胡 珊，李 青

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，教育部林木花卉育種實(shí)驗(yàn)室，北京，100083）

紅葉腺柳（Salix chaenomeloides‘Variegata’）為楊柳科柳屬腺柳（Salix chaenomeloides Kimura）的優(yōu)良變種[1]，其頂端新葉于3月初至10月上旬呈紅色，紅葉觀賞期長(zhǎng)，是為數(shù)不多的高大彩葉喬木樹(shù)種，且對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)，耐澇旱、耐鹽堿、耐瘠薄，可用作觀賞樹(shù)、行道樹(shù)、遮陰樹(shù)和湖泊固堤、濕地修復(fù)等樹(shù)種[2]，近年來(lái)在市場(chǎng)上不斷推廣，種苗需求量大。紅葉腺柳扦插繁殖成活率雖高，但扦插時(shí)期很受局限（僅限于3-7月較合適），使其開(kāi)發(fā)及利用受到極大限制。同時(shí)，扦插繁殖需要大量插條，利用組培快繁技術(shù)為其提供插條，可實(shí)現(xiàn)紅葉腺柳的周年生產(chǎn)化生產(chǎn)。因此提高紅葉腺柳在組織培養(yǎng)過(guò)程中的增殖系數(shù)及試管苗質(zhì)量非常關(guān)鍵，本試驗(yàn)研究了繼代培養(yǎng)過(guò)程中影響紅葉腺柳叢生芽增殖及試管苗高生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，并分析了繼代過(guò)程中出現(xiàn)的試管苗莖尖壞死、高生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題的原因，提出了相關(guān)解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以紅葉腺柳的1年生帶芽莖段為外植體，誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，以側(cè)芽為試驗(yàn)材料進(jìn)行繼代增殖及試管苗高生長(zhǎng)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 不同細(xì)胞分裂素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響

接種側(cè)芽于基本培養(yǎng)基WPM，添加細(xì)胞分裂素6-BA、KT 及 TDZ，分別設(shè)置 5 個(gè)濃度水平：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)、平均苗高。

1.2.2 不同生長(zhǎng)素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響

接種側(cè)芽于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA0.5 mg·L-1。添加生長(zhǎng)素NAA、IBA，分別設(shè)置4個(gè)濃度水平：0.02、0.05、0.10、0.30mg·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)、平均苗高。

1.2.3 不同培養(yǎng)基成分對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。 添加物分別為水解乳蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、水解酪蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、2 倍大量母液Ca2+及2倍有機(jī)母液。接種30d后統(tǒng)計(jì)平均苗高、生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 不同抗褐化劑對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。添加抗褐化劑PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、維生素C、檸檬酸、硫代硫酸鈉及活性炭，分別設(shè)置 3 個(gè)濃度水平：0.5、1.0、2.0g·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計(jì)平均苗高、生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 降低激素濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+活性炭1 g·L-1，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素 6-BA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1）及生長(zhǎng)素 NAA（0.05、0.10 mg·L-1），采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。接種30d后統(tǒng)計(jì)平均苗高、生長(zhǎng)狀況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光周期14 h·d-1，日光燈光源，光照強(qiáng)度2000lx。培養(yǎng)基中其他成分為3%蔗糖+0.6%瓊脂，pH值為5.8～6。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

增殖系數(shù)=增殖后苗的個(gè)數(shù)（個(gè)）/接種苗的個(gè)數(shù)（個(gè)）。

樣本數(shù)為每個(gè)梯度20個(gè)處理，重復(fù)2次。使用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，運(yùn)用Duncan多范圍檢驗(yàn)比較分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞分裂素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響

細(xì)胞分裂素在促進(jìn)DNA合成及細(xì)胞分裂中起關(guān)鍵作用，從而誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生[3]，故在培養(yǎng)基中分別添加3種不同的細(xì)胞分裂素，以期篩選出適宜種類及濃度的細(xì)胞分裂素。

表1 不同細(xì)胞分裂素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響Table1 Effect of different kinds and concentration of cytokinins on multiplication

將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的側(cè)芽切成1.5cm左右的帶芽莖段接種于叢生芽培養(yǎng)基中。

由表1可知，當(dāng)側(cè)芽接種于WPM空白培養(yǎng)基時(shí)，試管苗幾乎無(wú)增殖且長(zhǎng)勢(shì)不良，說(shuō)明細(xì)胞分裂素對(duì)促進(jìn)叢生芽增殖效果顯著。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度為0～1.0mg·L-1時(shí)，平均增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增長(zhǎng)。當(dāng)添加6-BA濃度為1.0mg·L-1時(shí)，平均增殖系數(shù)為4.78，與其他梯度之間產(chǎn)生顯著差異，且葉色翠綠，長(zhǎng)勢(shì)旺盛（圖版Ⅰ：1）。

