郭軍蕊 董曉芳 佟建明(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

枯草芽孢桿菌聯(lián)合苜蓿多糖對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血液指標及糞和腸道微生物區(qū)系的影響

郭軍蕊 董曉芳*佟建明
(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

本試驗旨在研究飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)用對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血液指標及糞和腸道微生物區(qū)系的影響，并觀察枯草芽孢桿菌聯(lián)合苜蓿多糖相較于枯草芽孢桿菌單獨使用是否具有更優(yōu)的效果。試驗選用288只27周齡健康海蘭褐蛋雞隨機分為4個組，每組6個重復，每個重復12只雞。1組為對照組，飼喂基礎飼糧；2～4組分別在基礎飼糧中添加1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌、1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌+250 mg/kg苜蓿多糖、1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌+4 000 mg/kg苜蓿多糖，試驗期為24周。結果表明：1)各組間采食量、蛋重、只產(chǎn)蛋量及死淘率無顯著差異(P>0.05)，但與對照組相比，3、4組第9～16周的產(chǎn)蛋率顯著提高(P<0.05)，2、3、4組第9～16、17～24、1～24周的料蛋比顯著降低(P<0.05)。2)飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋殼顏色、蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋形指數(shù)、蛋白高度和哈夫單位無顯著改善作用(P>0.05)，但顯著提高第1、2、4、12周蛋黃顏色(P<0.05)。3)飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對第2、3、4、12、16、20周血清葡萄糖和第2、3、8、12、20周血清尿素含量有顯著改善作用(P<0.05)，且3組第2、3、4、8周和4組第3、4、8、20周血清葡萄糖含量顯著高于2組(P<0.05)；飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著提高血液白細胞、淋巴細胞、中間細胞和中性粒細胞數(shù)目(P<0.05)，3組第1、3、4、8、12周和4組第3周中間細胞數(shù)目顯著高于2組(P<0.05)，3組第1、3、4、8周和4組第1、3、8周組中性粒細胞數(shù)目顯著高于2組(P<0.05)；飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著提高了第3、16、24周血小板數(shù)目(P<0.05)。飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著提高血清第16周免疫球蛋白A，第1和4周免疫球蛋白G和第2、4、8周免疫球蛋白M含量(P<0.05)，且3、4組優(yōu)于試驗2組(P<0.05)。4)飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著降低了糞中大腸桿菌數(shù)量和盲腸大腸桿菌/乳酸菌值(P<0.05)，顯著提高了空腸、回腸和盲腸雙歧桿菌數(shù)量(P<0.05)。綜上，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用能夠改善蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，降低糞和盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加腸道雙歧桿菌數(shù)量，且聯(lián)合使用效果在改善血清生化指標、調(diào)節(jié)機體免疫功能方面較單獨使用枯草芽孢桿菌有一定優(yōu)勢。

