許 偉, 苗 敏, 唐曉鳳, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

番茄中一個抗病基因功能的研究

許 偉, 苗 敏, 唐曉鳳, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

植物中最大的一類抗病基因(R)編碼的蛋白質(zhì)含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil,CC) 、核苷酸結(jié)合位點(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域。R基因以抗病著稱。文章通過酵母雙雜篩選方式獲得了DDI3基因,該基因與番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu),預(yù)測具有R基因抗病性,參與植物抗病。研究中構(gòu)建了DDI3過表達(dá)載體并通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到野生型番茄中,篩選獲得DDI3高表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因株系。通過病菌接種實驗,觀察植株發(fā)病情況和統(tǒng)計細(xì)菌菌落數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株的抗病性明顯高于野生型番茄。DDI3基因?qū)μ岣叻训目共⌒杂泻芨叩膬r值,為采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的嘗試,同時又與番茄DDB1基因具有相互作用,對研究DDB1基因在參與植物抗病途徑中的功能研究提供新的方向。

DDI3基因;CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)域;轉(zhuǎn)基因番茄;抗病性

自然界中真菌、細(xì)菌以及線蟲引起的植物疾病對農(nóng)作物生產(chǎn)帶來了毀滅性的影響[1]。外界不良的環(huán)境以及各種病原菌通常會給植物生長發(fā)育造成一定傷害,同時植物在長期的進(jìn)化過程中也形成了完善的自我保護(hù)機(jī)制，以抵御病原菌入侵以及外界不良環(huán)境的傷害。研究表明植物抗病R基因能夠識別病原體引發(fā)的過敏性反應(yīng)(hypersensitive response,HR),從而提高植物對病害的抵抗[2]。近年來,已經(jīng)從不同的植物中克隆了多個R基因,其中多數(shù)的R基因都具有核苷酸結(jié)合位點(nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域[3]。研究顯示,NBS-LRR抗病基因主要編碼3個結(jié)構(gòu)域，即TIR(toll and IL-1 receptors)/CC(coiled-coil)、NBS和LRR,依據(jù)N端信號肽的不同,將NBS-LRR結(jié)構(gòu)劃分為以下2類結(jié)構(gòu)：① 包括Toll/白細(xì)胞介素-1受體類似結(jié)構(gòu)(TIR),形成結(jié)構(gòu)TIR-NBS-LRR;② 不包括TIR結(jié)構(gòu)域,但是一般被編碼卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(CC)域所替代,形成CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)[4]。

不同的NBS-LRR基因之間的核苷酸序列的差異性比較大,從而研究具有一定復(fù)雜性。但是已經(jīng)在很多植物物種發(fā)現(xiàn)了CC-NBS-LRR的抗病基因,如小麥中Lr10抗葉銹病基因編碼有3個結(jié)構(gòu)域，分別為CC、NBS和LRR[5];水稻中相關(guān)研究比較廣泛,研究主要集中在抗稻瘟病抗性基因。稻瘟病抗性基因Pik-p,通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)確定NBS-LRR結(jié)構(gòu)具有抗病性[6];稻瘟病抗性Pi64基因在發(fā)育的所有時期和檢測的組織中持續(xù)表達(dá)[7];BPH26是褐飛虱抗性26號基因,通過圖譜定位克隆了BPH26基因,其中該基因編碼了富含亮氨酸的核苷酸結(jié)構(gòu)蛋白,BPH26被廣泛納入優(yōu)良水稻品種[8];Pi54rh基因?qū)儆诟缓涟彼岬暮塑账峤Y(jié)構(gòu)域R家族中的抗性基因,擁有獨特的鋅指結(jié)構(gòu)域。Pi54rh基因在葉片中持續(xù)表達(dá)在正常的水平,但是接種病原菌96 h后表達(dá)量上調(diào)了3.8倍,具有明顯的抗性上調(diào)[9];晚疫病是由致病疫霉菌引起的病害,是番茄中一類最具破壞性的病害。Ph-3是番茄中第1個被克隆出來的晚疫病抗性基因,并編碼著富含亮氨酸的核苷酸結(jié)構(gòu)蛋白[10]。

