趙 婧， 蘇占海， 劉永年， 汪曉洲， 楊應(yīng)忠, 3, 4, 5△

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 2青海省心腦血管病專科醫(yī)院內(nèi)科, 3青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心, 4青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 5青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001)

應(yīng)用TMT結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選高原紅細(xì)胞增多癥患者血漿差異表達(dá)蛋白*

趙 婧1， 蘇占海1， 劉永年1， 汪曉洲2， 楊應(yīng)忠1, 3, 4, 5△

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,2青海省心腦血管病?？漆t(yī)院內(nèi)科,3青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心,4青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,5青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001)

目的： 應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)比較高原紅細(xì)胞增多癥(HAPC)患者和健康對(duì)照者血漿中的差異表達(dá)蛋白。方法: 收集HAPC患者血漿4例，與之相匹配的健康對(duì)照組血漿5例，組內(nèi)等量混合后利用多重免疫親和層析柱去除14種高豐度蛋白，TMT試劑標(biāo)記后樣本進(jìn)行液相色譜分離，采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜鑒定及相對(duì)定量；獲取HAPC患者和健康對(duì)照血漿各20例，ELISA方法驗(yàn)證部分篩選的差異蛋白。結(jié)果: 共鑒定和定量了1 094種蛋白，差異表達(dá)的蛋白有249種，其中HAPC組較健康對(duì)照組表達(dá)量≥1.5倍的上調(diào)蛋白質(zhì)有162種，表達(dá)量≤67%的下調(diào)蛋白質(zhì)有87種；C反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白A在HAPC組中較健康對(duì)照組表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論: 篩選出多種與炎癥相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，為深入研究HAPC發(fā)生機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。

高原紅細(xì)胞增多癥； 串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽； 質(zhì)譜

高原紅細(xì)胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是指長(zhǎng)期生活在海拔2 500 m以上高原的世居者或移居者，對(duì)高原低氧環(huán)境逐漸失去習(xí)服而導(dǎo)致的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為血液紅細(xì)胞過(guò)度增多，是最常見(jiàn)的一種慢性高原病。由于紅細(xì)胞過(guò)度增多，血液黏滯度異常增高，微循環(huán)障礙產(chǎn)生，組織嚴(yán)重缺氧，易導(dǎo)致血栓形成或局部組織壞死等并發(fā)癥[1]。目前，HAPC發(fā)病機(jī)制仍不清楚，學(xué)者們提出是遺傳因素和高海拔環(huán)境因素相互作用的共同結(jié)果，具有遺傳易感性，并且遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中起決定性作用[2-3]，雖然已為HAPC分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，卻不能全面系統(tǒng)地闡述其內(nèi)在的各種關(guān)聯(lián)，且HAPC易感者缺乏早期有效的診斷方式和生物標(biāo)記物。進(jìn)一步深入研究HAPC的發(fā)病機(jī)制，對(duì)在高原人群中早期預(yù)防和治療HAPC具有至關(guān)重要的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為研究疾病發(fā)病機(jī)制、尋找適宜的生物標(biāo)志物提供了可能[4]。液相色譜質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白和肽段的分離鑒定發(fā)展迅速，它能夠避免基于凝膠的雙向電泳技術(shù)對(duì)蛋白分離范圍有限及人為誤差較大等的不足。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags，TMT)是一種同量異序化學(xué)標(biāo)簽，是通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)不同樣品中的蛋白進(jìn)行同時(shí)鑒定和定量的有力工具。本研究旨在應(yīng)用TMT結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選HAPC病人與健康對(duì)照間的血漿差異表達(dá)蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩出在HAPC中起調(diào)控作用的重要差異蛋白，并進(jìn)一步探索它們?cè)贖APC發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