蛋雞；枯草芽孢桿菌；苜蓿多糖；生產(chǎn)性能；蛋品質(zhì)；血液指標；微生物區(qū)系

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖的集約化程度越來越高，且抗生素在動物飼糧中的應用已被許多國家明令禁止，在這個過程中，畜禽將受到養(yǎng)殖環(huán)境與疾病的雙重壓力。因此，尋找安全有效的飼料添加劑引起人們的廣泛關注。益生菌是生產(chǎn)中使用較廣泛的添加劑之一，它可以改善腸道菌群[1]，增強機體免疫力[2]，提高動物生產(chǎn)性能[3-4]。益生元也被證明在改善宿主健康方面具有重要作用。目前，可選擇性刺激乳酸菌和雙歧桿菌生長的低聚糖已被人們所熟知；關于多糖也被大量研究證實在改善生長性能[5]、抗氧化[6-7]、促進有益菌生長[8]及免疫調(diào)節(jié)[9]等方面具有重要作用。雖然關于益生菌與低聚糖聯(lián)合使用在動物生產(chǎn)中的應用已有較多報道，但關于益生菌與多糖之間的協(xié)同作用在蛋雞上的研究較為少見。本試驗旨在探討枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血液指標及糞和腸道微生物區(qū)系的影響，并觀察枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖是否具有協(xié)同作用，兩者聯(lián)合使用相較于枯草芽孢桿菌單獨使用是否可以產(chǎn)生更優(yōu)的效果，以期為其在蛋雞生產(chǎn)中的應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選用288只27周齡產(chǎn)蛋率(92.2%、91.2%、91.7%和92.3%)和體重(1.658～1.679 kg)相近的健康海蘭褐殼蛋雞，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復12只雞。1組為對照組，飼喂基礎飼糧，其參照NRC(1994)營養(yǎng)需要配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。2～4組分別在基礎飼糧中添加1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌、1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌+250 mg/kg苜蓿多糖、1.0×107CFU/g枯草芽孢桿菌+4 000 mg/kg苜蓿多糖。試驗期為24周。

1.2 試驗材料

菌種選用枯草芽孢桿菌CGMCC 1.921，購自中國普通微生物菌種保藏中心，由滄州華雨藥業(yè)有限公司生產(chǎn)制備，活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/g；苜蓿多糖成分：多糖含量為24.28%，黃酮含量為2.90%，皂苷含量為3.47%，粗蛋白質(zhì)含量為15.55%，粗灰分含量為24.35%。

1.3 飼養(yǎng)管理

采用2層籠養(yǎng)，每個重復由相鄰2籠組成(長×寬×高為80 cm×60 cm×50 cm)，每籠6只雞。每日飼喂3次，自由采食；乳頭式飲水器，自由飲水。采用16 h(06：00—22：00)光照，自動控溫、供暖、通風。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)預混料每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diet：VA 8 000 IU，VD33 000 IU，VE 15 IU，VK32.0 mg，VB12.0 mg，VB24.0 mg，VB64.0 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 12 mg，煙酸 nicotinic acid 40 mg，生物素 biotin 0.1 mg，葉酸 folic acid 1.0 mg，VB120.01 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 30 mg，Cu (as copper sulfate) 6.25 mg，Zn (as zinc sulfate) 70 mg，Mn (as manganese sulfate) 63.6 mg，I (as potassium iodide) 0.4 mg，Se (as sodium selenite) 0.2 mg。

2)計算值 Calculated values。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能

試驗期間以重復為單位記錄每天產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、死淘雞只數(shù)，每周結料，稱取并記錄剩余料重，計算產(chǎn)蛋率、采食量、蛋重、料蛋比、只產(chǎn)蛋量和死淘率。

1.4.2 蛋品質(zhì)

試驗開始前(0周，下同)及試驗第1、2、3、4、8、12、16、20和24周，采集當天所有雞蛋進行測定。采用蛋殼顏色測定儀測定蛋殼顏色(QCR，TSS公司，英國)；蛋殼強度測試儀測定蛋殼強度(Model-Ⅲ，Robotmation公司，日本)；采用蛋殼厚度測定儀測定蛋殼厚度(Model P-1，Ozaki MFG公司，日本)；采用卵形系數(shù)測定器測定蛋形指數(shù)(NFN384，F(xiàn)HK公司，日本)；采用蛋品質(zhì)測定儀測定蛋白高度、哈氏單位及蛋黃顏色(EMT-2500，Robotmation公司，日本)。

1.4.3 血液指標

試驗開始前及試驗第1、2、3、4、8、12、16、20和24周，以重復為單位隨機選取4只雞，采血前禁食12 h，自由飲水。通過翅下靜脈采集血液于普通真空采血管中，靜置待有少量血清析出后，2 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中待測。用日本東芝TBA-120FR全自動生化分析儀進行血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、葡萄糖(GLU)、尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)和膽固醇(CHOL)含量的測定。