番茄是世界上第二大蔬菜作物,也是提取番茄紅素等物質(zhì)的重要原料,但是番茄生長發(fā)育過程受到各種病原菌侵害的制約[11]。番茄的病害主要有40多種,主要包括青枯病、早疫病、晚疫病、枯萎病、葉霉病等病菌[12]。

本研究通過酵母雙雜的方法篩選到與番茄中重要DDB1基因有相互作用的DDI3,并利用番茄基因組信息確定了DDI3具有CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu),功能預(yù)測具有抗病作用,因此確定了以DDI3基因為研究對象?？寺×朔袲DI3基因,重組到植物過表達(dá)載體中,通過重組質(zhì)粒,在番茄野生型植株中過表達(dá)DDI3基因。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對野生型番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得陽性轉(zhuǎn)基因株系。通過在番茄幼苗上接種丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas.syringaepv.tomato,Pst),觀察番茄植株病斑與生長狀況,計算相同位置葉片1 cm2菌落數(shù)。比較發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因苗與野生型AC苗的差異較明顯,從而發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株DDI3過表達(dá)提高了番茄抗病性。

1 材料與方法

番茄(SolanumlycopersicumMill.cv.Ailsa Craig)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、丁香假單胞菌番茄致病變種Pst.DC3000(Pseudomonas.syringaepv.tomato)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105及pBI121雙元表達(dá)載體均為實驗室保存。Trizol購自于Invitrogen、 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶、pEASY-Blunt載體、T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司,質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自TIANGEN 公司。

1.1 番茄DDI3目的基因的克隆

按照Sol Genomics Network中番茄DDI3(Solyc05g008070.2.1)基因序列設(shè)計引物DDI3-F1、DDI3-R1、DDI3-F2、DDI3-R2,根據(jù)所構(gòu)建目的載體上酶切位點,并運用軟件Primer Premier 5對DDI3基因序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點分析,設(shè)計含SmaⅠ和XhoⅠ酶切位點的特異引物,見表1所列。

表1 本文研究所用的引物

提取野生型番茄幼苗總RNA,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增DDI3基因,PCR 條件如下:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 20 s;51℃ 20 s;72 ℃ 160 s,32 個循環(huán);72 ℃ 5 min,獲取目的基因PCR產(chǎn)物。

1.2 DDI3雙元過表達(dá)載體構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物連接于pEASY-Blunt載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定,陽性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序,測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行分析。用SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切 pEASY-Blunt-DDI3重組質(zhì)粒和pBI121-35S表達(dá)載體質(zhì)粒,并膠回收目的基因片段和表達(dá)載體片段。將目的片段連接于pBI121-35S載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,篩選出陽性菌落,通過菌落PCR和限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒[13]。

1.3 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[14-16],將重組pBI121-35S-DDI3質(zhì)粒通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,在含有利福平(Rifampicion,Rif)和卡那霉素(Kanamycin,Kana)各50 mg/L的培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d,菌落PCR鑒定獲取陽性菌株,并保存。

1.3.1 番茄發(fā)苗及獲取愈傷組織過程

番茄種子用自來水浸泡12 h 后,用75%的酒精漂洗2 min,再用10% 次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min,用無菌水漂洗8次后播種至1/2 MS培養(yǎng)基。22 ℃,暗培養(yǎng)4 d左右,露白后轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)。待子葉完全舒展開時,將子葉剪下后放置于預(yù)培養(yǎng)基MS+1 mg/L 6-BA(6-benzy lamino adenine,6-芐氨基腺嘌呤)+0.04 mg/L IAA (indoleacetic acid,吲哚-3-乙酸)培養(yǎng)2 d;將含有pBI121-35S-DDI3重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌28 ℃過夜培養(yǎng)后,室溫下5 000 r/min離心5 min收集菌。

