聶振禹 洪夢琪 包蓓艷 李國富 陳爭躍 余雄偉

高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達(dá)的影響研究

聶振禹 洪夢琪 包蓓艷 李國富 陳爭躍 余雄偉

目的 探討高糖腹膜透析液對人腹膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMECs）中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)HPMECs并分為5組，N組用含葡萄糖的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；P組用2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；GN組用含50g/ml葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）拮抗劑根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；SN組用含10g/ml鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（SGLT1）拮抗劑根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；GN+SN組用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)。分別采用RT-PCR法、Western blot法檢測各組HPMECs GLUT1、SGLT1、細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）的mRNA、蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）。 結(jié)論 高糖腹膜透析液或通過上調(diào)HPMECs中GLUT1、SGLT1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達(dá)，從而起促腹膜纖維化作用。

腹膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1 血管內(nèi)皮生長因子-A 結(jié)締組織生長因子

腹膜透析是終末期腎病患者的一種有效治療方法[1]。盡管在過去的幾十年間，透析技術(shù)已有很大發(fā)展，但腹膜透析患者的生存率仍不理想。腹膜纖維化所導(dǎo)致的超濾衰竭是患者不得不中止腹膜透析的常見原因，而慢性腹膜炎癥及高糖透析液對腹膜的損傷是導(dǎo)致腹膜纖維化的兩個(gè)重要原因[2]。腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理發(fā)展過程[3]，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等發(fā)揮的作用，以及內(nèi)皮細(xì)胞中存在的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）[4]和鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（SGLT1）[5]也與這一過程密切相關(guān)。GLUT1與SGLT1在各種細(xì)胞中抗纖維化方面的作用受到臨床關(guān)注[6-7]。本研究擬通過體外培養(yǎng)人腹膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMECs），探討高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF表達(dá)的影響，以期為探討腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供新的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 改良型PMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%EDTA-胰蛋白酶、FBS（美國Gibco公司）；2.5%葡萄糖腹膜透析液（廣州百特醫(yī)療有限公司）；根皮素、根皮苷原粉（美國Sigma公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；GoTaq兩步法RT-qPCR系統(tǒng)、GoScript逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)、GoTaqRqPCR Master Mix（美國Promega公司）；Trizol試劑（美國Ambion公司）；兔抗人GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF抗體（美國Santa Cruz公司）；熒光標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（美國LICOR公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；HPMECs由寧波大學(xué)潤良糖尿病研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HPMECs接種在1%明膠包被的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～36h后第1次換液，以后每2～3d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%～90%時(shí)，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養(yǎng)，取第3、4代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分成5組：N組用含葡萄糖的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；P組用2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；GN組用含50g/ml GLUTI拮抗劑根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；SN組用含 10g/ml SGLT1拮抗劑根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)；GN+SN組用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養(yǎng)。

1.2.3 RT-PCR法檢測GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF mRNA表達(dá)水平 當(dāng)細(xì)胞生長融合至90%～95%時(shí)，按上述分組要求同步培養(yǎng)細(xì)胞48h，采用Trizol一步法抽提細(xì)胞總RNA，用GoScript逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)試劑盒合成cDNA，產(chǎn)物用GoTaq兩步法RT-qPCR系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95℃10s，95℃30s，60℃ 60s，72℃ 60s，共40個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct法分析RT-PCR結(jié)果，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot法檢測 GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達(dá)水平 當(dāng)細(xì)胞生長融合至90%～95%時(shí)，按上述分組要求同步培養(yǎng)細(xì)胞48h，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，取50g變性蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯胺凝膠電泳，并用0.22m的硝酸纖維素濾膜進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，考馬斯亮藍(lán)染膠、麗春紅S染液染膜，觀察蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移完全。用含5%牛血清白蛋白的封閉液進(jìn)行封閉，Ⅰ抗（1∶500）4℃孵育過夜，隨后熒光標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000）室溫避光孵育1h，Licor Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后分析各目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值作為蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達(dá)水平比較 見圖1。

圖1 5組H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F-β1、V E G F-A、C T G F m R N A表達(dá)水平比較

由圖1可見，5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組 HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）。

2.2 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達(dá)水平比較 見圖2。

圖2 5組H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F β-1、V E G F-A、C T G F蛋白表達(dá)水平比較

由圖2可見，5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）。

3 討論

目前國內(nèi)腹膜透析常規(guī)使用不同濃度葡萄糖為滲透劑的乳酸鹽透析液。高糖在腹膜內(nèi)異常代謝所產(chǎn)生的晚期糖基化終產(chǎn)物或葡萄糖降解產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、沉積，最終導(dǎo)致腹膜纖維化，其中葡萄糖的吸收可能隨治療時(shí)間的延長而增加。葡萄糖的吸收會導(dǎo)致滲透梯度的減小或消失加快，超濾量減少，同時(shí)可能導(dǎo)致高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥、高血壓、體重增加等代謝紊亂。因此獲得最佳超濾以及減少對腹膜功能損傷的同時(shí)，減少葡萄糖的吸收，進(jìn)而減少代謝紊亂是腹膜透析治療的理想目標(biāo)。高糖所致的細(xì)胞損傷、代謝紊亂，細(xì)胞內(nèi)糖攝入過多是啟動因素。

