岳賀+周祥羽+李春苑+鄒忠杰+王淑美+梁生旺+龔夢鵑

[摘要]為了闡明交泰丸干預(yù)對氯苯丙氨酸致大鼠失眠的藥效及作用機(jī)制，SD大鼠一次性腹腔注射PCPA建立失眠模型，試驗(yàn)期間觀察大鼠自發(fā)活動(dòng)變化，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）水平，并利用核磁共振氫譜（H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)建立大鼠血清及海馬組織代謝物譜，分析交泰丸干預(yù)下大鼠自發(fā)活動(dòng)，NGF水平及與失眠相關(guān)潛在生物標(biāo)志物的變化。結(jié)果顯示交泰丸能明顯抑制失眠大鼠的自發(fā)活動(dòng)，顯著升高失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平。交泰丸能對失眠所致大鼠血清和海馬組織代謝紊亂產(chǎn)生有效的干預(yù)，并分別對血清和海馬組織中6種和5種與失眠相關(guān)潛在生物標(biāo)志物產(chǎn)生顯著的回調(diào)。研究表明交泰丸干預(yù)PcPA所致失眠的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NGF水平及調(diào)控機(jī)體氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和膽堿代謝有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]

交泰丸；失眠；代謝組學(xué)；核磁共振；對氯苯丙氨酸

失眠是一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，隨著現(xiàn)代社會(huì)心理壓力增加，失眠發(fā)病率逐年升高，因此提高睡眠質(zhì)量對公眾健康有著重要意義。交泰丸記載于明代《韓氏醫(yī)通》，由黃連和肉桂10：1配伍而成，方中黃連大寒大苦，清泄亢盛之心火，肉桂辛甘大熱，助陽補(bǔ)火，兩藥配伍交通心腎，對心腎不交型不寐具有顯著效果。全世建等研究顯示交泰丸治療失眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)下丘腦.垂體.腎上腺軸（HPA軸）的功能以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)如促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、腎上腺分泌的皮質(zhì)酮（CORT）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）和腎上腺素（E）有關(guān)。

代謝組學(xué)采用自上而下的策略，將機(jī)體作為一個(gè)整體性的系統(tǒng)，從代謝網(wǎng)絡(luò)的終端癥狀反映機(jī)體狀況，闡明藥物靶點(diǎn)相關(guān)干預(yù)。目前尚未見交泰丸治療失眠代謝組學(xué)研究的報(bào)道。本研究采用H-NMR代謝組學(xué)方法探討對氯苯丙氨酸（p-chlorophe.nylalanine，PCPA）致失眠及交泰丸干預(yù)下大鼠血清及海馬組織的代謝指紋譜變化，闡明交泰丸干預(yù)失眠藥效及作用機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，180～200 g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級，許可證號(hào)SCXK（粵）2011-0029。

1.2藥品與儀器黃連和肉桂飲片購自廣州采芝林大藥房，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院韓彬教授鑒定為正品；PCPA甲酯鹽酸鹽購自嘉興思誠化工有限公司（批號(hào)MAYA-CR-912，純度>98%）；蛋白含量測定和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑Cocktail購自美國Biotool公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）和氘水（D：0）均購自美國Sigma公司；ELX.808酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Bruker AVANCEⅢ500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；UV-2401.PC型紫外.可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3交泰丸水提液的制備精確稱取適量黃連、肉桂，以黃連和肉桂10：1混合，加10倍量水，浸泡1h，煎煮2次，每次1h，合并2次濾液，水浴濃縮至生藥濃度0.5 g·mL^-1。

2方法

2.1模型建立及給藥方法

參考文獻(xiàn)方法，將36只雄性SD大鼠置于12h光照和12h黑暗環(huán)境（溫度22℃，相對濕度50%）下自由飲食。適應(yīng)3d后隨機(jī)分正常組、模型組和交泰丸組。交泰丸組灌胃交泰丸水提液（5 g·kg^-1），每天1次，連續(xù)5d，對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第3天，模型組和交泰丸組一次性腹腔注射PCPA甲酯鹽酸鹽（564 mg·kg^-1，相當(dāng)于PCPA 450 mg·kg^-1）建立失眠模型，正常組一次性腹腔注射等體積生理鹽水。末次給藥3h后，每組一半動(dòng)物用于測量下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清NGF水平，另一半動(dòng)物用于血清及海馬組織代謝組學(xué)分析。

2.2大鼠自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)試驗(yàn)開始前將大鼠置于干凈的飼養(yǎng)籠中提前適應(yīng)3min，記錄各組大鼠2min內(nèi)自發(fā)活動(dòng)時(shí)間和前肢離地舉立次數(shù)作為正常活動(dòng)反應(yīng)指標(biāo)。末次給藥后1h再次測量各組大鼠上述指標(biāo)。