1.1 研究對(duì)象納入/排除標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)2004年第六屆國(guó)際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會(huì)制定的《慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]和我國(guó)高原病命名、分型及診斷標(biāo)準(zhǔn)(1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第三次全國(guó)高原醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)推薦稿)[6]。制定HAPC納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)居住海拔3 000 m以上高原，已連續(xù)居住≥5年，病程呈慢性經(jīng)過(guò)；(2)臨床表現(xiàn)主要是頭痛、頭暈、乏力、睡眠障礙、紫紺、結(jié)膜充血、皮膚紫紅等多血癥病狀；(3) 具以下3項(xiàng)血液學(xué)參數(shù)： 紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)≥6.5×1012/L，血紅蛋白(hemoglobin, Hb)≥200 g/L，紅細(xì)胞壓積(hematocrit, Hct)≥65%；(4)除外真性紅細(xì)胞增多癥和其它繼發(fā)性紅細(xì)胞增多；(5)轉(zhuǎn)至海拔低處，癥狀減輕，病情逐漸好轉(zhuǎn)，RBC、Hb和Hct逐漸降低；(6)經(jīng)過(guò)體檢，肝腎功能、心電圖、胸片、腹部超聲等檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)異常者；(7)近期無(wú)外傷及手術(shù)病史，無(wú)發(fā)熱、炎癥及其它可能影響檢測(cè)結(jié)果的情況。高原健康對(duì)照納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)居住海拔3 000 m以上高原，已連續(xù)居住≥5年；(2)Hb在150～190 g/L；(3)無(wú)疾病史，經(jīng)過(guò)體檢，肝腎功、心電圖、胸片、腹部超聲等檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)異常者；(4)近期無(wú)外傷及手術(shù)病史，無(wú)發(fā)熱、炎癥及其他可能影響檢測(cè)結(jié)果的情況。

1.2 研究對(duì)象來(lái)源 HAPC患者(HAPC patient，HAPC-P)組20例病人(蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)部分僅選取4例，ELISA實(shí)驗(yàn)部分20例)來(lái)自2015年11月～2016年5月在青海省心腦血管病?？漆t(yī)院住院的漢族男性患者，均長(zhǎng)期居住于海拔3 000 m以上地區(qū)，Hb > 210 g/L，均無(wú)吸煙史，無(wú)慢性肺部疾病，無(wú)慢性呼吸功能紊亂或某些慢性病變而引起的低氧血癥，無(wú)發(fā)熱、炎癥及其它影響檢測(cè)結(jié)果的情況。健康對(duì)照(HAPC-control，HAPC-C)組入選的20例漢族男性(蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)部分僅選取5例，ELISA實(shí)驗(yàn)部分20例)來(lái)自2016年4月青海省人民醫(yī)院體檢中心，均長(zhǎng)期居住于海拔3 000 m以上地區(qū)，無(wú)吸煙史，體檢結(jié)果健康，無(wú)疾病。所有樣本采集均獲得本人和家屬的知情同意。為排除性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，所有研究對(duì)象均為男性，HAPC-P組平均年齡49.75±18.08，HAPC-C組平均年齡46.25±4.27，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 主要試劑和儀器

人血漿高豐度蛋白去除試劑盒(Agilent)；BCA定量試劑盒和TMT Isobaric Mass Tagging Kit(Pierce)；考馬斯亮蘭 R-250(北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)；人C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒和人血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。質(zhì)譜儀(Agilent)；高效液相色譜儀(Thermo Scientific)；真空濃縮儀(Eppendorf)；連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

3 主要方法

3.1 血漿樣本的采集 所有對(duì)象禁食12 h，其中HAPC疾病組病人未給予治療，于次日清晨采肘靜脈血5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血漿分裝后于-80 ℃冰箱保存。

3.2 去除血漿高豐度蛋白 使用人血漿高豐度蛋白去除試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作步驟去除血漿內(nèi)14種高豐度蛋白。去除高豐度蛋白后，按照BCA定量試劑盒說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品。使用酶標(biāo)儀測(cè)562 nm吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度。根據(jù)測(cè)定的濃度每組取100 μg蛋白分裝，同時(shí)取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE以檢測(cè)血漿樣本去除高豐度蛋白效果，濃縮膠電壓80 V持續(xù)40 min，分離膠電壓120 V持續(xù)120 min，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色至條帶清晰。

