張丹+鄭開顏+吳蘭芳+趙潤懷+侯芳潔+王乾+由會玲+杜麗紅+黃璐琦+鄭玉光

[摘要]利用高效液相色譜法（HPLC）結(jié)合系統(tǒng)聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）等現(xiàn)代化學計量法，分析了西洋參藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格特征與7種人參皂苷類成分（人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd）定量指標之間的關(guān)聯(lián)，探索西洋參傳統(tǒng)商品規(guī)格特征與現(xiàn)代化學定量指標之間的關(guān)聯(lián)性，為綜合評價西洋參藥材的質(zhì)量等級的制定提供理論基礎(chǔ)。采用HPLC指紋圖譜法對40批西洋參藥材進行分析，共標定19個峰，所有樣品的相似度均在0.900以上。在此基礎(chǔ)上，以加工方法、商品規(guī)格、7種成分質(zhì)量分數(shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分數(shù)之和作為原變量進行聚類分析及主成分分析，結(jié)果表明所收集的西洋參藥材質(zhì)量與產(chǎn)地信息相關(guān)性較大，而與傳統(tǒng)商品規(guī)格特征差別較小，說明西洋參藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格的劃分具有一定的局限性。研究結(jié)果揭示了西洋參藥材商品規(guī)格與傳統(tǒng)定性指標、與化學成分定量指標之間的內(nèi)在關(guān)系，對西洋參藥材質(zhì)量進行客觀綜合定量評價提供了新思路。

[關(guān)鍵詞]西洋參；HPLC；指紋圖譜；商品規(guī)格；質(zhì)量評價

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoli-us L的干燥根。原產(chǎn)于美國威斯康辛州和加拿大蒙特利爾、魁北克省。在我國已有300多年應(yīng)用歷史，我國于20世紀70年代開始引種，目前已形成吉林、遼寧和山東3個主產(chǎn)區(qū)。國產(chǎn)西洋參由參商收購鮮參就地烘干運回銷地后，進行剪枝分等。按照行規(guī)，單支重<5g、病疤參均屬于等外參?，F(xiàn)行西洋參等級規(guī)格基本上按長度指標分成長、中、短支。參商在分等時兼顧長度和直徑，靈活掌握等級劃分。筆者通過市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前西洋參藥材商品規(guī)格的劃分主要是依據(jù)市場銷售情況、消費者的購買習慣及西洋參加工后的形態(tài)特征，根據(jù)長度結(jié)合單支質(zhì)量，兼顧產(chǎn)地等進行劃分，見表1，與周海燕等調(diào)查結(jié)果相一致。

近年來，針對西洋參化學成分、質(zhì)量標準等方面的研究報道較多，但很少對其不同商品規(guī)格間質(zhì)量差異進行研究。為了進一步研究并揭示不同商品規(guī)格的西洋參藥材的品質(zhì)差異，本文采用HPLC結(jié)合化學計量學的方法，包括聚類分析及主成分分析，建立了一種簡單、可靠的指紋圖譜方法，用于表征西洋參人參皂苷類成分及評價不同商品規(guī)格的西洋參藥材的品質(zhì)。根據(jù)加工方法、商品規(guī)格、7種成分的質(zhì)量分數(shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分數(shù)之和作為原變量進行了相關(guān)統(tǒng)計學分析。本研究以藥材市場西洋參商品規(guī)格的劃分為依據(jù)，對西洋參藥材的化學特征與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性進行了分析，為從外觀性狀角度制定和規(guī)范西洋參藥材商品規(guī)格標準提供一定的參考。

1材料

Shimadzu LC-20 AT高效液相色譜儀，Shimadzuinertsil ODS-2高效液相色譜柱C₁₈（4.6mmx250mm，5μm），Mettler-Toledo XS205 DU型電子分析天平。

人參皂苷Rg₁，（批號14052305），Re（批號14042905），Rb₁（批號14102302），Rc（批號14102805），Rb₂（批號14102804），Rb₃（批號14050407），Rd（批號14122605）對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度>99.0%；乙腈（色譜純，美國Fisher公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

不同商品規(guī)格西洋參樣品共40批，購買于河北省安國市藥材交易市場，經(jīng)河北中醫(yī)學院生藥學教研室鄭玉光教授鑒定為西洋參P.quinquefolius的干燥根，藥材憑證標本保存于河北中醫(yī)學院生藥學教研室。樣品詳細信息見表1。

所采集西洋參樣品的商品規(guī)格及加工方法均依據(jù)市場的交易情況及《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標準》。進行劃分。各產(chǎn)地單獨進行分類，其中長度為一級標準，單支重為二級標準，加工方法為三級標準。而本次收集吉林產(chǎn)部分西洋參樣品出現(xiàn)發(fā)青現(xiàn)象，推測為干燥過程中加工不當所致的青支，按照《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標準》中的規(guī)定屬于等外品，本實驗將其納入樣品收集范圍之內(nèi)，旨在從化學成分角度闡釋傳統(tǒng)劃分標準的科學性。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Shimadzu Inertsil ODS-2 C₁₈（4.6mmx250mm，5 Ixm）；流動相乙腈（A）水溶液（B），梯度洗脫（0～25min，22%～26%A；25～30min，26%～35%A；30～60min，35%A）；流速 mL·min^-1；檢測波長203nm；柱溫25℃；進樣量10μL；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb₁計算應(yīng)不低于5000。對照品及樣品（S1）HPLC圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

