唐翔詡， 楊多猛， 邢 云， 李紅梅， 呂秀秀， 王彥平， 陸大祥， 王華東

(暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

輕度CLP模型大鼠在膿毒癥早期即發(fā)生心肌收縮與舒張功能障礙*

唐翔詡， 楊多猛， 邢 云， 李紅梅， 呂秀秀， 王彥平， 陸大祥， 王華東△

(暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 利用輕度盲腸結扎穿孔術(CLP)復制膿毒癥大鼠模型，比較膿毒癥大鼠心功能與其它器官功能障礙發(fā)生的時間。方法: 將大鼠隨機分為假手術組和盲腸結扎穿孔術組，分別于手術后6 h、9 h和12 h用Langendorff裝置檢測大鼠心肌收縮與舒張功能，并測定心肌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管內皮細胞黏附因子1(VCAM-1)的表達；同時檢測血清TNF-α水平以及大鼠肝、腎功能和肺濕/干重比值。結果: 輕度CLP術后10 d，大鼠的死亡率為26.7%。CLP術后9 h與12 h左心室內壓最大上升與下降速率顯著低于假手術組；CLP術后6 h, 心肌TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達顯著高于假手術組，CLP術后9 h 心肌TNF-α和VCAM-1的蛋白表達顯著升高。CLP術后9 h血清天冬氨酸氨基轉移酶活性和12 h丙氨酸氨基轉移酶活性高于假手術組。而術后6 h、9 h和12 h，大鼠血尿素氮水平、肺濕/干重比與相應時點的假手術組比較，差異沒有統(tǒng)計學顯著性。結論: 輕度CLP模型大鼠在膿毒癥發(fā)生后6 h心肌炎癥因子表達增多，9 h后即發(fā)生心肌內在收縮與舒張功能障礙，其發(fā)生早于肝、腎功能損傷。

膿毒癥； 心肌功能障礙； 離體心臟灌流； 多器官功能障礙

膿毒癥是感染引起的失調的宿主反應導致的致命性器官功能障礙[1]，這種多器官功能障礙，包括肝、肺、腎與心功能障礙等，是重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)患者死亡的重要原因。文獻報道，美國每年有100萬膿毒癥患者，約20萬人死于膿毒癥[2]。盡管近年來膿毒癥患者的死亡率有所下降，但年發(fā)病率明顯上升，而且2008～2012年期間超過3個器官發(fā)生功能障礙的患者從31.6% 上升到 35.5%，占總死亡人數(shù)的57.2% 和 66.7%[3]。據臨床統(tǒng)計，大約50%的膿毒癥患者發(fā)生心功能障礙[4]，心功能障礙的發(fā)生與膿毒癥患者死亡風險增加密切相關[5]。然而，膿毒癥心功能障礙在早期并沒有得到應有的關注， 1981年，Calvin等[6]觀察了膿毒癥患者左室射血分數(shù)(ejection fraction，EF)和射血速率(dV/dt)，發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者左室EF與非膿毒癥重癥患者比較沒有顯著差別， 而左室dV/dt明顯高于非膿毒癥重癥患者，從而認為心肌收縮功能抑制不是早期膿毒癥患者的重要病理改變。1984年，Parker等[7]通過臨床研究提出了膿毒癥心功能障礙的早期概念，認為膿毒癥可引起心功能抑制，在臨床上表現(xiàn)為左右心室擴張，EF降低，對液體復蘇和兒茶酚胺的反應性降低及膿毒癥后7～10 d恢復正常，但死亡患者的EF在正常范圍。然而，2013年Huang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)存活的膿毒癥患者左室EF并沒有明顯降低。出現(xiàn)以上矛盾結果的原因是目前臨床上缺乏準確檢測心肌內在收縮與舒張功能的指標。心臟的功能不僅受心肌內在收縮與舒張功能的影響，而且受前、后負荷以及神經內分泌的影響。因此，膿毒癥時EF并不能準確反映心肌的內在收縮與舒張功能[9-10]。由于上述原因，膿毒癥時心肌內在收縮與舒張功能障礙與其它器官功能障礙發(fā)生的時間順序尚缺乏研究。本研究通過輕度盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and punction，CLP)建立膿毒癥大鼠模型，用Langendorff離體心臟灌流裝置測定心肌內在收縮與舒張功能，比較輕度CLP模型大鼠膿毒癥時心肌內在收縮與舒張功能障礙及其它器官功能障礙發(fā)生的時間。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