3.3 TMT標(biāo)記全蛋白 各取100 μg低豐度蛋白樣品，加入尿素、0.1% SDS和三乙基碳酸氫銨(TEAB， triethylammonium bicarbonate),再加LC-MS級(jí)超純水至體積100 μL，置于冰上。加入5 μL TCEP，于55 ℃恒溫振蕩金屬浴中，700 r/min反應(yīng)1 h。然后加入5 μL碘乙酰胺，于25 ℃恒溫振蕩金屬浴中700 r/min避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束加入660 μL丙酮，-20 ℃下沉淀過(guò)夜后4 ℃下10 000 r/min離心10 min后移去丙酮，室溫條件下沉淀風(fēng)干。取100 μL TEAB溶解沉淀蛋白，加入胰酶于37 ℃搖床中振蕩酶切過(guò)夜。TMT標(biāo)記使用試劑盒TMT Isobaric Mass Tagging Kit，取41 μL乙腈加入至 0.8 mg TMT10標(biāo)記試劑中，渦旋振蕩充分溶解。過(guò)夜酶切樣品離心后取上清，加入41 μL TMT10 標(biāo)記試劑，于25 ℃恒溫振蕩金屬浴中，700 r/min反應(yīng)2 h(HAPC-P組和HAPC-C組分別用TMT10-129C和TMT10-129N標(biāo)記)后加入8 μL 5%羥氨以終止標(biāo)記反應(yīng)，然后混合標(biāo)記后的樣品用于C18色譜柱分級(jí)。

3.4 C18色譜柱樣品分級(jí) 配制 C18 色譜緩沖液A液(2%乙腈和98%水，pH=10)和B液(90%乙腈和10%水，pH=10)。用A液平衡C18色譜柱 25 min，運(yùn)行多肽測(cè)試品確認(rèn)Ultimate 3000 high-performance liquid chromatography系統(tǒng)和色譜柱狀態(tài)良好。將合并的TMT標(biāo)記后樣品于45 ℃使用真空濃縮液真空濃縮抽干，加入 A 液溶解，使用 5% MS 級(jí)氨水調(diào)節(jié) pH 值至10。室溫下 10 000 r/min 離心 5 min，取上清進(jìn)樣。收集2～15 min 的流出液以及24～63 min 的分級(jí)組分，用1.5 mL Eppendorf離心管每分鐘收集1管組分。根據(jù)色譜圖各時(shí)間收樣的峰面積進(jìn)行雙收樣合并，共形成20個(gè)峰面積近似的分級(jí)組分，于45 ℃真空濃縮抽干。

3.5 質(zhì)譜相對(duì)定量檢測(cè) 配制液相色譜A液(99.9%水和0.1%甲酸)和 B 液(99.9%乙腈和0.1%甲酸)。分別取分級(jí)后的抽干樣品加入上樣緩沖液(96%水、4%乙腈和0.1%甲酸)充分溶解，室溫下10 000 r/mim 離心5 min，取約含1 μg 蛋白的上清進(jìn)樣到液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC系統(tǒng)和Q Exactive 質(zhì)譜儀)進(jìn)行樣品檢測(cè)。質(zhì)譜全掃描范圍 m/z350-1 600，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000(400 m/z 處)，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為 35 000(400 m/z處)，并選擇全掃描中離子強(qiáng)度 TOP 20 的母離子使用 higher-energy collsional dissociation方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜序列測(cè)定，生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)。

3.6 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理 從NCBI下載人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。將生成的質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)使用 Proteome Discoverer軟件在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜庫(kù)計(jì)算分析。選用胰酶特異性酶切，最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)，設(shè)定 Cys碘乙?；蚑MT10修飾為固定修飾參數(shù)，設(shè)定甲硫氨酸氧化為可變修飾參數(shù)，母離子質(zhì)量允差0.0015%，子離子質(zhì)量允差為0.02 Da。選擇低于1%假陽(yáng)性率(false positive rates，F(xiàn)PR)條件下高度可信的多肽作為蛋白質(zhì)定性鑒定的過(guò)濾參數(shù)，選擇特異性多肽用于不同樣品間蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析。本實(shí)驗(yàn)中差異蛋白質(zhì)確定標(biāo)準(zhǔn)為: 差異倍數(shù)≥1.5或≤67%。

對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)，使用PD軟件與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)計(jì)算分析，對(duì)搜庫(kù)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，保留可靠的多肽和蛋白。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，篩選差異蛋白，對(duì)所有差異蛋白應(yīng)用基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)按照其生物學(xué)功能及在機(jī)體內(nèi)參與的生理學(xué)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行GO分類(lèi)，對(duì)其生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)進(jìn)行分析。

3.7 ELISA驗(yàn)證結(jié)果 選取差異蛋白C反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白A，采用ELISA法按照說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)二者在HAPC-P組與HAPC-C組血漿中的含量。