精密稱定適量人參皂苷對照品，用甲醇溶解配制人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的對照品混合溶液，質(zhì)量濃度分別為0.238，0.524，1.450，0.172，0.106，0.102，0.200 g·L^-1。

2.3供試品溶液的制備

隨機抽取每1批西洋參樣品，粉碎并過3號篩，取樣品粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50mL，稱定質(zhì)量，置水浴中加熱回流提取1.5h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和正丁醇補足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3結(jié)果

3.1西洋參7種成分含量測定

3.1.1線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液0.5，1，2，4，8，16，20，30，50，80 μL分別注入HPLC中，按照2.1項下的色譜條件進樣分析，測定峰面積。結(jié)果以峰面積為縱坐標，以各單體皂苷的量為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程和線性范圍，見表2，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2精密度試驗分別精密吸取混合對照品溶液10μL，在2.1項色譜條件下重復(fù)進樣6次，以峰面積為指標計算7種成分的RSD（n=6），考察精密度。人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的RSD分另0為1.3%，1.7%，2.1%，1.9%，2.4%，1.6%，1.1%，儀器精密度良好。

3.1.3穩(wěn)定性試驗精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0，2，6，12，18，24 h進樣，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4重復(fù)性試驗取同一批西洋參（S1）粉末約1g，平行6份，精密稱定，按2.3項下方法處理，得供試品溶液，分別進樣，記錄特征圖譜，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.5加樣回收率試驗取已知含量（S1）的西洋參藥材樣品約1g，平行6份，精密稱定，分別加入對照品溶液適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項下色譜條件進樣分析，計算7種成分的加樣回收率。人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb2，Rb₃，Rd的平均回收率為97.24%，99.67%，101.4%，103.8%，95.98%，98.78%，97.89%；RSD分別為2.3%，1.9%，1.2%，1.5%，2.4%，1.9%，2.1%。

3.1.6樣品的含量測定

按照2.3項下方法制備40批供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別測定40批西洋參樣品中人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd的含量，見表3。其中美國產(chǎn)野生西洋參人參皂苷含量最高，筆者收集的吉林產(chǎn)部分西洋參不符合藥典標準，與收集的樣品發(fā)青有關(guān)，故加工不當對藥材質(zhì)量具有一定的影響。

3.2西洋參藥材指紋圖譜研究

從西洋參藥材HPLC圖可見，西洋參所含成分復(fù)雜，受對照品等因素限制，前文中對人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁，Rc，Rb₂，Rb₃，Rd等7種成分進行了含量測定。但是僅用幾種特征成分來控制藥材質(zhì)量較片面，而西洋參藥材含有數(shù)十種人參皂苷類成分，其他未定量成分同樣對藥材質(zhì)量產(chǎn)生不同程度的影響。故本研究采用指紋圖譜進一步對不同商品規(guī)格的西洋參質(zhì)量進行表征和研究。

3.2.1精密度試驗精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<5.0%，相對峰面積的RSD<3.0%。

3.2.2穩(wěn)定性試驗精密吸取同一西洋參（S1）供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0，2，6，12，18，24h進樣，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.3重復(fù)性試驗取同一批西洋參（S1）粉末約1g，平行6份，精密稱定，按2.3項下方法處理，得供試品溶液，分別進樣，記錄特征圖譜，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.4指紋圖譜相似度分析40批西洋參樣品的色譜圖見圖2，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件對西洋參指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰19個，生成對照指紋圖譜見圖3。對6個不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格西洋參藥材指紋圖譜與對照圖譜比對，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格的西洋參藥材的相似度結(jié)果在0.900以上，說明各樣品間不具有顯著差異。

3.3結(jié)合化學計量法的不同商品規(guī)格西洋參藥材質(zhì)量對比分析

為了驗證已建立的西洋參的質(zhì)量評價方法，同時進一步說明不同商品規(guī)格的西洋參藥材的內(nèi)在品質(zhì)差異，本研究運用多種統(tǒng)計學方法對數(shù)據(jù)進行分析，確保結(jié)果可靠準確。

3.3.1系統(tǒng)聚類分析運用SPSS22.0軟件對本實驗40批西洋參樣品的指紋圖譜進行聚類分析。其中將加工方法、規(guī)格、7種成分的質(zhì)量分數(shù)、人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁質(zhì)量分數(shù)之和作為原變量，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理，聚類方法采用組間連接法及平方歐式距離法，結(jié)果見圖4。

