旁組、良性組的FOXO1 mRNA表達(dá)量(lg△Ct)分別為(0.526±0.011)、(0.885±0.017)、(0.841± 0.026)，F(xiàn)OXO1 mRNA在乳腺癌癌性組表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 FOXO1 mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 RT-PCR顯示，F(xiàn)OXO1 mRNA在早期、腫瘤直徑小、不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中FOXO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)；不同絕經(jīng)狀態(tài)、不同年齡階段及不同Her-2、ER、PR、Ki-67的乳腺癌組中FOXO1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表1。

表1 FOXO1蛋白表達(dá)及FOXO1 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 不同組別FOXO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

乳腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居女性腫瘤的首位，且發(fā)病年齡呈年輕化，女性一生中患乳腺癌的概率為10%，每年約50萬(wàn)人死于該病并以2%～3%的速度逐年遞增[9-12]。而針對(duì)乳腺癌的治療主要采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等治療方法，雖然可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的比率仍較高[13-14]。因此研究尋找乳腺癌的早期診斷指標(biāo)和治療的新靶點(diǎn)任重而道遠(yuǎn)。

FOXO作為Forkhead轉(zhuǎn)錄因子大家族最重要的一個(gè)亞群，廣泛表達(dá)于人體的各種正常組織中[15]。FOXO亞群由FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6四個(gè)成員組成[16]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子參與許多生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、糖代謝、細(xì)胞分化和發(fā)展、腫瘤抑制等。環(huán)境條件的變化如生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、氧化應(yīng)激和照射，可以調(diào)節(jié)FOXO蛋白的活動(dòng)，從而確保在細(xì)胞中的特異轉(zhuǎn)錄程序。人體內(nèi)通過(guò)翻譯后修飾如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、亞細(xì)胞定位，以及直接的蛋白質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)FOXO的活動(dòng)[17]。近來(lái)的研究證實(shí)了FOXO是PI3k/Akt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)基因，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4，其中自噬活性因子FOXO1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。而p53與FOXO具有相似的靶基因,提示這兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能起協(xié)同作用抑制腫瘤的發(fā)生[19]。此外，F(xiàn)OXO與SMAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合體，通過(guò)上調(diào)p21的表達(dá),引起細(xì)胞周期G1期停止[20]。因此重新激活FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活性可能成為治療這類腫瘤的一種新策略[21]。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及RT-PCR法檢測(cè)乳腺癌組織、乳腺良性病變組織、癌旁乳腺組織中FOXO1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于乳腺良性病變和癌旁乳腺組織的陽(yáng)性表達(dá)率(P<0.05)，而乳腺良性病變與癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1 mRNA在乳腺癌組織中呈低表達(dá)水平，僅為癌旁正常組的0.397倍，與正常組織及癌旁組織比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。而FOXO1 mRNA在乳腺良性病變組織中表達(dá)減少不顯著，而乳腺良性病變組織及正常組織相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示FOXO1可能參與乳腺癌的發(fā)病過(guò)程，但FOXO1參與乳腺癌發(fā)病過(guò)程的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)分析FOXO1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FOXO1蛋白在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腫瘤直徑大于2 cm較小于2 cm、腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移較無(wú)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中FOXO1蛋白陽(yáng)性率低；FOXO1蛋白表達(dá)與絕經(jīng)狀態(tài)、年齡、臨床分期、Herb-2、ER、PR、Ki67表達(dá)無(wú)關(guān)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXO1 mRNA的表達(dá)與絕經(jīng)狀態(tài)、年齡、Her-2、ER、PR、Ki-67差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而腫瘤直徑大于2 cm較小于2 cm表達(dá)強(qiáng)度顯著減少(P<0.05)，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織表達(dá)強(qiáng)度明顯減少(P<0.05)；TNM分期早期的乳腺癌組織中FOXO1 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。腫瘤的大小及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，F(xiàn)OXO1蛋白及mRNA的表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FOXO1可能與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，但能否成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)尚需要大量的深入研究。

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Expression of FOXO1 gene in breast carcinoma and its clinical significance.

CHEN Bao-ying1,ZHANG Ying1, HUANG Sheng-chao2,YAN Ze-ming2,He-gan2.Department of Oncology1,Department of Breast Surgery2,Affiliated Hospitalof Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the occurrence and development of FOXO1 gene process and its clinical significance in breastcarcinoma.MethodsThe protein and mRNAexpression of FOXO1 gene were detected in 50 cases of breastcarcinoma,20 cases of benign breastlesion and 37 cases of adjacentnormalbreasttissue by an immunohistochemical method(steptavidin peroxidase,SP)and fluorescence-based real-time reverse transcription PCR(RT-PCR). These tissue samples were taken from the patients who admitted to the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College from June 2012 to January 2013.ResultsThe positive rate of FOXO1 protein in the cancer group was 46.0%, while the positive rates in the benign group and the adjacent group were respectively 75.0%and 70.2%.The results of RT-PCR showed that the expression of FOXO1 mRNA in the cancer group,the adjacent cancer group and the benign group were(0.526±0.011),(0.885±0.017),(0.841±0.026),respectively;the protein and mRNA expression of FOXO1 gene in the cancer group were significantly lower than those in the adjacent cancer group and benign group(P<0.05). The protein and mRNAexpression of FOXO1 gene was associated with tumor size,lymph node metastasis(P<0.05),but ithad no relationship with menopausalstatus,age,HER2 receptor protein(HER2),estrogen receptor(ER),progesterone receptor(PR),Ki67(P>0.05).ConclusionThe protein and mRNA expression of FOXO1 gene is associated with tumor size and axillary lymph node metastasis,which means that FOXO1 can be used as one of the biologicalparameters to determine the prognosis of breastcarcinoma.

Breastcarcinoma;FOXO1;Immunohistochemistry;Real-time quantitative PCR

R737.9

A

1003—6350（2017）09—1383—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.003

2016-10-03)

陳寶英。E-mail：xgjrwk@163.com