6～8周齡雄性SD大鼠，體重180～200 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證編號為SCXK(粵) 2013-0034。大鼠分籠飼養(yǎng)于暨南大學實驗動物中心，在實驗前隔離檢測10 d，相對濕度控制在60%～80%，溫度控制在(24±2)℃，自由飲水、進食。動物處理符合暨南大學實驗動物管理的相關規(guī)定。

2 實驗儀器與試劑

Langendorff離體心臟灌流裝置(ADInstruments)；BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；Total RNA提取試劑(RNAiso Plus)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMII均購自TaKaRa；LightCycler?480熒光PCR儀(Roche)；RIPA裂解液(北京百泰克)； 電泳裝置(Bio-Rad)；BCA法蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific)；ECL 發(fā)光液(Millipore)；抗血管細胞黏附分子1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)抗體(Abcam)；抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(R&D)；馬抗山羊抗體和山羊抗兔抗體(北京鼎國公司)。

3 方法

3.1 實驗分組及模型的建立 將SD大鼠隨機分為 假手術組(sham組)和模型組(CLP組)。膿毒癥模型組大鼠，吸入異氟烷麻醉，仰臥位固定、備皮、消毒，鋪無菌洞巾，做1 cm的腹正中切口，小心地提拉盲腸，在距離盲腸盲端1.2 cm的地方結扎盲腸，再在結扎盲腸的中間位置用18號針來回貫穿盲腸5次，輕度擠壓盲腸從穿孔處釋放少量內容物，然后分層縫合切口，術后皮下給予30 mL/kg生理鹽水復蘇。假手術組除盲腸結扎穿孔外，其它步驟與上述一致，觀察上述實驗動物生存率，72 h之前每隔12 h觀察1次，72 h以后，每隔24 h觀察并記錄，連續(xù)10 d。另分批實驗，分為假手術組和CLP組， 每組分別按手術后6 h、9 h、12 h 3個時點隨機分為3個亞組。

3.2 Langendorff離體心臟灌流及心肌組織的處理 分別在術后6 h、9 h、12 h，麻醉大鼠、取心臟進行離體灌流，測定心肌收縮與舒張功能。首先按下列配方配制灌流液(g/L)：NaCl 6.896, KCl 0.35, MgSO40.296, KH2PO20.16, NaHCO32.1, glucose 2.18, CaCl20.277。連接好95% O2及5% CO2的混合氣及球囊。給每只大鼠注射2 000 U的肝素鈉，15 min后，腹腔注射2.25%的戊巴比妥鈉進行全身麻醉，隨后打開胸腔，獲取心臟，將修剪好的心臟快速轉移并固定到Langendorff離體心臟灌流裝置上，灌流40 min, 通過BL-420 F生物換能系統(tǒng)檢測心功能指標：左心室內壓最大上升速率(+dp/dt)、左心室內壓最大下降速率(-dp/dt)及左心室發(fā)展壓(Left ventricular developed pressure，LVDP)。灌流結束后取左心室心肌50 mg用于提取mRNA，另50 mg用于提取蛋白。

3.3 肺組織與血清處理 心臟分離時取大鼠左肺下葉，用濾紙吸去殘留的血液后，稱取濕肺的重量為W1，稱取放置標本的玻璃瓶的重量為W2，將其放入80 ℃電熱鼓風干燥箱中干烤72 h后，稱取干肺和瓶的總重量為W3，計算肺的濕干重比值(W/D)=W1/(W3-W2)。另取4 mL大鼠頸動脈血，室溫2 h后2 000 r/min離心15 min，吸取上清放入-80 ℃冰箱待用。 用7600全自動生化分析儀檢測血清中天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)的活性以及血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的水平，用ELISA法檢測血清中TNF-α的含量。