由系統(tǒng)分類樹狀圖可以看出，在距離<5時，40批西洋參樣品被分為5類，其中S9，S22，S38，S39與其他樣品差異性較大，各自成為一類，與含量測定結(jié)果較一致，見表3。第一類群與相似度分析結(jié)果具有較好的一致性。對第一類群進行分析可見，西洋參藥材按照產(chǎn)地劃分各自聚為一類，說明西洋參藥材品質(zhì)與市場劃分的藥材商品規(guī)格（如長度、單支重、加工方法）并沒有相關(guān)性，而與產(chǎn)地信息相關(guān)性較大，為其主要影響因素。由聚類分析結(jié)果推測，因受產(chǎn)區(qū)土壤、氣候等綜合因素的影響，使得西洋參中人參皂苷類成分的某幾種成分產(chǎn)生一定的地域差異性。

3.3.2主成分分析在聚類分析的基礎(chǔ)上，對原變量進行主成分分析。提取3個主成分Z1，Z2，Z3，累計貢獻率為85.004%，其中z1貢獻57.182%，Z2貢獻14.201%，z3貢獻13.622%，以3個主成分建立坐標系得到的PCA三維投影圖見圖5。其主成分得分分布圖的結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致，即西洋參藥材的品質(zhì)與商品規(guī)格間并沒有顯著性差異，而樣品S9，S22，S38和S39單獨成類，與其他樣品差異性較大并與含量測定結(jié)果相一致。

4討論

《西洋參加工產(chǎn)品分等質(zhì)量標準》將西洋參分為3個等級：優(yōu)等品、一等品、合格品，在此基礎(chǔ)上，按直徑、長度、平均單支重劃分出長支、短支、泡參、條參、參段、參須6大類19種規(guī)格。隨著西洋參栽培技術(shù)發(fā)展、單產(chǎn)和質(zhì)量提高、分析檢測手段更新，原有的商品分級以及質(zhì)量要求均不符合市場要求，2005年10月14日國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局國家標準化管理委員會廢止了該標準。但是目前市場上西洋參產(chǎn)品的依然按照該標準中的規(guī)格進行分類，本實驗研究的目的之一是結(jié)合定量化學指標驗證這一分類的科學性。

本研究運用HPLC同時測定40批西洋參藥材中7種人參皂苷類成分，并建立了西洋參藥材的HPLC指紋圖譜。相似度分析發(fā)現(xiàn)各批次藥材之間質(zhì)量差異較小，但收集的吉林產(chǎn)部分西洋參藥材由于加工不當導(dǎo)致其品質(zhì)下降，不符合藥典標準。在此基礎(chǔ)上研究了不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格、不同加工方法的40批西洋參藥材的HPLC指紋圖譜，并對西洋參藥材指紋圖譜的進行聚類分析和主成分分析，聚類分析結(jié)果表明西洋參藥材的品質(zhì)與傳統(tǒng)規(guī)格劃分并無相關(guān)性，而與產(chǎn)地信息特征相關(guān)性較強；主成分分析結(jié)果表明市售西洋參藥材的品質(zhì)較為穩(wěn)定，與傳統(tǒng)劃分的商品規(guī)格間并無顯著性差異。而樣品S9，S22，S38和S39與其他樣品具有較大的差異性，主要原因為：S38為美國野生品，質(zhì)量最優(yōu)；S39為各產(chǎn)區(qū)的混參須，故與其他樣品相比具有較大差異；S9人參皂苷Rd的含量與其他樣品有顯著差異；$22人參皂苷Rg₁含量較其他樣品低。但上述差異不足以證明西洋參的商品質(zhì)量與規(guī)格具有相關(guān)性。根據(jù)本實驗結(jié)果推測，傳統(tǒng)的劃分方式與參商營銷模式以及消費者的購買心理相符，而與藥材品質(zhì)關(guān)聯(lián)性不大。

目前市場銷售的西洋參藥材的商品規(guī)格的劃分方式使不同大小的西洋參藥材具有較好的區(qū)分度，但上述劃分標準與藥材品質(zhì)間并無明顯關(guān)聯(lián)，因此亟需制定規(guī)范的西洋參藥材商品規(guī)格及等級劃分標準以約束及規(guī)范市場流通，確保西洋參藥材質(zhì)量。而本研究結(jié)果表明，西洋參藥材的質(zhì)量特征與產(chǎn)地具有較好的相關(guān)性，因此可以依據(jù)產(chǎn)地做為西洋參藥材規(guī)格劃分的依據(jù)，在此基礎(chǔ)上再進行相關(guān)等級的制定。

本研究對40批西洋參藥材化學成分進行對比研究，發(fā)現(xiàn)采用藥典定量標準（即對人參皂苷Rg₁，Re，Rb₁進行定量）可以滿足西洋參藥材商品質(zhì)量優(yōu)劣判斷，該結(jié)果為從西洋參藥材內(nèi)在化學成分角度制定西洋參藥材商品規(guī)格標準提供了參考?！盎瘜W計量法結(jié)合指紋圖譜分析”評價方法可在一定程度上表征不同產(chǎn)地藥材在化學成分方法的差別，基于二者的綜合信息，可以為西洋參的產(chǎn)地選擇，加工方法及質(zhì)量快速評價提供參考。在此基礎(chǔ)上，若能將藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來，深入開展譜效學研究，則更有利于闡明中藥作用機制，完善西洋參藥材的商品規(guī)格的劃分。