通過翅下靜脈采集血液分別于5 mL的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采血管和2 mL檸檬酸鈉抗凝真空采血管，輕輕混勻。采用電阻抗法，由江西特康全自動三分群血細胞分析儀(TEK-Ⅱ mini)進行白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)、中間細胞(MID)、中性粒細胞(GRA)、紅細胞(RBC)數(shù)目及紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白(HGB)含量和血小板(PLT)數(shù)目的測定；采用魏氏法，由北京普利生XC-40B全自動紅細胞沉降率測定儀進行紅細胞沉降率(ESR)的測定。

血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按照上海朗頓生物科技有限公司提供的試劑盒進行測定。

1.4.4 微生物區(qū)系檢測

試驗開始前及試驗第1、2、3、4、8、12、16、20和24周，每個重復選取6只雞，收集新鮮糞便，采用平板計數(shù)法對糞便中大腸桿菌進行計數(shù)。大腸桿菌采用伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)。

第24周末，每重復選取1只雞(每組6只)，頸靜脈放血法處死，打開腹腔，結扎空腸、回腸和盲腸并剪下，放置于50 mL滅菌離心管中，立即回實驗室于超凈臺分別采集空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物于滅菌EP管，采用平板計數(shù)法對其乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、彎曲桿菌進行計數(shù)，并計算大腸桿菌/乳酸菌值。乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基計數(shù)，雙歧桿菌采用TPY瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，大腸桿菌采用伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，腸球菌采用Pfizer腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，產(chǎn)氣莢膜梭菌采用胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，彎曲桿菌采用改良Camp-BAP氏瓊脂基礎計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。采用one-way ANOVA方差分析和最小顯著差數(shù)(LSD)法進行多重比較，顯著水平設為P<0.05，試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由圖1可知，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋重、采食量、只產(chǎn)蛋量及死淘率無顯著影響(P>0.05)；對于產(chǎn)蛋率，3、4組第9～16周顯著高于對照組(P<0.05)，但與2組差異不顯著(P>0.05)；對于料蛋比，2、3、4組第9～16、17～24及1～24周顯著低于對照組(P<0.05)，而3個試驗組之間無顯著差異(P>0.05)。上述結果說明，在生產(chǎn)性能方面，飼糧中添加枯草芽孢桿菌聯(lián)合苜蓿多糖沒有產(chǎn)生優(yōu)于單獨使用枯草芽孢桿菌的效果。

2.2 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由圖2可知，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋殼顏色無顯著影響(P>0.05)。對于蛋殼厚度，2、3、4組第1周顯著高于對照組(P<0.05)；2組第3周顯著高于對照組和4組(P<0.05)，與3組差異不顯著(P>0.05)。對于蛋殼強度，2組第8周顯著高于對照組和4組(P<0.05)，3組與對照組和2組差異不顯著(P>0.05)。對于蛋形指數(shù)，2組第20周顯著低于3組(P<0.05)，且2、3組與4組和對照組均無顯著差異(P>0.05)。2、3組第4周的哈夫單位和蛋白高度顯著低于對照組(P<0.05)，且2組顯著高于3組(P<0.05)，并都顯著低于4組(P<0.05)；2、3組第8周哈夫單位顯著低于對照組(P<0.05)，與4組差異不顯著(P>0.05)；3組第24周哈夫單位顯著高于2、4組(P<0.05)，與對照組無顯著差異(P>0.05)。對于蛋黃顏色，試驗開始前2、3、4組顯著低于對照組(P<0.05)，且4組顯著高于3組(P<0.05)，顯著低于2組(P<0.05)；2、3、4組第1周顯著高于對照組(P<0.05)，且3組顯著高于4組(P<0.05)，與2組無顯著差異(P>0.05)；2、4組第2周顯著高于對照組(P<0.05)，與3組無顯著差異(P>0.05)；2、3、4組第4周顯著高于對照組(P<0.05)，且3個試驗組間無顯著差異(P>0.05)；2、3、4組第12周顯著高于對照組(P<0.05)，且2組顯著高于3、4組(P<0.05)；3組第20周顯著低于其他各組(P<0.05)。由此可知，枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對改善蛋黃顏色有一定作用，但兩者聯(lián)合使用較枯草芽孢桿菌單獨使用優(yōu)勢不明顯。