結(jié) 果

1 去除高豐度蛋白效果

應(yīng)用SDS-PAGE檢驗(yàn)兩組樣品高豐度蛋白去除效果，考馬斯亮藍(lán)染色后對(duì)比原血漿和去除高豐度蛋白樣品電泳條帶發(fā)現(xiàn)血漿中高豐度蛋白去除效果良好，低豐度蛋白樣品蛋白條帶清晰、豐富，蛋白量多，樣品間蛋白均一性較一致，表明低豐度蛋白得到有效富集,見(jiàn)圖1。

Figure 1.The results of SDS-PAGE of plasma after removal of high-abundance proteins. M: marker; A: high-abundance proteins in HAPC-P group; B: low-abundance proteins in HAPC-P group; C: low-abundance proteins in HAPC-C group; D: high-abundance proteins in HAPC-C group.

圖1 HAPC-P組與HAPC-C組原血漿和去除高豐度蛋白后血漿SDS-PAGE結(jié)果

2 生物學(xué)功能分析

從質(zhì)譜結(jié)果看，在1% FPR的條件下，共鑒定和定量了1 094種蛋白，其中差異表達(dá)的蛋白有249種，其中HAPC組較正常組上調(diào)蛋白162種，下調(diào)蛋白87種，其中共篩選出19種炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白。本研究對(duì)249種通過(guò)鑒定的蛋白進(jìn)行GO分類(lèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞組分方面，這些蛋白主要位于細(xì)胞外囊泡；在生物學(xué)過(guò)程方面，這些蛋白主要參與抗原加工等生物學(xué)過(guò)程；在分子功能方面，這些差異蛋白主要涉及酶活性、抗氧化活性等方面,見(jiàn)圖2。

Figure 2.Gene ontology of differential proteins. A: cellular component, top 10; B: biological process, top 10; C: molecular function, top 10.

圖2 差異蛋白的GO分類(lèi)

3 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路的富集分析結(jié)果

將篩選出的249種蛋白在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)中找出這些差異蛋白間的互作關(guān)系。對(duì)篩選出的差異蛋白CRP、脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)、SAA與促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-15、IL-16、MCP-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrotic factor-α，TNF-α)間的蛋白相互作用進(jìn)行了分析。進(jìn)一步對(duì)參與各類(lèi)生物過(guò)程的蛋白進(jìn)行富集分析,結(jié)果匹配到114條KEGG通路，顯著富集的前10條通路見(jiàn)表1。

表1 KEGG途徑富集分析

Term: the describtion of pathway; ID: the number of pathway.

4 ELISA檢測(cè)結(jié)果

采取ELISA檢測(cè)了CRP和SAA在HAPC-P組和HAPC-C組血漿中的含量。結(jié)果顯示血漿CRP水平和SAA水平在HAPC-P組均上調(diào)，較HAPC-C組明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 HAPC-P組與HAPC-C組血漿CRP和SAA含量

Table 2.Plasma contentrations of CRP and SAA in HAPC-P group and HAPC-C group (n=20)

ProteinGroupMedian(mg/L)Interquartilerange(mg/L)PCRPHAPC-C2.9114.170.003HAPC-P17.34243.69SAAHAPC-C0.460.780.01HAPC-P1.082.78

討 論

TMT是一種同量異序化學(xué)標(biāo)簽，是通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)不同樣品中的蛋白進(jìn)行同時(shí)鑒定和定量的有力工具。近年來(lái)，基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組學(xué)領(lǐng)域受到了越來(lái)越多的關(guān)注，這種方法包括胰酶酶解多肽的標(biāo)記及質(zhì)譜鑒定、分析2個(gè)部分。由于標(biāo)記效率極高，幾乎可以在所有多肽的末端進(jìn)行標(biāo)記，故提供了定量分析基礎(chǔ)，同時(shí)這種標(biāo)記方法在肽類(lèi)水平上的標(biāo)記要比其它化學(xué)標(biāo)記方法更為有效，已廣泛應(yīng)用于研究疾病發(fā)病機(jī)制、尋找適宜的生物標(biāo)志物等方面。本研究旨在應(yīng)用TMT結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選HAPC病人與健康對(duì)照間的血漿差異表達(dá)蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩出在HAPC中起調(diào)控作用的重要差異蛋白，并進(jìn)一步探索它們?cè)贖APC發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

