羅云+楊明+李舒宇+游雅麗+張婧+廖正根

[摘要]建立銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定方法，探索銀翹散水煎液煎煮過程揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學內(nèi)涵提供研究基礎。制備不同煎煮時間銀翹散水煎液，采用GC-MS定性分析其中揮發(fā)性成分的組成并測定薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量，考察不同煎煮時間對銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量的影響。結果顯示，銀翹散水煎液中的揮發(fā)性成分主要來源于薄荷、荊芥、連翹3味藥材；隨著煎煮時間的延長，銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度均先增大后逐漸減??；浸泡30min后，剛煮沸時，煮沸5，10，15，20，30，40，50，60 min時，銀翹散水煎液中薄荷酮的質(zhì)量濃度分別為0.058，0.268，0.216，0.073，0.065，0.048，0.048，0.041，0.038，0.034 mg·L^-1，薄荷腦的質(zhì)量濃度分別為0.965，2.847，3.633，2.420，1.539，1.189，1.273，1.188，0.905，0.663 mg·L^-1。，胡薄荷酮的質(zhì)量濃度分別為0.355，0.522，0.598，0.477，0.374，0.374，0.339，0.355，0.248，0.251 mg·L^-1，3種成分總濃度分別為1.377，3.637，4.446，2.970，1.979，1.611，1.660，1.583，1.191，0.947 mg·L^-1。結果表明，煎煮時間對銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量影響較大，煮沸約5min時，香氣大出，水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度較大，煮沸15min后，香氣變淡，水煎液中3種揮發(fā)性成分濃度明顯變小，提示銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學依據(jù)。

[關鍵詞]銀翹散；水煎液；揮發(fā)性成分；香氣大出；科學內(nèi)涵；含量測定

中藥煎煮方法和提取工藝的合理性對保證中藥的臨床療效至關重要，提取終點的判斷一直是困擾研究者的技術難題，尤其對于含揮發(fā)性組分的解表類中藥。銀翹散為辛涼解表的中醫(yī)經(jīng)典名方，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、淡豆豉、甘草、蘆根等組成，具有疏風解表、清熱解毒功效，用于風熱感冒、發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。原方作者吳鞠通認為“香氣”是銀翹散的主要有效成分之一，長時間的煎煮可能會使“香氣”大量揮發(fā)，導致臨床療效降低，故特別強調(diào)其煎煮方法為“香氣大出，即取服，勿過煮，肺藥取輕清，過煮則味厚而人中焦矣”。然而，銀翹散類方現(xiàn)代中藥制劑大多需要長時間煎煮提取，這與其傳統(tǒng)煎煮用藥經(jīng)驗相悖而受到較多質(zhì)疑。那么，銀翹散原方所強調(diào)的“香氣大出即取服”科學內(nèi)涵何在？如何將其傳統(tǒng)煎煮方法轉化用于類方制劑的提取工藝？這些均是當前亟待解決的關鍵問題。

銀翹散為煮散劑，臨床服用其水煎液，水煎液中香氣和非香氣成分的濃度變化對臨床療效均有較大的影響。因此，研究銀翹散水煎液在煎煮過程中化學成分的變化規(guī)律，可為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學內(nèi)涵和合理制定銀翹散煎煮工藝提供科學依據(jù)。根據(jù)菲克擴散理論，揮發(fā)性組分蒸發(fā)速度與濃度成正比，藥液中揮發(fā)性組分濃度越大，揮發(fā)性組分蒸發(fā)速度越大，故推測“香氣大出”之時，藥液中“香氣”的濃度也最大，但目前尚未有相關實驗研究證實這一假說。

“香氣”主要是指揮發(fā)性成分，銀翹散中含有“香氣”的藥材主要有薄荷、荊芥、連翹、金銀花等，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮是薄荷、荊芥等揮發(fā)油中的主要成分。本研究在前期研究了銀翹散煎煮過程水煎液化學特征圖譜和5種非揮發(fā)性成分含量變化規(guī)律以及3種揮發(fā)性成分蒸發(fā)規(guī)律的基礎上，建立GC-MS測定銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定方法，研究不同煎煮時間銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學內(nèi)涵提供研究基礎。