2.3 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血常規(guī)指標的影響

由圖3可知，對于RBC數(shù)目，2(第2、12周)、3(第1、3周)、4(第1、2、3、12周)組顯著低于對照組(P<0.05)，且4組第3周顯著低于2、3組(P<0.05)，其他時間3、4組與2組無顯著差異(P>0.05)；2組第16、20周顯著高于其他各組(P<0.05)。對于HCT，2(第1、2、3、12周)、3(第1周)、4(第1、2、3、12周)組顯著低于對照組(P<0.05)，且4組第3周顯著低于2、3組(P<0.05)；2、3組第20周顯著高于對照組(P<0.05)，而4組顯著低于2組(P<0.05)。對于HGB含量，2(第1、3、12周)、3(第8、20周)、4(第1、2、3、8、12、16、20周)組顯著低于對照組(P<0.05)，2(第16周)、3(第4周)組顯著高于對照組(P<0.05)；3(第16周)、4(第2、8、16、20周)組顯著低于2組(P<0.05)；3組第4周顯著高于2組(P<0.05)。對于PLT數(shù)目，2(第3、16、24周)、3(第3、24周)、4(第3、24周)組顯著高于對照組(P<0.05)。對于WBC數(shù)目，2(第1、3、4、8、16、20、24周)、3(第8、12、20、24周)、4(第0、2、16、20、24周)組顯著高于對照組(P<0.05)；3(第1、3、4、16、20周)、4(第1、3、4、20周)組顯著低于2組(P<0.05)；3(第12周)、4(第0、2、12周)組顯著高于2組(P<0.05)。對于LYM數(shù)目，2(第3、4、8、20、24周)、3(第20、24周)、4(第20、24周)組顯著高于對照組(P<0.05)，3(第3、4、20周)、4(第3、4、8、20周)組顯著低于2組(P<0.05)。對于MID數(shù)目，2(第0、12、16、20、24周)、3(第1、3、4、8、12、16、24周)、4(第0、1、3、12、16周)組顯著高于對照組(P<0.05)，3(第1、3、4、8、12周)、4(第0、3周)組顯著高于2組(P<0.05)；3、4組第16周顯著低于2組(P<0.05)。對于NEU數(shù)目，2(第0、12、16、24周)、3(第1、4、8、12、16、20、24周)、4(第8、12、16、24周)組顯著高于對照組(P<0.05)，3(第1、3、4、8周)、4(第1、3、8周)組顯著高于2組(P<0.05)。對于ESR，2(第3、20周)、3(第8、20周)、4(第3、8、20、24周)組顯著高于對照組(P<0.05)；2組第3周顯著高于其他各組(P<0.05)。由上可知，與單獨添加枯草芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著提高了血液MID、NEU數(shù)目，而對其他血液指標沒有產(chǎn)生顯著影響。

