馬志紅 陳瑩蓉 董順利 徐旭婷 劉進 宋鵬濤 李鴻偉 戴利成

NSCLC中AEG-1的表達(dá)及與臨床病理特征和血管生成的關(guān)系研究

馬志紅 陳瑩蓉 董順利 徐旭婷 劉進 宋鵬濤 李鴻偉 戴利成

目的 通過分析星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（AEG-1）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征和血管生成的關(guān)系。方法 選取NSCLC患者手術(shù)切除標(biāo)本92例，每例標(biāo)本均留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上的配對遠(yuǎn)端正常組織，采用免疫組織化學(xué)染色方法評估AEG-1表達(dá)和微血管密度（MVD），比較腫瘤組織AEG-1高表達(dá)和低表達(dá)患者臨床病理特征及腫瘤組織MVD。 結(jié)果 NSCLC腫瘤組織AEG-1高表達(dá)55例（59.78%），遠(yuǎn)端正常組織AEG-1高表達(dá)7例（7.61%），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AEG-1高表達(dá)患者與AEG-1低表達(dá)患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。腫瘤組織MVD高于遠(yuǎn)端正常組織（P＜0.05）。AEG-1高表達(dá)患者腫瘤組織MVD高于低表達(dá)患者（P＜0.05）。 結(jié)論 AEG-1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并與腫瘤血管生成密切相關(guān)，靶向抑制NSCLC患者AEG-1的表達(dá)可能是抗腫瘤治療的有效途徑。

AEG-1 非小細(xì)胞肺癌 血管生成 微血管密度 免疫組織化學(xué)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，2015年我國新發(fā)肺癌患者約733 300例，因肺癌致死患者約610 200例[2]，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%[3]，患者5年生存率低。研究表明，血管生成在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，通過抑制血管生成可明顯延緩腫瘤細(xì)胞的增殖、擴散和轉(zhuǎn)移。因此，尋找新的抗血管生成治療靶標(biāo)是NSCLC靶向治療的新突破口。星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（AEG-1）在HIV-I感染或TNF-α誘導(dǎo)的人胚胎星形細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[4]，被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的癌基因。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測NSCLC腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織中AEG-1的表達(dá)，分析其與腫瘤臨床病理特征和血管生成的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年1月至2016年12月本院收治的92例原發(fā)性NSCLC患者的手術(shù)切除標(biāo)本，每例標(biāo)本均留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上的配對遠(yuǎn)端正常組織，甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片用于組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)分析?；颊呔?jīng)病理學(xué)檢查確診NSCLC，臨床資料完整，術(shù)前未接受放化療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 將組織石蠟切片置于65℃烤箱孵育2 h后常規(guī)脫蠟水化，參照Polymer雙染檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號DS-0006）說明書進行免疫組織化學(xué)操作。切片經(jīng)3%H2O2室溫孵育10min后采用高壓修復(fù)法進行抗原修復(fù)（pH6.0的0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓3min）。接著，以等比例羊抗人單克隆抗體AEG-1（英國Abcam公司，批號ab124789，1∶300）和兔抗人單克隆抗體CD105（英國Abcam公司，批號ab11414，1∶200）4℃孵育過夜。次日，滴加適量等比例的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG聚合物與堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物的混合液，覆蓋組織，孵育30min，最后用DAB和玖紅顯色劑分別顯色5～8min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封蠟。

1.3 AEG-1表達(dá)評估 根據(jù)陽性染色腫瘤細(xì)胞的比例和染色強度評估。腫瘤細(xì)胞比例：無陽性腫瘤細(xì)胞計0分，≤10%計1分，10%～50%計2分，＞50%計3分。染色強度：無染色計0分，弱染色（淺黃色）計1分，中等染色（黃棕色）計2分，強染色（棕色）計3分。細(xì)胞比例計分×染色強度計分?jǐn)?shù)為總分，總分0～3分視為AEG-1低表達(dá)，總分4～9分視為AEG-1高表達(dá)。