當(dāng)6-BA濃度超過(guò)1.5mg·L-1，試管苗會(huì)出現(xiàn)玻璃化、莖尖壞死等現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象是指試管苗呈半透明水漬狀，葉色淡易破碎，長(zhǎng)勢(shì)弱[4]（圖版Ⅰ：2）。關(guān)亞麗等在研究簸箕柳的組培快繁時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的增加，玻璃化明顯加強(qiáng)，嚴(yán)重影響增殖[5]。莖尖壞死現(xiàn)象表現(xiàn)為試管苗莖細(xì)弱，頂芽及嫩葉在接種20d后卷曲發(fā)黑掉落（圖版Ⅰ：3），繼而導(dǎo)致試管苗全部死亡。這可能是由于外源激素不適宜導(dǎo)致頂端分生組織停止分化或細(xì)胞壞死所致[3]。

細(xì)胞分裂素種類不同，對(duì)植物的效應(yīng)亦有所差異。當(dāng)添加KT時(shí)，平均增殖系數(shù)為3.53，但試管苗的葉片易脫落。當(dāng)添加TDZ時(shí)，試管苗莖節(jié)呈扁平狀，葉片皺縮發(fā)黃，平均增殖系數(shù)為0。表1的結(jié)果顯示KT與TDZ對(duì)紅葉腺柳叢生芽增殖沒(méi)有明顯的作用，在其他文獻(xiàn)中亦有報(bào)道[6]。故誘導(dǎo)紅葉腺柳叢生芽增殖的細(xì)胞分裂素宜選擇1.0mg·L-1的6-BA。

2.2 不同生長(zhǎng)素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響

在叢生芽增殖階段，細(xì)胞分裂素通常與生長(zhǎng)素組合使用為宜。在上述試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加6-BA，平均苗高均在2.5 cm以下，高生長(zhǎng)緩慢，故在培養(yǎng)基中分別添加NAA、IBA，以期篩選出適宜種類及濃度的生長(zhǎng)素。

由表2可知，6-BA與生長(zhǎng)素組合使用時(shí)比單獨(dú)使用時(shí)增殖效果好。6-BA與NAA配合使用促進(jìn)試管苗增殖在部分柳屬組織培養(yǎng)中中亦有報(bào)告[5,7,8]。當(dāng)NAA濃度為0.02～0.10mg·L-1時(shí)，平均增殖系數(shù)隨NAA濃度的增加而增長(zhǎng)，當(dāng)NAA濃度為0.10mg·L-1時(shí)，平均增殖系數(shù)為5.77，與其他梯度之間形成顯著差異。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加IBA的培養(yǎng)基里，試管苗易產(chǎn)生莖尖壞死現(xiàn)象，而在添加NAA的培養(yǎng)基里莖尖壞死現(xiàn)象較少見(jiàn)，且試管苗葉色濃綠。但若未及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基，亦會(huì)出現(xiàn)莖尖壞死現(xiàn)象，適宜的繼代周期為30d。NAA為人工合成的生長(zhǎng)素，通過(guò)刺激植物細(xì)胞內(nèi)的NAA轉(zhuǎn)化酶而生成相關(guān)生長(zhǎng)素來(lái)刺激植物生長(zhǎng)，但僅對(duì)含有NAA轉(zhuǎn)化酶的植物起作用[9]，說(shuō)明紅葉腺柳體內(nèi)含NAA轉(zhuǎn)化酶較豐富，所以NAA對(duì)其增殖及苗高的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。故在增殖培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)素宜選擇0.10 mg·L-1的NAA。

表2 不同生長(zhǎng)素種類及濃度對(duì)叢生芽增殖的影響Table2 Effect of different kinds and concentration of auxins on multiplication

綜上所述，適宜的叢生芽增殖培養(yǎng)基配方為：WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

2.3 不同添加物種類及濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

在叢生芽增殖培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)試管苗高生長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題，試管苗的平均苗高均不超過(guò)2.5cm，不利于植株的生根移栽，故在培養(yǎng)基中分別添加不同種類的添加物，以期篩選出適宜種類及濃度的添加物。