2.4 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血清生化指標的影響

由圖4可知，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對血清ALT活性和TG含量無顯著影響(P>0.05)。對于AST活性，2、4組第8周顯著高于對照組(P<0.05)，與3組無顯著差異(P>0.05)。對于TP和GLB含量，3、4組第3周顯著高于其他各組(P<0.05)。對于ALB含量，3組第4周顯著低于對照組(P<0.05)，且4組顯著低于3組(P<0.05)。對于ALB/GLB值，2、3、4組第2周與對照組差異不顯著(P>0.05)；3、4組第3周顯著低于其他各組(P<0.05)；4組第4周顯著低于對照組(P<0.05)。對于TBIL含量，3組第1周顯著高于其他各組(P<0.05)；2、3、4組第3周顯著低于對照組(P<0.05)；3、4組第4周顯著低于對照組(P<0.05)，且4組顯著低于2、3組(P<0.05)。對于GLU含量，2(第8周)、3(第1、8、24周)、4(第24周)組顯著低于對照組(P<0.05)；2(第2、3、12、16周)、3(第2、3、4、12周)、4(第2、3、4、8、12、16、20周)組顯著高于對照組(P<0.05)，且3(第2、3、4、12周)、4(第3、4、8、12、20周)組高于2組(P<0.05)。對于UREA含量，3(第4周)、4(第4、16周)組顯著高于對照組(P<0.05)，2(第3、12周)、3(第2、3、12周)、4(第3、8、12、20周)組顯著低于對照組(P<0.05)；且3(第2周)、4(第8、20周)組低于2組(P<0.05)。對于UA含量，2、4組第3周顯著低于對照組(P<0.05)。對于CHOL含量，3組第1周顯著高于對照組和4組(P<0.05)。對于CREA含量，2組第1、2周顯著低于對照組(P<0.05)；3(第2、3、4周)、4(第4周)組顯著高于對照組(P<0.05)。綜上，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對血清ALT、AST活性及TP、ALB、GLB、TBIL、UA、CREA、CHOL、TG含量及ALB/GLB值無顯著影響，但對血清GLU、UREA含量有一定改善作用，且枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖聯(lián)合使用對改善血清GLU含量具有一定優(yōu)勢。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

Fig.1 Effects ofBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharides on performance of laying hens

圖2 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

續(xù)圖3

圖3 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血常規(guī)指標的影響

續(xù)圖4

續(xù)圖4

圖4 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血清生化指標的影響

2.5 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響

由圖5可知，對于IgA含量，4組第1周顯著低于3組(P<0.05)，與其他2組差異不顯著(P>0.05)；2、3、4組第16周顯著高于對照組(P<0.05)。對于IgG含量，3(第1、4周)、4(第4周)組顯著高于對照組(P<0.05)，且3(第1周)、4組(第4周)顯著高于2組(P<0.05)。對于IgM含量，3、4組第2、4、8周顯著高于對照組和2組(P<0.05)。由上可知，與單獨添加枯草芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖聯(lián)合使用顯著提高了血清免疫球蛋白含量。

2.6 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞糞和腸道微生物區(qū)系的影響

由圖6可知，與對照組相比，2(第1、12、20周)、3(第12周)、4組(第3、20周)大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，3、4組第1周顯著高于2組(P<0.05)。由圖7可知，飼糧中添加枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖對盲腸乳酸菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌和腸球菌及空腸、回腸的乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)；2、4組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)；2、3組盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著低于4組(P<0.05)，且大腸桿菌/乳酸菌值顯著低于對照組(P<0.05)，而4組大腸桿菌/乳酸菌值與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；2、3、4組空腸、回腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)，而3個試驗組間無顯著差異(P>0.05)。由上可知，在糞和腸道微生物區(qū)系方面，枯草芽孢桿菌聯(lián)合苜蓿多糖沒有產(chǎn)生優(yōu)于單獨使用枯草芽孢桿菌的效果。