1.4 微血管密度（MVD）評估 采用血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD105染色方法評估NSCLC腫瘤組織的MVD。任何與相鄰的微血管、腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織明顯分開的被染成紅色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為單個計數(shù)血管。由2位計數(shù)者同時計算200倍放大視野（0.74mm2）下血管最多區(qū)域的血管數(shù)量，取5個視野的平均值作為MVD。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織中AEG-1表達(dá)免疫組織化學(xué)染色所見 見圖1。

圖1 N S C L C腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織中A E G-1表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色所見（a：遠(yuǎn)端正常組織；b：腫瘤組織；免疫組織化學(xué)染色，×2 0 0）

由圖1可見，AEG-1陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)、核膜和細(xì)胞連接處。在遠(yuǎn)端正常組織中AEG-1染色缺失或弱染色；在NSCLC腫瘤組織中AEG-1中等染色，呈黃棕色。NSCLC腫瘤組織 AEG-1高表達(dá) 55例（59.78%），遠(yuǎn)端正常組織AEG-1高表達(dá)7例（7.61%），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 NSCLC腫瘤組織中AEG-1高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較 見表1。

由表1可見，AEG-1高表達(dá)患者與AEG-1低表達(dá)患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。

2.3 NSCLC腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織中MVD比較見圖2。

由圖2可見，CD105陽性染色主要位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，呈紅色。在遠(yuǎn)端正常組織中CD105表達(dá)微弱，MVD為18.59±5.81；在腫瘤組織中CD105陽性表達(dá)強烈，MVD為48.39±16.69；兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AEG-1高表達(dá)、低表達(dá)患者腫瘤組織MVD分別為54.35±16.20、39.54±13.27，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

AEG-1作為一個致癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[4-8]，且其高表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。AEG-1與腫瘤血管生成的研究還未透徹。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察NSCLC腫瘤組織中AEG-1的表達(dá)，并通過血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD105探討AEG-1表達(dá)與血管生成的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC腫瘤組織AEG-1高表達(dá)率明顯高于遠(yuǎn)端正常組織AEG-1高表達(dá)率；AEG-1高表達(dá)患者與AEG-1低表達(dá)患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。這表明，AEG-1高表達(dá)在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，這與Ke等[9]研究結(jié)果相符。

表1 N S C L C腫瘤組織中A E G-1高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較[例（%）]

圖2 N S C L C腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織中M V D比較（a：遠(yuǎn)端正常組織；b：A E G-1低表達(dá)；c：A E G-1高表達(dá)；d：A E G-1高表達(dá)與低表達(dá)比較；C D 1 0 5染色，×2 0 0）

血管生成是指在原有的血管床上生成新血管的過程，主要包括基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管管腔形成及血管重構(gòu)等步驟，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系非常密切，抑制血管生成是腫瘤防治的有效途徑。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，相比NSCLC遠(yuǎn)端正常組織中，腫瘤組織的血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34和CD105表達(dá)均有明顯上調(diào)。Minhajat等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中CD105高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在遠(yuǎn)端正常組織中CD105表達(dá)微弱，在腫瘤組織中CD105陽性表達(dá)強烈，兩者MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；AEG-1高表達(dá)患者腫瘤組織MVD高于AEG-1低表達(dá)患者。這表明，AEG-1可能參與了NSCLC腫瘤組織血管生成的過程。

綜上所述，AEG-1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并與腫瘤血管生成密切相關(guān)，靶向抑制NSCLC患者AEG-1的表達(dá)可能是抗腫瘤治療的有效途徑。

[1]Torre L A,Bray F,Siegel R L,et al.Global cancer statistics,2012 [J].CA:a cancer journalfor clinicians,2015,65(2):87-108.

[2]Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China, 2015[J].CA:a cancer journalfor clinicians,2016,66(2):115-132.

[3]Devesa S S,Bray F,Vizcaino A P,et al.International lung cancer trends by histologic type:male:female differences diminishing and adenocarcinoma rates rising[J].International journal of cancer,2005,117(2):294-299.