1.3.2 侵染過程與鑒定轉(zhuǎn)基因陽性株系

用稀釋后的農(nóng)桿菌浸染預(yù)培養(yǎng)3 d的子葉10 min;用無菌濾紙吸去子葉上多余菌液后,將子葉轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)基MS+1 mg/L KT(kinetin,激動素)+1 mg/L 2,4-D(2,4-dichlo rophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)+10 mg/L ACE(acetosyringone,乙酰丁香酮)上培養(yǎng)2 d;然后轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基MS+500 mg/L CB(carbenicillin,羧芐青霉素)+2 mg/L 6-BA+50 mg/L Kana+0.2 mg/L IAA上,22 ℃下光照培養(yǎng)(16 h 光照,8 h黑暗),每3周更換1次培養(yǎng)基;待愈傷組織上長出的不定芽長至2 cm左右時,將芽切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基MS+500 mg/L CB+2 mg/L IAA+50 mg/L Kana上生根。待長出完整根系后移入營養(yǎng)土,放于溫室中栽培。提取番茄基因組DNA,以DNA為模版,pBI121-35S質(zhì)粒為陽性對照,同時用野生型番茄DNA作為陰性對照,根據(jù)pBI121 載體篩選標(biāo)記基因新霉素磷酶基因(NPTⅡ)(GenBank登錄號 AF485783)序列合成引物NPTⅡ-F 和NPTⅡ-R,對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 鑒定。 PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s ，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s ，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.4 病菌接種

挑取Pst.DC3000單克隆,用含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)液在28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的菌體離心,6 000 r/min離心4 min,除去上清。用滅菌好的10 mmol/L MgCl2溶液懸浮起菌體,使Pst.DC3000菌體均勻溶于MgCl2溶液中。測定菌體OD600 nm值,將菌體用10 mmol/L MgCl2液體稀釋到OD600 nm=0.5,作為菌體接種濃度,正常情況1個OD600 nm=108～109cfu/mL。將長勢基本相同的轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄,分別浸泡于OD600 nm=0.5的Pst.DC3000菌液中25 s,每組分別有5棵轉(zhuǎn)基因苗和野生型苗作為實驗組,未處理過的轉(zhuǎn)基因和野生型番茄,作為空白對照組。處理過的番茄植株,72 h里套袋保持水分,并放置于人工培養(yǎng)室正常培養(yǎng)6 d,觀察植株發(fā)病情況。

通過平板劃線的方法計算接種病菌活體菌體數(shù)目。取100 μL的侵染病菌即OD600 nm=0.5,將其加入到900 μL滅菌的MgCl2溶液中,將菌體稀釋了10倍。再從稀釋混合均勻的菌體中取100 μL將其加入到900 μL滅菌的MgCl2溶液中,又將菌體稀釋了10倍,依次將菌體稀釋到10-4、10-5、10-63個梯度。從3個菌體溶液中分別取10 μL,用移液槍將其慢慢加到含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上,讓菌體沿著培養(yǎng)基流動,均勻涂于培養(yǎng)基上,放置于28 ℃恒溫箱中生長2 d。從3個梯度中選擇最理想的板子,計算菌落數(shù),實驗重復(fù)3次,計算平均值。

1.5 比較染病菌株葉片菌落數(shù)

取處理過6 d的轉(zhuǎn)基因和野生型番茄植株,比較不同番茄植株相同位置1 cm2葉片菌落數(shù)量差異。取樣過程中,選取轉(zhuǎn)基因番茄與野生型番茄相同位置葉片,用打孔器鉆取葉片上、中、下3個位置的圓孔樣品(1 cm2)。加入1 mL 10 mmol/L MgCl2溶液,將葉片研磨均勻,轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中。用塑料棒均勻攪10 s,使每個EP管中葉片上菌落混合均勻。將菌體進(jìn)行稀釋,菌體稀釋到10-2、10-32個梯度。分別取10 μL,用移液槍將菌液涂于含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB培養(yǎng)基上,使菌體沿著培養(yǎng)基流動,均勻涂于培養(yǎng)基上。處理接菌的轉(zhuǎn)基因葉片、接菌的野生型葉片、未接菌的野生型和轉(zhuǎn)基因葉片4種樣品,每組選取3棵不同番茄。實驗重復(fù)3次,計算1 cm2葉片上的菌落數(shù)平均值,比較菌體數(shù)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DDI3基因與測序