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

飼糧中添加益生菌可以提高動物機體消化酶的活性[10]，增強對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[11-12]，從而提高動物的生產(chǎn)性能[13]。本實驗室研究表明，苜蓿多糖可以提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和只產(chǎn)蛋量[14]。Geng等[15]飼喂軍曹魚殼聚糖+枯草芽孢桿菌以及Fan等[16]飼喂海參黃芪多糖+茯苓多糖+枯草芽孢桿菌均顯著提高了比生長速率。合生元對促進動物生長有明顯作用[17]，可能是因為益生元促進了益生菌的生長[18-20]，為其改善腸道結構或腸道菌群提供了條件[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌+苜蓿多糖可顯著降低料蛋比，但兩者間無顯著差異，即枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖聯(lián)合使用沒有產(chǎn)生優(yōu)于枯草芽孢桿菌單獨添加的效果。李樹鵬[22]研究表明，益生菌及其與黃芪多糖(含量為36.12%)聯(lián)合使用均能顯著提高蛋雛雞周增重，降低料重比，但未發(fā)現(xiàn)合生元組生產(chǎn)性能與益生菌組有顯著差異，與本試驗結果相似。多糖與益生菌聯(lián)合使用對動物生產(chǎn)性能的影響可能與飼養(yǎng)環(huán)境、生理狀態(tài)以及多糖本身的性質(zhì)等有關。目前關于這方面的報道較為少見，其兩者聯(lián)合使用對動物生產(chǎn)性能的影響機制尚不清楚。

圖5 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響

圖6 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞糞中大腸桿菌數(shù)量的影響

圖7 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞腸道微生物區(qū)系的影響

3.2 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

益生菌對蛋品質(zhì)的影響報道不盡一致。雷凱[23]研究表明，蛋雞飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以改善蛋殼厚度、蛋殼強度、哈夫單位、蛋白高度和蛋黃顏色，而Tang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加益生菌制劑(嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、兩岐雙歧桿菌、糞鏈球菌、米曲霉)對蛋殼厚度、哈夫單位、蛋黃顏色無顯著影響。王翠菊等[25]和辛小青等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖和苜蓿多糖對改善蛋黃顏色、蛋白高度、哈夫單位及蛋殼厚度有一定作用。但關于多糖與益生菌聯(lián)合使用對蛋品質(zhì)的影響尚未見報道。本試驗研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋殼顏色、蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋形指數(shù)、蛋白高度及哈夫單位沒有顯著改善作用，但在一定程度上提高了蛋黃顏色。蛋黃顏色決定于飼糧中的類胡蘿卜素含量，任何阻礙類胡蘿卜素吸收及沉積的因素都將導致蛋黃顏色變淺[26]。因此，本試驗蛋黃顏色的改善可能是因為添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用促進了類胡蘿卜素的吸收和沉積。也有結果表明，枯草芽孢桿菌[27-28]和苜蓿多糖[29]有抗氧化的作用，所以也可能是其抗氧化作用保護了更多類胡蘿卜素不被氧化，增加了色素的沉積，從而改善蛋黃顏色，但具體作用機制尚需進一步研究。

3.3 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞血清生化指標的影響

ALT和AST主要存在于肝細胞中，ALT主要存在于細胞漿，AST主要存在于細胞漿的線粒體，當細胞損傷時，ALT首先進入血液，若細胞損傷嚴重危及線粒體時，則AST進入血液，引起血液ALT和AST活性升高。本試驗結果表明，添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對ALT和AST活性影響不大。血清TP、ALB、GLB、TBIL含量及ALB/GLB值也是衡量肝臟功能是否正常的關鍵指標。對于血清TP、ALB、GLB含量及ALB/GLB值，各試驗組與對照組之間總體上沒有大的差異；2(第3周)、3(第3、4周)、4(第3、4周)組顯著降低血清TBIL含量，提示添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用未對肝臟造成不良影響。研究表明，飼糧中添加益生菌(乳酸菌和芽孢桿菌)和合生元(益生菌+黃芪多糖)對血清AST活性和TP含量無顯著影響[30]，這與本試驗結果相一致。飼糧中添加枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌+苜蓿多糖可升高血清中GLU含量，且枯草芽孢桿菌+250 mg/kg苜蓿多糖組(第2、3、4、8周)和枯草芽孢桿菌+4 000 mg/kg苜蓿多糖組(第3、4、8、20周)顯著高于枯草芽孢桿菌組。說明枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖加強了糖原的分解或者促進了糖異生的發(fā)生，也可能與增強了腸道中淀粉酶等的活性有關。而李亞杰等[31]研究表明，肉雞飼糧中添加益生菌(芽孢桿菌、乳酸菌)和合生元(益生菌+黃芪多糖)降低了血清GLU含量。本試驗結果表明，添加枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖對TG和CHOL的含量無顯著影響，這與李亞杰等[31]的研究結果一致。另外，添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對UA、CREA含量影響不大，但顯著降低了UREA含量，且枯草芽孢桿菌+250 mg/kg苜蓿多糖組(2周)和枯草芽孢桿菌+4 000 mg/kg苜蓿多糖組(第8、20周)顯著低于枯草芽孢桿菌組。上述結果提示枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖的添加一方面提高了飼料氮的利用，另一方面也說明了在一定程度上具有保護腎臟的作用，且兩者具有協(xié)同作用。多糖與益生菌聯(lián)合使用對血清UREA和UA含量等的影響鮮有報道，但Fallah等[32]飼喂雛鴕鳥屎腸球菌+低聚果糖+海藻糖可升高血清GLU含量，降低UA含量，提示苜蓿多糖可能也是一種潛在的益生元。