[4]Su Z,Kang D,Chen Y,et al.Identification and cloning of human astrocyte genes displaying elevated expression after infection with HIV-1 or exposure to HIV-1 envelope glycoprotein by rapid subtraction hybridization,RaSH[J].Oncogene,2002,12(22)3592-3602.

[5]Gnosa S,Shen YM,Wang C J,et al.Expression of AEG-1 mRNA and protein in colorectal cancer patients and colon cancer cell lines[J].Journalof translationalmedicine,2012,10(1):1.

[6]Huang K,Li L A,Meng Y,et al.High expression of astrocyte elevated gene-1(AEG-1)is associated with progression of cervical intraepithelial neoplasia and unfavorable prognosis in cervical cancer[J].World journalof surgicaloncology,2013,11(1):1.

[7]Wang Y,Jin X,Song H,et al.aeg-1 as a predictor of sensitivity to neoadjuvant chemotherapy in advanced epithelial ovarian cancer [J].OncoTargets and therapy,2016,9(1):2385.

[8]Lu S,Xu J,Xu X,et al.The expression ofastrocyte elevated gene-1 in human non-small-cell lung cancer and its relationship with postoperative chemotherapy and radiotherapy[J].Histopathology,2015,67(6):817-826.

[9]Ke Z,Mao X,Zeng C,et al.AEG-1 expression characteristics in human non-smallcelllung cancer and its relationship with apoptosis[J].MedicalOncology,2013,30(1):1-9.

[10]Zhang C,Liu Y,Guo S,et al.Different biomarkers in non-small cell lung cancer in blood vessel invasion[J].Cell biochemistry and biophysics,2014,70(2):777-784.

[11]Minhajat R,Mori D,Yamasaki F,et al.Organ‐specific endoglin (CD105)expression in the angiogenesis of human cancers[J]. Pathology international,2006,56(12):717-723.

Expression of AEG-1 in non-small cell lung cancer and its relation to clinicopathological features and angiogenesis

MA Zhihong,

CHEN Yingrong,DONG Shunli,et al.Huzhou Key Laboratory of Molecular Medicine,Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China

Objective To investigate the expression of astrocyte elevated gene-1(AEG-1)in non-small cell lung cancer (NSCLC)its relation to clinicopathological features and angiogenesis of tumor. Methods Expression of AEG-1,and intratumoral microvessel density (MVD,labeled by CD105)were assessed by immunohistochemistry in 92 NSCLC tissue specimens and corresponding adjacent normal tissue specimens.The relationship of AEG-1 with MVD and clinicopathological features of NSCLC was analyzed. Results The over-expression rate of AEG-1 NSCLC carcinoma tissue was 59.78%(55/92), which was significantly higher than that in adjacent normal tissue(7.61%,7/92)(P＜0.05).Upregulated expression of AEG-1 was significantly associated with clinical stage(P＜0.05),tumor differentiation(P＜0.05),lymph nodes metastasis(P＜0.05),and higher MVD (P＜0.05)in patients with NSCLC. Conclusion The results suggest that AEG-1 may be involved in malignant transformation and tumor angiogenesis in NSCLC,and targeted inhibition of AEG-1 expression might be a novel strategy for treatment of NSCLC.

Astrocyte elevated gene-1 Non-small cell lung cancer Angiogenesis Intratumoral microvessel density Immunohistochemistry

2 0 1 7-0 2-1 6）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2017- 293

浙江省自然科學(xué)基金青年項目(LQ 14H 160015)；湖州市公益性技術(shù)應(yīng)用研究一般項目(2013G Y 17，2014G Y B 21)

313000湖州市中心醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)重點實驗室（馬志紅、陳瑩蓉、董順利、徐旭婷、戴利成），病理科（劉進、宋鵬濤），心胸外科（李鴻偉）

戴利成，E- m ail：dlc21@ 126.com