李萍，申曉霞，舒婷，石春韜

(天津農(nóng)學院 基礎科學學院，天津 300384)

八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分和水溶性組分的比較

李萍，申曉霞，舒婷，石春韜

(天津農(nóng)學院 基礎科學學院，天津 300384)

目的：比較八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分和水溶性組分的化學組成和抗菌活性。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分，用石油醚作溶劑從蒸餾殘液中萃取揮發(fā)性成分的水溶性組分。利用氣-質聯(lián)用技術分析化學組成，采用瓊脂-孔洞擴散法測定抗菌活性。結果：油相組分和水溶性組分的提取率分別為8.50%和4.19%，揮發(fā)性成分的總提取率為12.69%。油相組分和水溶性組分各鑒定出12種和45種化合物，分別占各自總量的100.000%和98.076%，兩者最主要成分都是反式茴香腦，含量分別為94.897%(油相組分)和70.520%(水溶性組分)。雖然油相組分對7種供試菌種的抑制效果都比水溶性組分強，但高濃度的水溶性組分對供試菌種也表現(xiàn)出一定的抑制效果。油相組分對枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，水溶性組分對啤酒酵母展現(xiàn)出很強的抗菌活性。在實驗濃度范圍內，油相組分和水溶性組分對供試青霉和黑曲霉抑制效果較弱。結論：在提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分同時，還應該收集并利用水溶性組分，達到八角茴香揮發(fā)性成分的綜合利用。

八角茴香；揮發(fā)性成分；油相組分；水溶性組分；化學組成；抗菌活性

隨著人們食品安全意識的提高，化學防腐劑的殘留問題引起關注，安全有效的天然植物源抗菌劑的市場需求不斷增加。大量文獻報道了天然香料和草藥提取物，尤其是植物精油的抗菌活性及應用[1-3]。其中，八角茴香精油是通過水蒸氣蒸餾法從八角茴香果實、枝、葉等部位提取得到的芳香油狀液體，是八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分，是水不溶性組分。關于八角茴香精油的組成、抗菌、抗氧化、殺蚊蟲等活性已有文獻報道[4-7]，然而，水蒸氣蒸餾提取八角茴香精油后的殘液通常被棄掉，這部分是八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分，有文獻報道八角茴香果實的水煮液對食源性致病菌具有一定的抗菌效果[8]。關于水蒸氣蒸餾提取八角茴香精油后，蒸餾殘液的組成和抗菌活性的報道很少，因此，研究蒸餾殘液即水溶性組分的組成及抗菌活性對全面了解八角茴香揮發(fā)性成分具有重要意義。

本文采用水蒸氣蒸餾法提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分(即八角茴香精油)，收集油相組分后，剩余殘液繼續(xù)蒸餾，收集八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分，利用氣-質聯(lián)用技術分析兩者的組成，采用瓊脂-孔洞擴散法測定兩者的抗菌活性，為八角茴香揮發(fā)性成分的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

1.1.1 大紅八角整果

產(chǎn)地廣西，購于超市，50 ℃干燥24 h，粉碎，過40目篩，取篩下粉末備用。

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、釀酒酵母、青霉、黑曲霉，均由天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院微生物實驗室提供，4 ℃斜面保存，用前活化。

1.2 藥品與儀器

氯化鈉、無水硫酸鈉、石油醚(30～60 ℃)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：均為國產(chǎn)分析純。正己烷：色譜純，天津市光復精細化工研究所。細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、酵母用酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、霉菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國安捷倫公司；DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；Thermo Scientific MSC-Advantage Ⅱ級生物安全柜 德國Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分提取

按照文獻中水蒸氣蒸餾法提取八角茴香精油的最佳工藝條件[9]，稱取10 g(精確至0.0001 g)八角茴香粉末置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，水蒸氣蒸餾，收集溜出液(油水混合物)，至餾出液恰好澄清。油水混合物鹽析，石油醚萃取，干燥，過濾，水浴回收石油醚，得八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分，即八角茴香精油，稱重，按照公式(1)計算提取率。