3.4 Real-time PCR 所有引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司設計并合成，GAPDH的上游引物為5′-AGGACCAGGTTGTCTCCTGT-3′，下游引物為5′-CCATGTAGGCCATGAGGTCC-3′；ICAM-1的上游引物為5′-GCAGGTGAACTGCTCTTCCT-3′，下游引物為5′-GTCTTCCCCAATGTCGCTCA-3′；VCAM-1的上游引物為5′-CGGAGCCTCAACGGTACTTT-3′，下游引物為5′-GCAAGTCAGGAGCATGGAGT-3′；TNF-α的上游引物為5′-CGTCAGCCGATTTGCCATTT-3′，下游引物為5′-TCCCTCAGGGGTGTCCTTAG-3′。用RNAiso Plus提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒的說明書進行逆轉錄，轉錄后的體系為20 μL，然后再按照real-time PCR的說明書進行擴增，總體系為50 μL，PCR的反應條件為: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 10 s, 72 ℃ 10 s，擴增45個循環(huán)； 95 ℃ 60 s, 55 ℃ 60 s, 95 ℃進行熔解曲線分析；45 ℃ 1 s冷卻，反應完成以后得到所有標本的記錄曲線。軟件將自動生成各處理組與相應的假手術組的Ct值比值。

3.5 Western blot實驗 按照RIPA裂解液的使用說明書將組織裂解， 冰上勻漿10 min，低溫12 000×g離心15 min，提取上清，使用BCA法進行蛋白定量，將定量蛋白進行變性，取等量蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳后，Bio-Rad半干轉印儀18 V恒壓轉印7 min至0.45 nm的PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別以兔抗大鼠GAPDH(1∶8 000)、VCAM-1(1∶1 000)和羊抗大鼠TNF-α(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗3遍，分別用HRP標記的抗兔IgG(1∶30 000、1∶1 000)和馬抗羊IgG (1∶5 000)孵育1 h后，TBST洗3遍，使用BCL發(fā)光液進行暗房壓片，Quantity One 軟件分析結果。

3.6 血清TNF-α的測定 收集血清，運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定各組TNF-α的水平。具體操作步驟按照試劑盒的說明書進行。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。大鼠生存率分析采用Kaplan-Meier分析并進行l(wèi)og-rank檢驗；正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，2組之間的比較采用獨立樣本的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CLP大鼠的反應與生存情況

假手術組大鼠術后反應靈敏，總體情況無明顯變化，但CLP組大鼠術后食量減少，反應遲鈍，嗜睡，腹瀉，眼角充血，毛發(fā)無光澤。如圖1所示，24 h～48 h為膿毒癥大鼠的死亡高峰期，CLP大鼠術后10 d的生存率為73.3%，假手術組大鼠的生存率為100%，兩者之間的差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Figure 1.The survival of septic rats induced by cecal ligation and punction (CLP).n=15.*P<0.05vssham group.

圖1 盲腸結扎穿孔術誘導的膿毒癥大鼠的生存率

2 膿毒癥大鼠心功能與其它器官功能障礙的發(fā)生時間

如圖2所示，CLP術后6 h，CLP組大鼠的左室±dp/dt與假手術組比較差異沒有統(tǒng)計學顯著性, 但在CLP術后9 h和12 h, CLP組大鼠的左室±dp/dt顯著低于假手術組(P<0.05)。CLP組大鼠血清中ALT的活性在CLP術后12 h時顯著高于假手術組(P<0.05)， AST的活性在9 h和12 h時顯著高于假手術組(P<0.05)；而BUN和肺濕干重比在各時點與sham組相比差異沒有統(tǒng)計學顯著性。

Figure 2.The changes of myocardial, hepatic and renal functions as well as lung wet/dry weight ratio in the septic rats. The rats were exposed to sham operation or cecal ligation and punction (CLP). At 6 h, 9 h and 12 h after sham operation or CLP, the hearts were isolated and intrinsic myocardial systolic and diastolic functions were determined by Langendorff system. Serum activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), and blood urea nitrogen (BUN) were analyzed, and the lung wet-dry weight ratio was calculated. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05vssham group.