2.3大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清采集、處理及NGF水平檢測大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集的血液樣品經(jīng)凝固（4℃，60min）后離心（3500 r·min～，15min，4℃）得到血清。冰上分離出大鼠下丘腦、海馬和前額葉皮質(zhì)，用冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙拭干稱重。各部分腦組織加入9倍量PBS（含1%蛋白酶抑制劑Cock.tail）冰水浴中勻漿，離心（3500 r·min^-1，15²in，4℃）得到上清液。血清和組織上清液按試劑盒說明書操作進(jìn)行NGF指標(biāo)檢測，并采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定組織樣品蛋白含量。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4大鼠血清、海馬組織采集、處理及H-NMR測定大鼠乙醚吸入麻醉后眼眶后靜脈叢取血，收集的血液樣品經(jīng)凝固（4℃，60min）后離心（3500r·min^-1，15min，4℃）得到血清，將400μL血清加入到5mm NMR測試管中，然后加入50μL磷酸緩沖液（0.2mol·L^-1Na₂HP04-0.2 tool·L^-1振蕩混勻，待測。冰上分離出大鼠海馬組織，在冰水浴中用50%乙腈溶液勻漿（5 mL·g^-1海馬組織），離心（12 000 r·min^-1，10min，4℃）后取上清液750μL凍干，凍干物用450μL磷酸緩沖液（0.2 tool·L^-1磁管中。endprint

H-NMR測試時(shí)，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，血清樣本采用Carr-Purcell-Meibom-Gill（CPMG）脈沖序列抑制血清中蛋白質(zhì)及脂蛋白較寬的共振信號(hào)，總的回波時(shí)間100ms，弛豫延遲時(shí)間4s，采樣時(shí)間3.28 s。海馬組織樣本采用預(yù)飽和的DNOESY脈沖序列壓制水峰，弛豫延遲時(shí)間2s，采樣時(shí)間1.64 s。血清和海馬組織樣本譜寬10kHz，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，采集次數(shù)128次。

2.5H-NMR圖譜處理及多變量數(shù)據(jù)分析采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換。采用軟件MestReNova 6.1（西班牙Mestrelab Research公司）對所獲譜圖進(jìn)行手動(dòng)相位和基線校正后，對血清和海馬組織樣本，分別參照乳酸的甲基共振雙重峰）和TSP對H-NMR譜的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。在6 0.5～9.5區(qū)域按0.01等間隔分段積分，對于血清和海馬組織樣本，分別將區(qū)域64.68～5.22，6 4.53～5.30設(shè)為0積分段。然后將圖譜積分值輸出到Excel 2010（Microsoft Inc，Belle.vue，WA）中，對各分段積分值進(jìn)行歸一化處理。歸一化所得數(shù)據(jù)乘以1萬后導(dǎo)入SIMCA-P12.0（Umetrics AB，Umea，Sweden），經(jīng)Pareto標(biāo)度化預(yù)處理后，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonalpartial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。

3結(jié)果

3.1交泰丸對大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響試驗(yàn)開始前各組大鼠自發(fā)活動(dòng)時(shí)間和前肢離地舉立次數(shù)沒有明顯差異。末次給藥后1h，與正常組相比，模型組大鼠2min內(nèi)自發(fā)活動(dòng)時(shí)間和前肢離地舉立次數(shù)明顯增加（P<0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明失眠模型建立成功。交泰丸組較模型組自發(fā)活動(dòng)明顯減少（P<0.05），表明交泰丸能明顯抑制失眠大鼠自發(fā)活動(dòng)，見表1。

3.2交泰丸對失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清NGF水平的影響與正常組比較，模型組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平均顯著性降低（P<0.05）；與模型組比較，交泰丸組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平均顯著性升高（P<0.05），表明交泰丸能顯著回調(diào)失眠引起的大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平的降低，提示交泰丸能通過調(diào)節(jié)NGF水平來有效干預(yù)失眠，見表2。

3.3血清和海馬組織的H-NMR代謝物譜分析大鼠血清和海馬組織的H-NMR見圖1，2。代謝物譜峰的歸屬主要是依據(jù)化學(xué)位移值、峰的裂分隋況、耦合常數(shù)及參考文獻(xiàn)報(bào)道。

3.4PCPA致失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝指紋譜的變化對照組和模型組的血清和海馬組織樣本點(diǎn)在PCI維可以完全區(qū)分開，說明PCPA誘導(dǎo)失眠后大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。本研究采用7倍交叉驗(yàn)證法分別對OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，得到了OPLS-DA模型的主要參數(shù)，血清：海馬組織。

從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性，結(jié)果見圖3A，B。

3.5表征代謝物譜差異的潛在生物標(biāo)志物本研究使用OPLS-DA模型中變量重要性投影（variableimportance in the projection，VIP）參數(shù)評價(jià)潛在的生物標(biāo)志物。選取VIP>1的差異變量，再用t檢驗(yàn)對篩選到的差異變量在對照組和模型組間進(jìn)行驗(yàn)證，只有P<0.05的差異變量才被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。按照上述原則，最終在血清和海馬組織中分別篩選得到8種和7種具有顯著差異的化合物，見表3，4。

3.6交泰丸對PCPA致失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝紊亂的干預(yù)作用交泰丸組樣本點(diǎn)與模型組樣本點(diǎn)可以完全分離，且與正常組樣本點(diǎn)接近，表明交泰丸能有效干預(yù)失眠。同時(shí)，交泰丸能分別使失眠大鼠血清和海馬組織中6種和5種潛在生物標(biāo)志物顯著性回調(diào)（表3，4）。從上述結(jié)果可以看出交泰丸能對PCPA失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝紊亂產(chǎn)生有效的干預(yù)作用。