公式(1)

1.3.2 八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分提取

從水蒸氣蒸餾提取油相組分的餾出液恰好變澄清開始，繼續(xù)收集餾出液，至圓底燒瓶內液體幾乎蒸干。澄清的餾出液用石油醚萃取，干燥，過濾，水浴回收石油醚，得八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分，稱重，按照公式(1)計算提取率[10]。

1.3.3 GC-MS分

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS 石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，根據(jù)文獻[7]的GC-MS測試條件并做適當修改，柱箱程序：初始60 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至160 ℃，保持4 min，再以5 ℃/min升至210 ℃，保持5 min，運行時間40 min；進樣口溫度：220 ℃，進樣量：0.5 μL，分流比：50∶1，載氣：高純He，流速：1.0 mL/min。

1.3.3.2 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍：30.0～550.0 amu。組分的鑒定根據(jù)美國NIST 2008標準譜庫檢索并參考相關文獻，用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。

1.3.4 抗菌活性測定

1.3.4.1 供試樣品溶液的配制

油相組分和水溶性組分用DMF溶解，初始濃度為1000.0 mg/mL。用DMF作溶劑，采用3倍連續(xù)稀釋法制備一系列不同濃度的供試樣品溶液。

1.3.4.2 菌懸液的制備

細菌用平板稀釋法測定菌落數(shù)[11]，酵母菌用血球計數(shù)法計算菌落數(shù)。將活化后的細菌和酵母菌用無菌生理鹽水稀釋，分別制成含菌數(shù)為107cfu/mL的菌懸液。霉菌活化后用適量無菌生理鹽水沖洗并收集孢子，充分振蕩，制成孢子數(shù)為107個/mL的菌液。

1.3.4.3 瓊脂-孔洞擴散法測定抗菌活性操作步驟

滅菌培養(yǎng)基冷卻至50 ℃，加入5 mL菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中(直徑9 cm)，每皿20 mL，放置，使培養(yǎng)基固化。用無菌打孔器在固化后的培養(yǎng)基上均勻打孔(直徑7 mm)，記號，每孔加入40 μL不同濃度的供試樣品溶液，DMF作空白對照。細菌37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母菌28 ℃培養(yǎng)48 h，霉菌25 ℃培養(yǎng)72 h。測量抑菌圈直徑(mm)，每個濃度重復3次，按公式(2)計算對供試菌種的抑制率[12,13]。

公式(2)

2 結果與分析

2.1 油相組分和水溶性組分的提取率和外觀比較

油相組分和水溶性組分的提取率和外觀比較結果見表1。

表1 油相組分和水溶性組分提取率及外觀比較結果

由表1可知，油相組分的產(chǎn)率比水溶性組分高，是水溶性組分的2.03倍，這一結果與王同禹等報道的結果一致。但油相組分和水溶性組分都屬于八角茴香的揮發(fā)性成分，因此，如果收集水溶性組分可使揮發(fā)性成分的提取率達到12.69%。此外，油相組分和水溶性組分的外觀沒有區(qū)別，但油相組分的八角茴香風味比水溶性組分更加濃烈。