3.4 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞免疫功能的影響

白細胞作為機體防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，具有吞噬病原體、防御疾病等作用。廉新慧等[33]研究表明，益生菌(芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌)+酵母多糖組顯著提高10日齡海蘭褐蛋雞血液WBC數(shù)目，益生菌+黃芪多糖組顯著提高40和50日齡海蘭褐蛋雞血液WBC數(shù)目，但益生菌組與對照組無顯著差異。本試驗研究表明，添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對提高血液WBC、LYB、MID、NEU數(shù)目有一定作用，且枯草芽孢桿菌+苜蓿多糖組MID(第1、3、4、8、12周)和NEU(第1、3、4、8周)數(shù)目顯著高于枯草芽孢桿菌組。Hassaan等[34]報道添加地衣芽孢桿菌和酵母提取物可以顯著提高WBC數(shù)目，且地衣芽孢桿菌+酵母提取物組WBC數(shù)目顯著高于地衣芽孢桿菌組；對RBC和HGB數(shù)目有一定提高；對于HCT，2.4×105CFU/g地衣芽孢桿菌+酵母提取物組顯著低于對照組和地衣芽孢桿菌組，4.8×105CFU/g地衣芽孢桿菌+酵母提取物組顯著高于對照組和地衣芽孢桿菌組。而廉新慧等[33]研究表明，添加益生菌(芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌)和酵母多糖/黃芪多糖組對RBC數(shù)目無顯著影響。本研究表明，添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對血液RBC、HGB數(shù)目和HCT影響效果不顯著，但對PLT數(shù)目有一定提高。而Elzey等[35]報道血小板在免疫系統(tǒng)中也具有重要作用。此外，飼糧中添加枯草芽孢桿菌和苜蓿多糖提高了血清IgA(第1、16周)、IgG(第1、4周)和IgM(第2、4、8周)含量。免疫球蛋白是B細胞經(jīng)抗原刺激后分化增殖產(chǎn)生的，參與補體激活及毒素的中和等途徑，其含量高低反映機體免疫力的強弱。王曉慧[36]研究結果顯示人參多糖聯(lián)合植物乳桿菌C88可顯著提高免疫抑制小鼠血清IgG的含量。邵麗瑋[37]在蛋雛雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌+刺五加多糖顯著提高了血清IgA、IgM和IgG的含量。本研究表明，枯草芽孢桿菌+苜蓿多糖組較枯草芽孢桿菌組有明顯優(yōu)勢，表明苜蓿多糖聯(lián)合枯草芽孢桿菌可增強體液免疫。