1材料

Agilent 7890A氣相色譜儀-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；BT25S電子分析天平（1/10萬），BSAl24S電子分析天平（1/1萬）（德國Sartofi-us公司）；MH-2000型可調(diào)式電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；JK-5200型超聲波清洗器（功率200w，頻率40kHz，合肥金尼克機械制造有限公司）。

薄荷酮對照品（批號111705-201105，純度為99.8%）、薄荷腦對照品（批號110728-00506，純度為100.0%）、胡薄荷酮對照品（批號111706.201205，純度為99.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；銀翹散（自制，批號151125），高純氦氣（江西省南昌市宏偉氣體有限公司）；水為雙蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1GC-MS分析條件

2.1.1色譜條件HP-5MS石英毛細管柱（0.25μmx0.25mmx30m）；載氣為高純度氦氣；體積流量1.0mL·min^-1；進樣量1.0μL；模式為不分流；進樣口溫度250℃；接口溫度280℃；程序升溫：50℃保持2min，以2℃·min^-1。升至80℃，再以3℃·min^-1升至180℃。

2.1.2質(zhì)譜條件EI電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；掃描范圍m/z35～500。

2.2對照品溶液的制備

2.2.1薄荷酮對照品溶液的制備精密稱取薄荷酮對照品7.35mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含薄荷腦0.735mg對照品溶液。

2.2.2薄荷腦對照品溶液的制備精密稱取薄荷腦對照品4.76mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得每1mL含薄荷腦0.476mg對照品溶液。

2.2.3胡薄荷酮對照品溶液的制備精密稱取胡薄荷酮對照品15.37mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得每1mL含薄荷腦1.537mg對照品溶液。

2.2.4混合對照品溶液的制備取薄荷酮對照品溶液0.4mL，薄荷腦對照品溶液3.2mL，胡薄荷酮對照品溶液0.4mL，混勻，即得混合對照品溶液，再用乙醚等比稀釋制成不同濃度的混合對照品溶液，備用。

2.3不同煎煮時間銀翹散水煎液樣品的制備

按照《中國藥典》2015年版一部銀翹散的處方和制法，稱取金銀花100g、連翹100g、桔梗60g、薄荷60g、淡豆豉50g、淡竹葉40g、牛蒡子60g、荊芥40g、蘆根100g、甘草40g，粉碎成細粉，過篩，混勻，制成銀翹散。稱取銀翹散110.0g，置2000mL燒瓶中，加入1100mL（10倍量）水，浸泡30min后取樣10mL（S1），加熱提取，約20min后開始沸騰，立即取樣10mL（S2），繼續(xù)加熱，于煮沸后5min（S3），10min（S4），15min（S5），20min（S6），30min（S7），40min（S8），50min（S9），60min（S10）分別取樣10mL，放冷，加乙醚5mL振搖萃取，即得。

2.4銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的定性分析

銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖1。經(jīng)計算機貯存信號的檢索及質(zhì)譜圖進行解析確定化合物，對GC-MS總離子流色譜圖進行了初步指認，去除可能為乙醚溶劑中的抗氧劑2，6.二叔丁基對甲苯酚（BHT，tR=37.14min），采用峰面積歸一化法測定各成分相對質(zhì)量分數(shù)，共確定色譜峰19個，其中相對質(zhì)量分數(shù)大于1.5%的色譜峰13個，占93.29%。結合單味藥材揮發(fā)油的色譜圖和質(zhì)譜圖，初步確定了銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的來源，見表1。其中，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮3個指標成分相對質(zhì)量分數(shù)較大，分別為1.89%，20.53%，3.27%，可以較好地反映銀翹散水煎液揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，故選擇其作為指標成分。

2.5分析方法驗證

2.5.1系統(tǒng)適用性試驗按2.1項下分析條件進行檢測，以薄荷腦計算理論塔板數(shù)大于3000，分離度大于1.5?；旌蠈φ掌啡芤骸y翹散供試品溶液的色譜圖見圖1。結果表明，在上述色譜條件下，各所測成分分離度良好。