2.2 油相組分和水溶性組分的化學組成比較

油相組分和水溶性組分的化學組成分析結果見表2。

表2 油相組分和水溶性組分化學組成分析

續(xù) 表

注：“-”表示該物質未被檢出。

由表2可知，油相組分和水溶性組分各鑒定出12種和45種化合物，分別占各自總量的100.000%和98.076%，兩者共有組分9種。油相組分主要含有芳香烴(1種)、單萜(1種)、單萜的醇(2種)、醚類(5種)、醛類(2種)、倍半萜(1種)，水溶性組分主要含有烷烴(21種)、芳香烴(1種)、單萜(1種)、單萜的醇(2種)、醚類(5種)、倍半萜(7種)、酯類(3種)、酚類(1種)、倍半萜的醇(1種)、羧酸(1種)、烷醇(1種)、烯烴(1種)。油相組分的特征成分是茴香醛、反式肉桂醛和甲基丁香酚，水溶性組分的特征成分類型是烷烴、酯、酚、羧酸、烷醇、烯烴、倍半萜的醇，且倍半萜類成分的種類比油相組分多6種。油相組分和水溶性組分的最主要成分都是反式茴香腦，反式茴香腦是八角茴香的特征風味成分[14]，油相組分的反式茴香腦含量(94.897%)遠高于水溶性組分(70.520%)，這也是對油相組分八角茴香氣味濃烈的有利解釋。同時，反式茴香腦也是一種安全的天然食品添加劑，并具有較強的殺菌和抗氧化作用[15，16]，水溶性組分中反式茴香腦的相對含量達到70.520%，收集水溶性組分可使反式茴香腦的收率得到很大提高。

2.3 油相組分和水溶性組分對同一菌種的抑制活性比較

油相組分和水溶性組分對同一菌種的抑制活性，見圖1。

圖1 油相組分和水溶性組分對同一菌種的抑制作用

注：(a)為大腸桿菌；(b)為產(chǎn)氣腸桿菌；(c)為枯草芽孢桿菌；(d)為啤酒酵母；(e)為釀酒酵母；(f)為青霉；(g)為黑曲霉。

由圖1可知，隨著濃度的增加，油相組分和水溶性組分對供試菌種的抑制作用加強。不同濃度的油相組分對7種供試菌種的抑制效果均比水溶性組分好。八角茴香揮發(fā)性成分的抗菌性與其主要成分反式茴香腦密切相關，反式肉桂醛和甲基丁香酚也具有顯著的抗菌效果[17-19]。由GC-MS分析結果可知，油相組分中反式茴香腦的相對含量明顯比水溶性組分高，反式肉桂醛和甲基丁香酚也是油相組分的特征成分，這些都是對油相組分抗菌效果好于水溶性組分的有利證明。雖然油相組分對供試菌種的抑制效果比水溶性組分強，但是濃度為1000.0 mg/mL的水溶性組分對供試菌種也表現(xiàn)出一定的抑制效果，分別達到39.13%(大腸桿菌)，33.33%(產(chǎn)氣腸桿菌)，36.36%(枯草芽孢桿菌)，37.33%(啤酒酵母)，33.33%(釀酒酵母)，14.32%(青霉)，6.67%(黑曲霉)，尤其是對供試細菌和酵母菌抑制效果好于霉菌。

瓊脂-孔洞擴散法測定油相組分抑菌活性的培養(yǎng)皿照片。

圖2 瓊脂-孔洞擴散法測定油相組分抑菌活性的培養(yǎng)皿照片

注：a為大腸桿菌；b為產(chǎn)氣腸桿菌；c為枯草芽孢桿菌；d為啤酒酵母；e為釀酒酵母；f為青霉；g為黑曲霉。

由圖2可知，抑菌圈形狀完整、清晰，此方法測定結果準確可靠。

2.4 油相組分和水溶性組分對不同菌種的抑制活性比較

油相組分和水溶性組分對不同菌種的抑制作用比較結果見圖3。

圖3 油相組分和水溶性組分對不同菌種的抑制作用

注：a為油相組分，b為水溶性組分。

由圖3中a可知，油相組分對細菌的抑制作用最強，其次是酵母，最后是霉菌，對枯草芽孢桿菌抑制效果最好，黑曲霉對油相組分最不敏感。油相組分對3種細菌的抑制作用由強到弱的順序為：枯草芽孢桿菌>產(chǎn)氣腸桿菌>大腸桿菌，說明其對革蘭氏陽性菌的抑制作用大于革蘭氏陰性菌，這與Wang等人報道的結果一致，油相組分對啤酒酵母的抑制作用高于釀酒酵母，對青霉的抑制效果好于黑曲霉。由圖3中b可知，濃度為1000.0 mg/mL的水溶性組分對大腸桿菌的抑制效果最好，其次是啤酒酵母，對黑曲霉的抑制效果最差，而濃度為333.3，111.1，37.0 mg/mL的水溶性組分對啤酒酵母表現(xiàn)出最強的抑制效果，這點與油相組分不同。此外，水溶性組分對啤酒酵母的抑制作用高于釀酒酵母，對青霉的抑制效果好于黑曲霉，這點與油相組分的規(guī)律一致。