高糖必須借助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮其毒性作用。細(xì)胞對葡萄糖的吸收攝取途徑有兩種[8-9]：一是載體介導(dǎo)的易化擴(kuò)散，二是繼發(fā)性主動轉(zhuǎn)運(yùn)，通過鈉泵的存在，促進(jìn)葡萄糖逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)。其中易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體是GLUT，而繼發(fā)性主動轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠SGLT介導(dǎo)。GLUT是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體，是調(diào)控細(xì)胞糖代謝的第一道關(guān)卡。GLUT功能異常勢必會影響細(xì)胞內(nèi)糖代謝，從而導(dǎo)致代謝紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，GLUT有很多亞型，包括GLUT1、2、3、4、5等，而SGLT主要有SGLT1、2、3。據(jù)報(bào)道，在人視網(wǎng)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在著GLUT1、3，在體外培養(yǎng)的HPMCs上有3種GLUT。其中GLUT1是介導(dǎo)HPMCs葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，高糖可上調(diào)間皮細(xì)胞上GLUT1蛋白的表達(dá)。而GLUT1表達(dá)上調(diào)或者活性增加使細(xì)胞對葡萄糖攝取過多，造成細(xì)胞內(nèi)糖負(fù)荷過重和糖代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腹膜損傷、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加重腹膜炎癥，最終導(dǎo)致腹膜纖維化。同時(shí)其表達(dá)上調(diào)將增加HPMCs對葡萄糖的攝取，降低超濾率[10-11]。高糖對不同細(xì)胞上的GLUT的作用是不同的：在視網(wǎng)膜周細(xì)胞中，它可以降低GLUT的轉(zhuǎn)運(yùn)活性而在內(nèi)皮細(xì)胞沒有這種功能[12]，同時(shí)GLUT位置的改變會導(dǎo)致功能的改變[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促進(jìn)HPMCs GLUT1、SGLT1表達(dá)水平升高，而在GLUT1拮抗劑與SGLT1拮抗劑作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1表達(dá)中水平降低。

既往研究發(fā)現(xiàn)，肺的成纖維細(xì)胞中GLUT的表達(dá)對肺纖維化有一定影響[15]。本研究發(fā)現(xiàn)2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促進(jìn)HPMCs纖維化相關(guān)因子TGF-β1、VEGFA、CTGF表達(dá)水平升高，而在GLUT1拮抗劑與SGLT1拮抗劑作用下，HPMCs TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達(dá)水平降低。這表明在下調(diào)HPMCs GLUT與SGLT1表達(dá)水平后，TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達(dá)水平也下調(diào)。

根皮素主要存在于蘋果樹的樹皮、樹葉以及果實(shí)中。正如大多數(shù)黃酮類化合物一樣，研究發(fā)現(xiàn)根皮素具有多種藥理作用，如抗氧化、免疫抑制、調(diào)節(jié)糖在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)從而起到降血糖的作用，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等細(xì)胞周期也有一定的作用，因此可作為GULT1的拮抗劑使用[16]。根皮苷具有降低血糖、改善記憶力、抗氧化、抗癌等多種重要的生物活性，在新型藥物和天然保健食品開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)也是SGLT1的一種拮抗劑[17]。本研究結(jié)果顯示，根皮素和根皮苷均可下調(diào)HPMCs中 GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達(dá)水平。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察高糖腹膜透析液對HPMCs GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)2.5%葡萄糖腹膜透析液可以上調(diào)HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達(dá)水平；而在根皮素與根皮苷作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達(dá)水平均下降。然而GLUT1、SGLT1對HPMCs的具體調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，還有待更進(jìn)一步深入研究。

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Expression of GLUT1,SGLT1,TGFβ-1,VEGF-A,CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells cultured with high

glucose peritoneal dialysis fluid

NIE Zhenyu,HONG Mengqi,BAO Beiyan,et al.Department of Nephrology,Ningbo Vrology and Nephrology Hospital,Ningbo 315192,China

Objective To investigate the effect of high glucose-based peritoneal dialysis fluid(PDF)on the expression of glucose transporters1(GLUT1),Na+/glucose cotransporters1(SGLT1),transforming growth factor-β1(TGF-β1),vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)and connective tissue growth factor(CTGF)in human peritoneal microvascular endothelial cells(HPMECs). Methods The cultured HPMECs were divided into 5 groups:normal group(N),peritoneal dialysis(containing 2.5%glucose)group(P);GLUT1 antagonists group(GN),SGLT1 antagonists group(SN);GLUT1 antagonists+SGLT1 antagonists group(GN+SN).The mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in HPMECs were detected by RT-qPCR and Western blotting,respectively. Results There were significant differences in mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF among 5 groups(P＜0.05).Compared with group N,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in group P was increased significantly(P＜0.05).Compared with group P,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in groups GN,SN and GN+SN was decreased significantly(P＜0.05). Conclusion High glucose peritoneal dialysis fluid may up-regulate the expression of GLUT1, SGLT1,which may further induce the up-regulating expression of TGF-β1,VEGF-A and CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells,resulting in the peritoneal fibrosis.

Peritoneal microvascular endothelial cells Glucose transporters1 Na+/glucose cotransporters1 TGF-β1 VEGF-ACTGF

2 0 1 6-1 0-2 0）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1678

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y13H050021）；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C50001）；寧波市鄞州區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（鄞科[2011]69號-26）

3 1 5 1 9 2 寧波市泌尿腎病醫(yī)院腎內(nèi)科（聶振禹、包蓓艷、李國富、陳爭躍、余雄偉）；寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（洪夢琪）

包蓓艷，E- m ail：baobeiyan2007@ sina.com