圖2 膿毒癥大鼠心肌功能、肝腎功能及肺濕干重比的時間變化

3 膿毒癥大鼠血清TNF-α水平以及心肌TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達

CLP術后6 h、9 h、12 h，CLP組大鼠血清中的TNF-α含量明顯高于sham組，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CLP術后6 h、9 h、12 h，CLP組大鼠心肌組織中TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的mRNA表達在各時點均高于sham組(P<0.05),見圖3。

4 膿毒癥大鼠心肌TNF-α和VCAM-1蛋白表達的時間變化

如圖4所示，CLP術后9 h，大鼠心肌TNF-α蛋白水平高于假手術組(P<0.05)。CLP術后6 h和9 h ，CLP組大鼠心肌組織VCAM-1蛋白的表達高于sham組(P<0.05)。

討 論

本研究通過CLP復制膿毒癥大鼠模型，首先分析了膿毒癥大鼠的生存情況，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠CLP術后10 d的死亡率為26.7%。 因此，本研究復制的膿毒癥模型為輕度CLP模型。利用這種輕度的CLP模型，我們觀察了膿毒癥大鼠多器官功能障礙發(fā)生的時間。為了觀察心肌內在收縮與舒張功能的變化，我們利用Langendorff裝置測定CLP術后不同時點離體大鼠心臟左心室內壓最大上升速率(+dp/dt)及最大下降速率(-dp/dt)分別反映大鼠心肌內在收縮與舒張功能。結果顯示，CLP術后9 h，膿毒癥大鼠即出現(xiàn)左室±dp/dt的顯著降低，說明輕度CLP模型大鼠膿毒癥發(fā)生后9 h，大鼠心肌內在收縮與舒張功能即發(fā)生障礙。同時發(fā)現(xiàn)，膿毒癥發(fā)生后12 h大鼠血清ALT顯著升高，表明大鼠發(fā)生肝功能障礙。然而，該輕度CLP膿毒癥大鼠在CLP術后6～12 h并沒有血清BUN水平升高，而且肺濕/干重比值與假手術組比較沒有顯著差別，說明在CLP術后6～12 h大鼠并沒有發(fā)生明顯的腎功能障礙和肺水腫。上述結果證實，輕度CLP模型膿毒癥大鼠在膿毒癥早期即發(fā)生心肌內在收縮與舒張功能障礙，其發(fā)生時間早于肝、腎功能障礙發(fā)生的時間。如前所述，由于EF等指標無法直接反映心肌內在收縮與舒張功能[9]，所以臨床上很難比較膿毒癥患者心肌功能障礙與其它器官功能障礙發(fā)生的時間。2013年，有研究表明，膿毒癥大鼠6 h內出現(xiàn)心肌多種基因(包括炎癥因子)的表達變化，超聲檢查顯示膿毒癥大鼠在膿毒癥誘導后6 h即出現(xiàn)心臟每搏量降低，從而認為膿毒癥早期即發(fā)生心肌抑制[11]。但該研究并沒有直接測定心肌內在收縮與舒張功能，也沒有比較其它器官功能障礙發(fā)生的時間。我們的研究進一步確定了輕度CLP模型膿毒癥大鼠心肌功能障礙與其它器官功能障礙發(fā)生的時間模式。

Figure 3.The changes of serum content of TNF-α as well as myocardial mRNA expression of TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1 in the septic rats. The rats were exposed to sham operation or cecal ligation and punction (CLP). At 6 h, 9 h and 12 h after sham operation or CLP, the serum and heart were isolated. Serum TNF-α level was determined by ELISA, and myocardial mRNA expression of TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1 was analyzed by real-time PCR. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05vssham group.

圖3 膿毒癥大鼠血清TNF-α水平以及心肌TNF-α、ICAM-1和VCAM-1 的mRNA表達

Figure 4.The changes of myocardial protein expression of TNF-α and VCAM-1 in the septic rats. The rats were exposed to sham operation or cecal ligation and punction (CLP). At 6 h, 9 h and 12 h after sham operation or CLP, the hearts were isolated. The myocardial protein expression of TNF-α and VCAM-1 was determined by Western blot. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05vssham group.