3 結論

本文比較了八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分和水溶性組分的化學組成和抗菌活性，結論如下：油相組分的和水溶性組分的提取率分別為8.50%和4.19%，揮發(fā)性成分的總提取率為12.69%，兩者均為淺黃色透明液體，油相組分八角茴香氣味更加濃烈。油相組分和水溶性組分各鑒定出12種和45種化合物，分別占各自總量的100.000%和98.076%，兩者共有組分9種。油相組分的特征成分是茴香醛、反式肉桂醛和甲基丁香酚，水溶性組分的特征成分類型是烷烴、酯和羧酸等。油相組分和水溶性組分的最主要成分都是反式茴香腦，含量分別為94.897%(油相組分)和70.520%(水溶性組分)，收集水溶性組分可使反式茴香腦的收率得到很大提高。隨著濃度的增加，油相組分和水溶性組分對供試菌種的抑制作用加強。雖然油相組分對7種供試菌種的抑制效果都比水溶性組分強，但高濃度的水溶性組分對供試菌種也表現(xiàn)出一定的抑制效果。油相組分對枯草芽孢桿菌抑制效果最好，水溶性組分對啤酒酵母展現(xiàn)出很強的抑制效果。在實驗濃度范圍內，油相組分和水溶性組分對供試青霉和黑曲霉抑制效果較弱。綜上所述，八角茴香揮發(fā)性成分的水溶性組分不僅具有一定的抑菌效果，而且反式茴香腦的含量也很高，還富含多種油相組分沒有的化合物類型，因此，在提取八角茴香揮發(fā)性成分的油相組分同時，還應該收集并利用水溶性組分，達到八角茴香揮發(fā)性成分的綜合利用。

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Comparison of Oil-phase Components and Water-soluble Components of Star Anise Volatile Constituents

LI Ping, SHEN Xiao-xia, SHU Ting, SHI Chun-tao

(College of Basic Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China)

Objective: The chemical composition and antimicrobial activities of oil-phase components and water-soluble components of star anise volatile constituents are compared in this study. Methods: The oil-phase components of star anise volatile constituents are extracted by steam distillation, and the water-soluble components are also obtained from the distillation residues with petroleum ether as solvent. The chemical composition and antimicrobial activities of the two kinds of extracts are also investigated by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)and agar-hole diffusion assay respectively.Results: The yield of oil-phase components and water-soluble components of star anise volatile constituents is 8.50% and 4.19% respectively, and the total yield of volatile constituents is 12.69%.12, 45 compounds are identified from the oil-phase components and water-soluble components, accounting for 100.000% and 98.076% of the total amount respectively.Moreover,the most abundant component in the two kinds of extracts is trans-anethole, and the content is 94.897% for oil-phase components and 70.520% for water-soluble components respectively. The oil-phase components show higher antimicrobial activity against all the seven tested strains than water-soluble components, however, the water-soluble components with high concentration also exhibit some degree of inhibitory effect.Bacillussubtilisis found to be the highly sensitive to the oil-phase components, and beer yeast is found to be the most sensitive to the water-soluble components among the tested strains. In addition, the inhibitory effects of oil-phase components and water-soluble components on the tested two molds are weak in the range of experimental concentration.Conclusion: The water-soluble components should be collected and used when extracting the oil-phase components in order to achieve the comprehensive utilization of star anise volatile components.

star anise; volatile constituent; oil-phase component; water-soluble component; chemical composition; antimicrobial activity

2016-11-16

李萍(1979-)，女，天津人，講師，碩士，研究方向：香辛料有效成分的提取和應用。

TS264.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.009

1000-9973(2017)05-0042-07