2.5.2線性關系考察取不同濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件進樣1μL，記錄色譜峰面積，以進樣量x（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，并擬合回歸方程，分別為薄荷酮：Y=2953548317X-173781，r=0.999 5；薄荷腦：Y=3064262418X-989 782，r=0.9991；胡薄荷酮：Y，=2839280 785X7-67 237，r=0.9997。結果表明，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮分別在0.0718～2.30，0.186～11.9，0.150～19.2ng線性關系良好。2.5.3精密度試驗精密吸取混合對照品溶液1μL，重復進樣6次，測定峰面積積分值，結果薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為1.6%，0.93%，0.59%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液1μL，進樣測定峰面積，每4h測定1次，結果薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為1.6%，1.1%，1.2%（n=7），表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5重復性試驗取同一銀翹散水煎液6份，按2.3項下的方法制備供試品溶液，精密吸取1μL，注入氣相色譜儀，測得薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均濃度為0.216，3.633，0.598mg·L^-1，RSD分別為0.64%，0.95%，1.3%，表明方法的重復性良好。

2.5.6加樣回收試驗取同一已知含量的銀翹散水煎液6份，按照100%樣品含量精密加入薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮對照品溶液，混勻，按2.3項下的方法制備供試品溶液，進樣1μL，測定峰面積，計算回收率，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均回收率為96.9%，98.4%，97.7%，RSD分別為1.6%，1.8%，2.3%，結果表明加樣回收率良好，方法可行。

2.5.7不同煎煮時間銀翹散水煎液中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定取不同煎煮時間所得銀翹散水煎液樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1項下色譜條件進行測定，每份進樣2次，以外標一點法計算樣品中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均含量，結果見表2。

由表2可見，隨著煎煮時間的延長，水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度均先增大后逐漸減小。浸泡30min后，銀翹散3種揮發(fā)性成分均有不同程度的溶出，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮分別達到最大濃度的21.6%，26.6%，59.3%，此時香氣較淡，揮發(fā)性成分并沒有大量揮發(fā)；剛煮沸時，薄荷酮的濃度達到最大值，薄荷腦、胡薄荷酮分別達到最大濃度的78.4%，87.3%，香氣漸濃，揮發(fā)性成分開始揮發(fā)；煮沸5min時，水煎液中薄荷酮的濃度下降至最大濃度的80.4%，而薄荷腦、胡薄荷酮濃度以及3種成分總濃度均達到最大；此時通過嗅覺判斷香氣也最濃，提示揮發(fā)性成分蒸發(fā)速度達到最大；煮沸10min時，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的27.1%，66.6%，79.7%；煮沸15min時，香氣變淡，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的24.3%，42.4%，62.6%，3種成分總濃度降至最大濃度的44.5%，提示揮發(fā)性成分已大量蒸發(fā)散失；至煮沸60min時，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的12.6%，18.2%，41.9%，3種成分總濃度降至最大濃度的21.3%，提示揮發(fā)性成分已蒸發(fā)殆盡。

結果表明，隨著煎煮時間的延長，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮溶出越來越多，到煮沸5min時，香氣大出，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮大量溶出并揮發(fā)，水煎液中濃度達到最大；隨著煎煮時間的再延長，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮大量揮發(fā)散失，至煮沸15min時，香氣變淡，銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分總濃度降至最大濃度的45%以下?？梢?，煎煮時間對銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量影響較大，煮沸5min時，香氣大出，水煎液中揮發(fā)性成分的濃度最大，銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學依據(jù)。