HAPC主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞過(guò)度增多，血液黏滯度異常增高、微循環(huán)障礙，組織嚴(yán)重缺氧，易導(dǎo)致血栓形成或局部組織壞死等并發(fā)癥[1]。HAPC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，公認(rèn)與HAPC發(fā)生有關(guān)的有缺氧誘導(dǎo)因子-促紅細(xì)胞生成素途徑：缺氧環(huán)境下，腎臟及腎外低氧感受器受到低氧刺激，通過(guò)HIF-1α途徑加速腎臟分泌EPO，進(jìn)而與骨髓內(nèi)干細(xì)胞EPO受體結(jié)合引起紅系增殖，增高血液中的紅細(xì)胞數(shù)量[7]。流行病學(xué)調(diào)查表明HAPC男性的發(fā)病率明顯高于女性，同時(shí)青年人顯著高于老人和兒童，提示雄激素在HAPC發(fā)病中有重要作用：雄激素與其特異的AR結(jié)合，促進(jìn)腎臟紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，刺激紅細(xì)胞的生成[8]，進(jìn)一步發(fā)展成為HAPC。

目前，越來(lái)越多的學(xué)者研究表明炎癥因子在高原病的發(fā)病中起到了重要作用：高原缺氧環(huán)境中，內(nèi)毒素、TNF-α等誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子IL-1、IL-6、IL-8和抗炎因子IL-10 增多，加速了骨髓造血干細(xì)胞增殖，促使紅細(xì)胞過(guò)度增生，血液黏稠、流動(dòng)阻滯，加重全身多臟器血流負(fù)擔(dān)，進(jìn)而引發(fā)如損傷微循環(huán)、部分細(xì)胞死亡及免疫功能調(diào)節(jié)紊亂等慢性炎癥反應(yīng)[1,9]。Nizet等[10]的研究顯示，低氧可影響和啟動(dòng)炎癥免疫反應(yīng)；Kubo等[11]的研究發(fā)現(xiàn)高原肺水腫(high-altitude pulmonary edema，HAPE)患者的支氣管肺泡灌洗液中IL-1、IL-6、CRP、TNF-α等炎性標(biāo)志物明顯增多；Zhou等[12]在實(shí)驗(yàn)研究中模擬高原急性暴露發(fā)現(xiàn)大鼠血管通透性和腦含水量顯著增高，腦組織中TNF-α、NO等炎癥介質(zhì)隨著海拔的增加而增加。學(xué)者們對(duì)HAPC與炎癥因子間的關(guān)系也進(jìn)行了研究：于前進(jìn)等[13]應(yīng)用蛋白芯片檢測(cè)HAPC患者血清中40種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HAPC患者血清 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-15、IL-16、MCP-1和TNF-α表達(dá)水平均顯著增高；Li等[7]的研究顯示高原低氧上調(diào)IL-3和IL-6，促進(jìn)造血干細(xì)胞選擇性向紅系分化，進(jìn)而誘導(dǎo)紅細(xì)胞增生。

本課題組應(yīng)用TMT結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)HAPC患者的血漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，較其他學(xué)者的研究而言，本實(shí)驗(yàn)鑒定出的差異表達(dá)蛋白更廣更全，相關(guān)資料沒(méi)有在本文一一陳列，讀者可以向作者索要。本實(shí)驗(yàn)中共鑒定和定量了1 094種蛋白，其中差異表達(dá)的蛋白有249種，其中HAPC組較健康對(duì)照組表達(dá)量上調(diào)的蛋白有162種，表達(dá)量下調(diào)的蛋白有87種，其中又篩選出19種差異表達(dá)的與炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白；結(jié)合GO功能分類(lèi)中差異蛋白主要參與抗原加工等生物學(xué)過(guò)程、KEGG通路中抗原加工通路顯著富集，發(fā)現(xiàn)亞油酸代謝、花生四烯酸代謝等涉及炎癥免疫反應(yīng)的通路發(fā)生變化，且差異表達(dá)蛋白中CRP、SAA、LBP等炎性免疫蛋白差異倍數(shù)大、特異性多肽數(shù)量高，并且ELISA方法驗(yàn)證結(jié)果顯示CRP和SAA在血漿中的含量均在HAPC組中上調(diào)，表達(dá)量高于健康對(duì)照組，由此我們推測(cè)HAPC的發(fā)生中炎性因子有重要作用。單獨(dú)蛋白通過(guò)彼此之間的相互作用構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來(lái)參與生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，所以我們將篩選出的3個(gè)蛋白CRP、LBP、SAA與其他學(xué)者報(bào)道研究過(guò)的與HAPC發(fā)生有關(guān)的因子，在 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中找出它們之間的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)除CRP以外各因子間互相密切作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。