以番茄cDNA為模板,用DDI3-F1和DDI3-R1為外側(cè)引物PCR 擴(kuò)增。再以PCR產(chǎn)物為模板,以DDI3-F2和DDI3-R2為內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增,產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示,圖1中,擴(kuò)增產(chǎn)物為一條特異條帶,與預(yù)期的番茄DDI3基因片段2 511 bp大小一致。將其連接到pEASY-Blunt載體上,酶切鑒定正確,送測序。測序結(jié)果用DNAMAN和Chromas軟件分析序列,與番茄DDI3基因在番茄基因組中序列一致。

圖1 DDI3基因PCR擴(kuò)增

2.2 表達(dá)載體鑒定

用SmaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切得到與預(yù)期結(jié)果大小一致2 511 bp的DDI3基因片段,證明DDI3基因已經(jīng)連接到植物表達(dá)載體35S-pBI121上,如圖2所示。

圖2 pBI121-35S-DDI3載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因番茄株系,從葉片中提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA,利用植物表達(dá)載體pBI121 攜帶的NPTⅡ基因?qū)χ仓赀M(jìn)行陽性鑒定,預(yù)期擴(kuò)增片段長度為 857 bp。共得到組培苗12株,其中6株經(jīng)過鑒定為轉(zhuǎn)基因番茄苗,結(jié)果如圖3所示。圖3表明,負(fù)對照野生型植株DNA未能擴(kuò)增出857 bp 條帶,而正對照35S-pBI121質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因株系DNA擴(kuò)增出857 bp 條帶,說明攜帶NPTⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR鑒定

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的表型

DDI3轉(zhuǎn)基因植株與野生型生長狀況相比,沒有明顯差異,轉(zhuǎn)基因植株果實顏色在成熟時期與野生型植株果實基本一致，雖然具有抗病CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu),但未能改變番茄的表型性狀。發(fā)苗實驗中,在相同實驗條件下,可以觀察到相同生長期內(nèi)DDI3轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)速率要慢于野生型AC番茄種子。

2.5 接種Pst.DC3000的染病情況

通過稀釋平板的方法,統(tǒng)計計算出接種的Pst.DC3000菌體濃度1個OD600 nm=2.78×108cfu/mL,菌體活性滿足條件,具有很強(qiáng)的侵染活力。分別用Pst.DC3000處理轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄,發(fā)現(xiàn)處理6 d后,DDI3轉(zhuǎn)基因番茄的病斑性狀比較少,而野生型番茄病斑數(shù)目與生長狀況有明顯變化,如圖4所示。相比之下,DDI3過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄對Pst.DC3000具有一定的抵抗作用。

圖4 番茄植株接菌發(fā)病情況

2.6 比較發(fā)病植株菌落數(shù)量差異

用打孔器鉆取不同植株相同位置1 cm2葉片。將1 cm2葉片上的菌落均勻溶于滅菌的10 mmol/L MgCl2溶液中,通過稀釋平板涂板的方法,計算出接菌DDI3轉(zhuǎn)基因番茄與接菌野生型AC番茄的菌落數(shù)。選取稀釋10-3為最宜計算值。為計算出更加準(zhǔn)確的菌落數(shù),吸取10 μL菌液沿著培養(yǎng)基從上往下流動,均勻涂于培養(yǎng)基上。每次3個重復(fù),取平均值,減少實驗誤差。對5個獨立的實驗組進(jìn)行分析比較,如圖5所示,圖5中,**表示高度顯著;*表示具有差異。