由表3可知，8組添加物均未促進(jìn)試管苗高生長(zhǎng)。水解乳蛋白及水解酪蛋白易造成試管苗葉子發(fā)黑，植株死亡。水解乳蛋白是由乳蛋白經(jīng)胰酶消化而成，氨基酸含量豐富[10]。水解酪蛋白是以天然牛奶蛋白為原料，是氨基酸、多肽 、蛋白質(zhì)混合物[11]。WPM基本培養(yǎng)基有機(jī)母液含有甘氨酸、維生素等。可能是由于水解乳蛋白、水解酪蛋白及有機(jī)母液中的有機(jī)氮含量豐富，促進(jìn)了乙烯的釋放[12]，反而不利于紅葉腺柳生長(zhǎng)。適量Ca2+能抑制葉片衰老，維持葉片濃綠[13]，WPM基本培養(yǎng)基所含的Ca2+可能足以維持試管苗正常生長(zhǎng)，故添加2倍Ca2+并未有效促進(jìn)試管苗高生長(zhǎng)。上述8組濃度的添加物均不適宜紅葉腺柳試管苗高生長(zhǎng)。

表3 不同添加物種類及濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響Table3 Effect of different kinds and concentration of additives on elongation

2.4 不同抗褐化劑種類及濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

繼代培養(yǎng)過(guò)程中在試管苗基部發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象，這可能是試管苗高生長(zhǎng)緩慢的重要原因。褐化現(xiàn)象是指當(dāng)試管苗傷口中的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶（PPO）的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類物質(zhì)，在酪氨酸酶的作用下與試管苗組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致組織代謝紊亂，切面的褐色物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，最終使試管苗死亡[14]。木本植物中的酚類物質(zhì)含量豐富，褐化問(wèn)題一直是其組織培養(yǎng)中的難題。

表4 不同抗褐化劑種類及濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響Table4 Effect of different kinds and concentration of browning inhibitors on elongation

由表4可知，5種抗褐化劑對(duì)抑制紅葉腺柳褐化的效果不同。在活性炭濃度為0.5～1.0g·L-1時(shí)，平均苗高隨活性炭濃度的升高而增長(zhǎng)，當(dāng)添加1.0g·L-1的活性炭時(shí)，平均苗高為6.49 cm，與其他梯度之間形成顯著差異，且試管苗葉片肥厚，莖稈粗壯（圖版Ⅰ：4）?；钚蕴渴菑?qiáng)吸附劑，醌類酚類皆可吸附，有效吸附根部周圍傷口產(chǎn)生的褐色有害物質(zhì)從而抑制褐化現(xiàn)象[15]。同時(shí)，活性炭減弱光照，保護(hù)了根端產(chǎn)生的IAA，可有效促進(jìn)壯苗。當(dāng)添加PVP時(shí)，平均苗高雖有顯著提高，苗長(zhǎng)勢(shì)亦健壯，但對(duì)苗的影響不如添加活性炭顯著，可能是因?yàn)镻VP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑[16]，而培養(yǎng)基中有害物質(zhì)種類較多，活性炭可起到一定的吸附作用，而PVP只能部分吸附?？箟难?、硫代硫酸鈉對(duì)紅葉腺柳試管苗高生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，且在抗壞血酸的作用下，試管苗莖細(xì)弱發(fā)黃，不適宜繼續(xù)試驗(yàn)。檸檬酸、硫代硫酸鈉會(huì)導(dǎo)致試管苗發(fā)黑死亡。故抗褐化劑宜選擇1.0g·L-1的活性炭。

圖版Ⅰ 紅葉腺柳繼代培養(yǎng)過(guò)程 1.叢生芽；2.叢生芽玻璃化；3.叢生芽莖尖壞死；4.添加活性炭后試管苗高生長(zhǎng)；5.激素交替培養(yǎng)后試管苗高生長(zhǎng)PlateⅠ SubcultureprocessofSalix Chaenomeloides‘Variegata’ 1.Multiple shoots；2.Vitrification of multiple shoots；3.Apical necrosis of multiple shoots；4.shoot Elongation after adding activated carbon；5.shoot Elongation after using 1.0mg·L-16-BA and 0.5mg·L-16-BA alternately

2.5 降低激素組合濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響

在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，試管苗一直處于高濃度的激素環(huán)境里可能會(huì)抑制其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，促使苗增殖但不高生長(zhǎng)，且試管苗在同一培養(yǎng)基里繼代多次，易造成試管苗發(fā)黃退化，葉片易發(fā)黑掉落。故降低激素濃度，以期篩選出適宜的促進(jìn)試管苗高生長(zhǎng)的激素配比。