3討論

金銀花、連翹、薄荷、荊芥等含揮發(fā)性成分的藥材，煎煮時有效成分易揮發(fā)，入藥宜后下，不宜久煎。銀翹散為煮散劑，用的是經(jīng)過粉碎后的藥材飲片，與原藥材飲片相比，粒度更小，擴散面積增大，溶出速度加快，溶出物質(zhì)增加，縮短了煎煮時間，能較好地保留揮發(fā)性成分，有利于提高藥材的利用率和療效。本研究結果顯示，在同時入藥的情況下，銀翹散不經(jīng)煎煮，浸泡30min后，揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮均有一定程度的溶出，此時香氣較淡，揮發(fā)性成分并沒有大量揮發(fā)；隨著煎煮時間的延長，3種揮發(fā)性成分溶出越來越多，到煮沸5min時，香氣大出，3種揮發(fā)性成分大量溶出并揮發(fā)，水煎液中濃度也達到最大；隨著煎煮時間的再延長，3種揮發(fā)性成分大量揮發(fā)散失，至煮沸15min時，銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度已降至最大濃度的44.5%，香氣變淡，提示揮發(fā)性成分已大量蒸發(fā)散失。結果表明，銀翹散作為煮散劑，在保證揮發(fā)性成分大量溶出的情況下，縮短了煎煮時間，較好地保留了揮發(fā)性有效成分，有利于提高藥材的利用率和臨床療效。

“香氣大出”是指煎煮藥味最濃郁時，是提取終點的嗅覺判斷標準，有人認為以煮沸20min為宜，也有人認為煮沸10～15min為好，還有人認為煮沸3～5min最佳。劉亞嫻等以銀翹散為主方治療小兒外感高熱125例，以急性上呼吸道感染最多（95例），煎煮時間為煮沸后3min即可，一般1～2d即可退熱，并進行了免疫調(diào)節(jié)和解熱等相關藥理實驗，結果表明，煮沸3～6min，銀翹散的作用最強。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，銀翹散煮沸約5min時，香氣大出，水煎液中5種非揮發(fā)性成分綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸的濃度均較大，3種揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的蒸發(fā)速度也達到最大。本研究結果表明，銀翹散煮沸約5min時，水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度也較大，驗證了“香氣大出”之時，水煎液中“香氣”的濃度也最大的推測。研究結果還表明，銀翹散煮沸約5min時，香氣大出，水煎液中揮發(fā)性成分的濃度較大，蒸發(fā)速度也較大，同時非揮發(fā)性成分濃度也較大，提示銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學依據(jù)。

關于銀翹散的煎煮方法，還有很多文獻從不同角度進行了研究，主要集中在藥效和化學成分2個方面。束雅春等以綠原酸、蘆丁、橙皮苷、連翹苷、牛蒡苷5種成分及浸出物含量為指標，通過單因素考察確定了適宜工藝水平后，采用正交試驗優(yōu)選銀翹散傳統(tǒng)煎煮最佳工藝，為規(guī)范臨床中藥湯劑煎煮方法提供實驗依據(jù)；同時，通過比較銀翹散在不同煎煮方式下對實驗動物抗炎解熱作用的影響，探討最佳煎煮方式，結果表明，傳統(tǒng)砂鍋煎煮藥效優(yōu)于常壓煎藥機和高壓煎藥機煎煮，這與5種藥效成分與浸出物含量測定結果一致，為準確合理地使用銀翹散湯劑最佳煎煮方式、發(fā)揮最佳臨床療效提供了實驗依據(jù)。采用傳統(tǒng)砂鍋煎藥，具有化學性質(zhì)穩(wěn)定、傳熱快、導熱均勻、散熱慢、火候大小可隨意調(diào)節(jié)、水分蒸發(fā)量小等特點。由于實驗室條件的限制，本研究采用可調(diào)溫電熱套加熱玻璃燒瓶替代傳統(tǒng)砂鍋煎藥方式，玻璃燒瓶化學性質(zhì)穩(wěn)定、傳熱快，可調(diào)溫電熱套導熱均勻、散熱慢，且火候大小可隨意調(diào)節(jié)，先大功率煮沸，再調(diào)小加熱功率，保持微沸，水分蒸發(fā)量小，兩者聯(lián)合使用可較好地模擬傳統(tǒng)的砂鍋煎煮。

此外，銀翹散揮發(fā)性成分的組成和香味的構成均極為復雜，低含量成分可能對香氣的貢獻值較大，由于實驗條件的局限，本研究僅以其中的3種指標性成分薄荷酮、薄荷腦和胡薄荷酮含量變化來表征香氣濃淡變化尚有不足之處，有待進一步完善，筆者將采用電子鼻等技術手段量化香氣，為進一步闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學內(nèi)涵提供科學依據(jù)。