圖5 番茄菌落數(shù)比較圖

由圖5可以看出,野生型AC番茄葉片的Pst.DC3000菌落數(shù)目比較大,而DDI3轉(zhuǎn)基因苗葉片菌落數(shù)目明顯少于野生型。通過顯著性差異分析,發(fā)現(xiàn)野生型菌落數(shù)是DDI3轉(zhuǎn)基因苗的2.8倍,具有高度顯著差異,如圖6所示。說明DDI3轉(zhuǎn)基因番茄上調(diào)表達(dá)對Pst.DC3000具有很好的抗病性。

圖6 菌落數(shù)差異分析

3 結(jié)果與討論

本文利用農(nóng)桿菌侵染番茄愈傷組織獲得DDI3的轉(zhuǎn)基因番茄株系,觀察發(fā)現(xiàn)DDI3的轉(zhuǎn)基因番茄與野生型番茄無明顯的差異。但是通過種子萌發(fā)實驗可以發(fā)現(xiàn)DDI3萌發(fā)速度較慢,相同條件下,生長期內(nèi)轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)速率要慢于野生型AC種子,說明DDI3基因可能對番茄種子萌發(fā)有一定影響。

同時對DDI3轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行抗病實驗。通過接種Pst.DC3000病菌驗證并計算番茄葉片的菌落數(shù)的發(fā)病情況,發(fā)現(xiàn)都有較明顯的差異,從而確定DDI3轉(zhuǎn)基因番茄對Pst.DC3000具有很好的抵抗作用,其抗病明顯優(yōu)于野生型番茄,說明過表達(dá)DDI3基因能提高番茄的抗病性。

目前本文只對DDI3轉(zhuǎn)基因番茄植株抗病性進(jìn)行研究,獲得比較理想的實驗結(jié)果。但是種子萌發(fā)實驗的現(xiàn)象，本文未能具體分析產(chǎn)生萌發(fā)延遲和苗型生長較慢的原因。下一步將深入探究DDI3基因參與種子萌發(fā)機(jī)制,研究DDI3基因與種子萌發(fā)相關(guān)基因功能之間的聯(lián)系,確定產(chǎn)生現(xiàn)象的原因與機(jī)理;后期還將對DDI3基因的抗病機(jī)制進(jìn)行深入研究,并探究其抗病相關(guān)的上下游受體,闡述基因功能的作用機(jī)制及其與DDB1基因功能之間的關(guān)系,進(jìn)一步為DDB1基因功能研究提供新的探究方向。

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(責(zé)任編輯 閆杏麗)

Research on one tomato gene involved in disease resistance

XU Wei, MIAO Min, TANG Xiaofeng, LIU Yongsheng

(School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The proteins encoded by the biggest type of disease-resistant genes(R) in plants contain coiled-coil(CC) and nucleotide-binding site(NBS) and leucine-rich repeat(LRR) domain structure. R genes are famous for its disease resistance. In this paper,DDI3 gene was screened out by means of yeast two-hybrid, which had interaction with functionalDDB1 gene and contained the CC-NBS-LRR structure. It was predicted to have disease resistance of R gene and involved in plant disease resistance. TheDDI3 overexpression vector was constructed and transferred into the wild type tomato plants through agrobacterium-mediated transformation， and the positive transgenic plants with high expression ofDDI3 were obtained. By the pathogen inoculation experiment, the apparent plant disease and statistical number of bacterial colonies were observed. It is found that the resistance of transgenic plants is obviously higher than that of wild type tomato.DDI3 gene functioning as a resistance is a very good method to improve the disease resistance of tomato, which is a new attempt in the improvement of the disease resistance of tomato by using gene engineering technology.DDI3 also interacts with tomatoDDB1 gene, providing a new direction to the research on the function ofDDB1 in plant disease resistance.

DDI3 gene; CC-NBS-LRR domain; transgenic tomato; disease resistance

2016-01-25；

2016-04-18

國家自然科學(xué)基金資助項目(31171179)

許 偉(1989-),男,安徽蕪湖人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生; 劉永勝(1964-),男,重慶市人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.04.022

Q78

A

1003-5060(2017)04-0547-06