4討論

PCPA誘導(dǎo)的大鼠失眠模型是目前被廣泛接受的用來研究失眠機(jī)制和藥效評價(jià)的模型之一。PC.PA可以選擇性作用于色氨酸羥化酶，抑制大鼠大腦5.HT合成，造成睡眠晝夜節(jié)律消失，幾乎達(dá)到完全失眠。本研究中模型組較正常組大鼠自發(fā)活動(dòng)顯著增加，表明失眠模型建立成功。同時(shí)，失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平均顯著降低，并利用代謝組學(xué)技術(shù)分別從大鼠血清和海馬組織中篩選出8種和7種與失眠有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

NGF廣泛存在于參與睡眠.覺醒的膽堿能神經(jīng)元中，由海馬和腦皮質(zhì)產(chǎn)生的NGF可通過膽堿能神經(jīng)逆行運(yùn)輸至前腦基底核，維持膽堿能神經(jīng)元的存活和功能，NGF水平的降低會(huì)導(dǎo)致快動(dòng)眼睡眠時(shí)間減少，覺醒時(shí)間延長。其通過與神經(jīng)元和軸突末梢的激酶受體結(jié)合，誘導(dǎo)快動(dòng)眼睡眠，是快動(dòng)眼睡眠產(chǎn)生和覺醒抑制作用機(jī)制的內(nèi)在調(diào)節(jié)器。本研究中，模型組較正常組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清的NGF水平均顯著降低，提示NGF水平與失眠這一過程密切相關(guān)。同時(shí)，交泰丸能明顯升高失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平，說明交泰丸干預(yù)失眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)NGF水平有關(guān)。

本研究通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，失眠可引起機(jī)體氨基酸代謝紊亂，表現(xiàn)在模型組較正常組大鼠血清中谷氨酸、異亮氨酸水平升高，海馬組織中Ⅳ_乙酰天冬氨酸、牛磺酸水平升高，丙氨酸、氨基丁酸（GABA）水平降低。谷氨酸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元起興奮作用，是主要的興奮性遞質(zhì)，其釋放的增加導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性，在失眠中起重要作用。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、降低分解，同時(shí)通過減少色氨酸人腦的含量來降低5.HT的濃度，進(jìn)而抑制、減緩中樞疲勞。?；撬嵬ㄟ^作用于各種鈣離子通道來降低谷氨酸介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，穩(wěn)定細(xì)胞膜，同時(shí)阻礙Bcl-2和Bax蛋白二聚體的形成，逆轉(zhuǎn)Bcl-2/Bax比率，防止細(xì)胞凋亡。有研究顯示異相睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致大腦皮質(zhì)?；撬崴矫黠@升高氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的抑制性遞質(zhì)，能激活GABAa受體，使氯離子內(nèi)流，形成抑制性突觸后電位，有研究發(fā)現(xiàn)失眠時(shí)大鼠腦內(nèi)GABA水平降低，給予交泰丸治療能上調(diào)GABA水平。本研究中交泰丸能顯著下調(diào)失眠大鼠血清中谷氨酸、異亮氨酸以及海馬組織中?；撬崴?，上調(diào)海馬組織中丙氨酸、氨基丁酸水平，說明交泰丸干預(yù)失眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)機(jī)體氨基酸代謝有關(guān)。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，失眠大鼠血清中低/極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸水平明顯升高，說明失眠可引起機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，經(jīng)交泰丸干預(yù)后，血清中低/極低密度脂蛋白回調(diào)趨近正常水平，說明交泰丸可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來干預(yù)失眠。同時(shí)觀察到失眠大鼠血清中膽堿、磷酸膽堿以及海馬組織中甘油磷酸膽堿水平均顯著升高，提示失眠大鼠機(jī)體膽堿代謝紊亂。膽堿是細(xì)胞磷脂和神經(jīng)鞘磷脂的重要組成部分，是乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的前體物質(zhì)，乙酰膽堿與學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能密切相關(guān)，而磷脂酰膽堿參與細(xì)胞膜的構(gòu)成。交泰丸能顯著回調(diào)失眠大鼠血清中膽堿、磷酸膽堿以及海馬組織中甘油磷酸膽堿水平，說明交泰丸可調(diào)節(jié)膽堿代謝紊亂而發(fā)揮干預(yù)失眠的效果。

綜上所述，交泰丸能明顯抑制失眠大鼠自發(fā)活動(dòng)，并通過回調(diào)失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質(zhì)和血清中NGF水平來干預(yù)失眠。同時(shí)，交泰丸還能調(diào)節(jié)機(jī)體氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和膽堿代謝達(dá)到干預(yù)失眠的效果。本研究以不同方法相互佐證、補(bǔ)充，系統(tǒng)研究交泰丸干預(yù)失眠的作用機(jī)制，為科學(xué)闡釋中藥理論與作用機(jī)制提供新思路。endprint