機(jī)體組織器官長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)，發(fā)生能量代謝障礙致使細(xì)胞內(nèi)氧自由基生產(chǎn)增加，使細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、乳酸(lactic acid，LA)、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)活性增加，破壞機(jī)體內(nèi)平衡而引發(fā)或加重細(xì)胞炎癥反應(yīng)，致使紅細(xì)胞發(fā)生水腫、變性、溶解、凋亡等炎癥反應(yīng)[12,14]，在高原缺氧環(huán)境中HAPC患者機(jī)體炎癥細(xì)胞因子可能存在多途徑相互作用調(diào)控人體組織細(xì)胞，以適應(yīng)高原缺氧環(huán)境，且又在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)或介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本文中我們對(duì)篩選出3種炎性因子CRP、SAA和LBP分別進(jìn)行分析討論。

CRP由5個(gè)完全相同的非糖基化的亞單位非共價(jià)聯(lián)結(jié),每個(gè)亞單位相對(duì)分子質(zhì)量 23 017,由 206個(gè)氨基酸殘基組成。CRP基因位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂,基因組長(zhǎng)215 kb,有2個(gè)外顯子,中間由1個(gè)內(nèi)含子隔開(kāi),編碼206個(gè)氨基酸殘基。CRP可以抑制骨髓源性內(nèi)皮母細(xì)胞的存活和分化，加速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管新生；CRP本身可以促進(jìn)單核細(xì)胞釋放組織因子，還可通過(guò)外周巨噬細(xì)胞刺激組織因子合成，進(jìn)而促進(jìn)炎癥時(shí)血管內(nèi)的血栓形成；CRP可通過(guò)與受體的結(jié)合誘導(dǎo)許多致炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α 的合成與分泌[15]，還可通過(guò)與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用促進(jìn)H2O2產(chǎn)生，從而引起一系列炎癥反應(yīng)和細(xì)胞組織破壞。然而，本實(shí)驗(yàn)顯示CRP與其它炎性因子及EPO、HIF-1α、AR間無(wú)關(guān)聯(lián)，但是從已報(bào)道的文獻(xiàn)可知CRP可誘導(dǎo)如IL-1β、IL-6和TNF-α 的合成與分泌進(jìn)而誘導(dǎo)發(fā)生HAPC，且從我們分析的數(shù)據(jù)來(lái)看CRP的差異倍數(shù)和特異性多肽數(shù)量都很高，ELISA驗(yàn)證結(jié)果同樣顯示HAPC組的CRP濃度高于健康對(duì)照組，所以我們推測(cè)CRP與HAPC的發(fā)生發(fā)展中還存在許多未知因子及關(guān)聯(lián)值得我們進(jìn)一步進(jìn)行探索。

SAA位于11號(hào)染色體短臂，大小為150 kb，有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，已發(fā)現(xiàn)4種人SAA基因，均在11號(hào)染色體上。正常時(shí)人體內(nèi)的SAA主要來(lái)源于肝細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受到低氧刺激后發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等刺激肝細(xì)胞釋放SAA，且三者對(duì)SAA的誘導(dǎo)功能有明顯的協(xié)同作用[16]。正常單核細(xì)胞中SAA可誘導(dǎo)凝血激酶mRNA的表達(dá)，促進(jìn)血小板在血管損傷處與纖維結(jié)合蛋白黏附，炎癥狀態(tài)下與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合促進(jìn)血栓的形成，提示SAA可能參與了炎癥損害時(shí)的血栓形成；SAA可聯(lián)合中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放，造成細(xì)胞因子的蓄積，當(dāng)單核細(xì)胞被SAA刺激后發(fā)現(xiàn)TNF產(chǎn)生增多，提示SAA可導(dǎo)致血管的炎性反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂[17]。