圖4 膿毒癥大鼠心肌TNF-α和VCAM-1蛋白的表達

盡管膿毒癥心功能障礙的發(fā)生機制十分復雜[12], 但目前的研究表明心臟TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的表達升高在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9, 13]。因此，我們進一步檢測了膿毒癥大鼠血清TNF-α的水平以及心臟TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，CLP術后6 h心肌組織中的TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的mRNA以及血清中TNF-α的水平顯著升高；心肌組織中 TNF-α及VCAM-1蛋白表達在CLP術后9 h均明顯升高。業(yè)已證明，上述因子均為心肌抑制因子[13]，是膿毒癥心肌功能障礙發(fā)生的分子基礎。因此，這些結果進一步證明輕度CLP模型大鼠在膿毒癥早期即出現(xiàn)心肌內在功能障礙。

綜上所述，本研究利用離體心臟灌流技術測定心肌內在收縮與舒張功能，發(fā)現(xiàn)輕度CLP模型大鼠膿毒癥早期即發(fā)生心肌內在收縮與舒張功能障礙，而且心功能障礙出現(xiàn)的時間早于肝、腎功能損傷。這一研究提示，膿毒癥心肌功能障礙是膿毒癥患者早期的重要病理變化，在臨床上盡早檢測膿毒癥患者的心肌功能具有十分重要的臨床意義。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Presence of intrinsic myocardial systolic and diastolic dysfunctions at early stage of sepsis in mild CLP rats

TANG Xiang-xu, YANG Duo-meng, XING Yun, LI Hong-mei, Lü Xiu-xiu, WANG Yan-ping, LU Da-xiang, WANG Hua-dong

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofThePeople’sRepublicofChina,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:owanghd@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the time pattern of intrinsic myocardial dysfunction and other organ dysfunction in a rat model of mild cecal ligation and puncture (CLP). METHODS: Male SD rats were randomly divided into sham group and CLP group. At 6 h, 9 h and 12 h after sham operation or CLP, intrinsic myocardial systolic and diastolic functions were determined by Langendorff system. The expression of cardiac tumor necrosis factor (TNF)-α, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) was measured. In addition, serum activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) as well as blood urea nitrogen (BUN) were analyzed. For evaluating pulmonary edema, the lung wet-dry weight (W/D) ratio was calculated. RESULTS: In mild CLP rats, the mortality rate was 26.7% on day 10 after CLP. At 9 h and 12 h after CLP, the maximum rate of positive and negative changes in left ventricular pressure (±dp/dt) were decreased in CLP group compared with sham group. At 6 h after CLP, cardiac mRNA expression of TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1 was increased in septic rats compared with the controls. At 9 h after CLP, cardiac protein levels of TNF-α and VCAM-1 were higher in CLP group than that in sham group (P<0.05). The serum AST activity at 9 h and ALT activity at 12 h after CLP were increased in CLP group compared with sham group. However, no difference in BUN and lung W/D ratio at 6 h, 9 h and 12 h between CLP group and sham group was observed. CONCLUSION: Our findings highlight the presence of intrinsic myocardial dysfunction at 9 h after CLP in a rat model of mild CLP. Intrinsic myocardial dysfunction occurs earlier than the liver and kidney dysfunctions.

Sepsis; Myocardial dysfunction; Isolated heart perfusion; Multiple organ dysfunction

1000- 4718(2017)05- 0832- 06

2016- 11- 28

2017- 02- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 81372028)；廣東省教育廳學科建設科技創(chuàng)新項目 (No. 2013KJCX0019)；廣州市科技計劃項目(No. 201508020005)；暨南大學高水平大學建設醫(yī)學科學研究與應用組團聯(lián)合研究項目(No. 88016013045)

R363.2+1； R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.011

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 020-85220241; E-mail: owanghd@jnu.edu.cn