細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度過(guò)高不僅能促進(jìn)酚類物質(zhì)形成，還能刺激多酚氧化酶（PPO）的活性從而造成褐化[7]。由表5可知，當(dāng)6-BA濃度為0.1～1.0mg·L-1時(shí)，平均苗高隨6-BA濃度的升高而增長(zhǎng)，適當(dāng)降低6-BA濃度能促進(jìn)試管苗高生長(zhǎng)及苗的質(zhì)量（圖版Ⅰ：5）。王關(guān)林等試驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三倍體速生楊誘導(dǎo)出叢生芽后，若直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，試管苗會(huì)發(fā)黑死亡，而若將其轉(zhuǎn)入低濃度6-BA培養(yǎng)基里，試管苗將從矮化叢生芽狀態(tài)轉(zhuǎn)入高生長(zhǎng)且長(zhǎng)壯的狀態(tài)[17]。當(dāng)6-BA濃度為0.5mg·L-1時(shí)，平均苗高為6.56cm，苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠。但6-BA濃度為1.0mg·L-1時(shí)，平均苗高雖與0.5 mg·L-16-BA時(shí)的平均苗高無(wú)明顯差異，但在培養(yǎng)20d后試管苗發(fā)黃，葉片從尖端開(kāi)始發(fā)黑掉落。故在試管苗高生長(zhǎng)階段6-BA應(yīng)選擇0.5mg·L-1為宜。

表5 降低激素組合濃度對(duì)試管苗高生長(zhǎng)的影響Table5 Effect of different reduced plant growth regulators combination on elongation

3 結(jié)論與討論

由試驗(yàn)得出結(jié):適宜的繼代培養(yǎng)周期為30d。適宜紅葉腺柳叢生芽增殖培養(yǎng)基為：WPM+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，適宜紅葉腺柳試管苗高 生 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 基 為 ：WPM+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+活性炭 1.0g·L-1。在繼代叢生芽增殖培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)試管苗高生長(zhǎng)緩慢，莖尖壞死等現(xiàn)象，原因主要是褐化問(wèn)題及6-BA濃度過(guò)高、試管苗長(zhǎng)期處于同一激素種類與濃度所致。

對(duì)于褐化問(wèn)題，抗褐化劑選擇1.0g·L-1的活性炭為宜?；钚蕴渴菑?qiáng)吸附劑，可有效吸附根部周圍傷口產(chǎn)生的各類醌類酚類物質(zhì)從而抑制褐化現(xiàn)象[15]。PVP效果不如活性炭可能是因?yàn)镻VP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑[16]，只能部分吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)?？箟难?、亞硫酸鈉、檸檬酸為抗氧化劑，不適宜做紅葉腺柳試管苗的抗褐化劑。對(duì)抗壞血酸抑制褐化的機(jī)理，陳凱認(rèn)為抗壞血酸能使多酚氧化酶失活同時(shí)消耗掉溶解氧從而阻止酚類物質(zhì)氧化，但無(wú)法破壞已形成的醌類物質(zhì)，所以其抗褐化效果較弱[18]。硫代硫酸鈉作為有效的抗氧化劑但同時(shí)也是鈣的螯合劑[19]，會(huì)降低培養(yǎng)基里Ca2+濃度，從而不利于試管苗生長(zhǎng)。檸檬酸可能由于抗氧化性太強(qiáng)，消耗培養(yǎng)基中的溶解氧過(guò)量，從而促使試管苗發(fā)黑死亡。

Siddique等研究表明6-BA會(huì)抑制頂端優(yōu)勢(shì)，從而促進(jìn)芽增殖及分化[20]，故6-BA濃度過(guò)高是抑制試管苗高生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一。Khan等在研究四子柳的組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度的細(xì)胞分裂素在試管苗擴(kuò)繁階段效果顯著，但在生長(zhǎng)后期應(yīng)轉(zhuǎn)入低濃度的細(xì)胞分裂素中，有利于試管苗的長(zhǎng)期增殖和高生長(zhǎng)[12]。故在試管苗高生長(zhǎng)階段應(yīng)降低6-BA用量，6-BA濃度0.5mg·L-1與1.0 mg·L-1交替使用，可使紅葉腺柳試管苗保持高繁殖率的同時(shí)，試管苗高生長(zhǎng)顯著，長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉色濃綠。余如剛[8]、郭小燕[21]等分別在旱柳Q106、柳樹(shù)優(yōu)良雜交品種的繼代培養(yǎng)時(shí)使用激素交替的方法。

試驗(yàn)研究了適宜紅葉腺柳試管苗增殖與高生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配比，分析繼代培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題及其解決方法，對(duì)于如何提高成苗速度及試管苗質(zhì)量，如何更適宜工廠化生產(chǎn)擴(kuò)繁，降低成本等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

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