LBP是存在于正常人血漿中的一種糖蛋白，分子量為60 kD，人LBP基因全長(zhǎng)28.5 kb，含有14個(gè)外顯子。LBP與脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 結(jié)合后，通過(guò)模式識(shí)別受體的方式與單核-巨噬細(xì)胞膜上的膜錨定CD14(member CD14，mCD14)結(jié)合形成 LPS-LBP-mCD14復(fù)合物,經(jīng)單核-巨噬細(xì)胞膜上Toll樣受體4-髓樣分化蛋白2-髓樣分化蛋白因子88(TLR4-MD2-MyD88)識(shí)別并向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào),再經(jīng)NF-κB 向胞核內(nèi)傳遞信號(hào), 從而介導(dǎo)炎癥因子的分泌[18]。當(dāng)血清LBP含量升高時(shí),會(huì)導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞過(guò)度活化,大量分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等和一氧化氮(nitric oxide，NO),導(dǎo)致過(guò)激炎癥發(fā)生進(jìn)而造成機(jī)體損害；大量釋放的NO與超氧陰離子相互結(jié)合形成過(guò)氧化亞硝基化合物，損害線粒體呼吸功能，影響電轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP生產(chǎn)速度[19]，發(fā)生能量代謝障礙并破壞機(jī)體內(nèi)平衡而引發(fā)或加重細(xì)胞炎癥反應(yīng)，致使細(xì)胞發(fā)生水腫、變性、溶解、凋亡等炎癥反應(yīng)。

本研究采用TMT技術(shù)篩選出了一系列HAPC相關(guān)的血清差異蛋白，但是這些蛋白在HAPC發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制仍不能闡述明白，需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些血漿差異蛋白作為HAPC候選標(biāo)志物的可靠性。且由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限，ELISA方法僅驗(yàn)證了CRP和SAA這2個(gè)因子，故后續(xù)我們將進(jìn)一步擴(kuò)大病例對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行深入驗(yàn)證討論，繼續(xù)探索炎癥因子在HAPC發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，尋找HAPC易感者早期有效的診斷方式和生物標(biāo)志物。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Differentially expressed plasma proteins in high-altitude polycythemia patients based on technique of TMT combined with mass spectrometry

ZHAO Jing1, SU Zhan-hai1, LIU Yong-nian1, WANG Xiao-zhou2, YANG Ying-zhong1, 3, 4, 5

(1SchoolofMedicine,QinghaiUniversity,2DepartmentofInternalMedicine,QinghaiCardiovascularandCerebrovascularDiseaseSpecialHospital,3ResearchCenterforHighAltitudeMedicalScience,SchoolofMedicine,QinghaiUniversity,4BasicandAppliedKeyLaboratoryforHighAltitudeMedicalScienceandTechnologyofQinghai,5Qinghai-UtahUnitedKeyLaboratoryforHighAltitudeMedicalScience,QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:yingzhong-yang@hotmail.com)

AIM: To screen differentially expressed proteins in plasma of the patients with high-altitude polycythemia (HAPC) and healthy people by the technique of tandem mass tags (TMT) combined with mass spectrometry. METHODS: Four HAPC patients and five matched healthy individuals were enrolled, and their plasma samples were obtained. After balanced mixing, multiple immune affinity chromatography column was used to remove 14 kinds of high-abundant proteins, and HPLC-MS/MS using an isobaric TMT proteomic technology was performed to indentify the differentially expressed proteins among groups. The concentrations of C-reactive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA) proteins in the plasma in 20 HAPC patients and 20 health controls were measured by ELISA.RESULTS: A total of 1 094 kinds of proteins were identified, and 249 differentially expressed proteins were screened, with 162 kinds of proteins up-regulated by ≥1.5 folds and 87 kinds of proteins down-regulated by ≤67% in HAPC group. The plasma concentrations of CRP and SAA in HAPC patients were higher than those in health controls (P<0.05). CONCLUSION: Many kinds of differentially expressed proteins screened out are related to inflammation, which lays a foundation for further study of HAPC pathogenesis.

High-altitude polycythemia; Tandem mass tags; Mass spectrum

1000- 4718(2017)05- 0944- 07

2016- 11- 29

2017- 02- 28

青海省科技廳科技支撐計(jì)劃(No. 2015-SF-124); 青海省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)基金項(xiàng)目(No. 2016-ZJ-706)

R339.5+4; R599.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.030

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