3.5 枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對蛋雞糞和腸道微生物區(qū)系的影響

本試驗結果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對降低糞和盲腸大腸桿菌數(shù)量、提高腸道乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量有顯著作用。胡美娟[38]研究表明，香菇多糖和植物乳桿菌C88的聯(lián)合使用可顯著提高乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低腸球菌、腸桿菌數(shù)量，有效改善小鼠腸道菌群，且優(yōu)于單獨使用植物乳桿菌C88。Li等[39]研究表明，添加益生菌(乳酸菌和蠟樣芽孢桿菌)與合生元(益生菌+黃芪多糖)顯著增加了21、42日齡回腸和盲腸乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低了大腸桿菌數(shù)量；且盲腸合生元組顯著優(yōu)于益生菌組；而回腸合生元組雙歧桿菌數(shù)量顯著高于益生菌組，大腸桿菌數(shù)量兩組間無顯著差異，21日齡回腸合生元組乳酸菌數(shù)量與益生菌組無顯著差異，42日齡顯著高于益生菌組。Calik等[40]研究表明，孵化過程中注射屎腸球菌+菊糖與出殼后飼喂均可增加21日齡盲腸乳酸菌數(shù)量，降低42日齡盲腸腸桿菌數(shù)量，且在21日齡時孵化中和出殼后均給予或僅在孵化中給予屎腸球菌+菊糖盲腸乳酸菌數(shù)量顯著高于僅出殼后給予，提示動物本身的生理狀態(tài)可能是影響合生元發(fā)揮調(diào)節(jié)微生物區(qū)系作用的原因之一。

4 結 論

① 飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用可以降低料蛋比，對提高產(chǎn)蛋率和蛋黃顏色有一定作用，但枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖聯(lián)合使用相較于枯草芽孢桿菌單獨使用并未有更優(yōu)的效果。

② 飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用可以改善血清生化及血常規(guī)指標；在一定程度上可以提高蛋雞的免疫力，且聯(lián)合使用效果有明顯優(yōu)勢。

③ 飼糧中添加枯草芽孢桿菌及其與苜蓿多糖聯(lián)合使用對糞和盲腸大腸桿菌數(shù)量有顯著降低，可增加腸道雙歧桿菌數(shù)量，降低盲腸大腸桿菌/乳酸菌值，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，但聯(lián)合使用與單獨使用沒有顯著差異。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: xiaofangd1124@sina.com

(責任編輯 田艷明)

Effects ofBacillussubtilisand Alfalfa Polysaccharide on Performance, Egg Quality, Blood Indices and Fecal and Intestinal Microbial Flora of Laying Hens

GUO Junrui DONG Xiaofang*TONG Jianming
(InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The study was conducted to investigate the effects of dietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide on performance, egg quality, blood indices and fecal and intestinal microbial flora of laying hens, and to evaluate whether the combination effects were better than that ofBacillussubtilisalone or not. Two hundred and eighty-eight 27-week-old healthy Hy-Line Brown laying hens were randomly allocated into 4 groups with 6 replicates of 12 birds in each for 24 weeks. The diets were formulated by addingBacillussubtilisand alfalfa polysaccharides to a basal diet: control group was fed with the basal diet (group 1), experimental groups were supplemented with 1.0×107CFU/gBacillussubtilis(group 2), 1.0×107CFU/gBacillussubtilis+250 mg/kg alfalfa polysaccharides (group 3) and 1.0×107CFU/gBacillussubtilis+4 000 mg/kg alfalfa polysaccharides (group 4). The results showed as follows: 1) there were no significant differences in feed intake, egg weight, egg weight per hen and mortality among all groups (P>0.05). However, the egg production in groups 3 and 4 during 9 to 16 weeks was significantly increased (P<0.05) and the ratio of feed to egg in groups 2, 3 and 4 during 9 to 16, 17 to 24 and 1 to 24 weeks was significantly decreased (P<0.05) compared with the control group. 2) DietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide had no significant effects on eggshell color, eggshell thickness, eggshell strength, egg shape index, albumen height and Haugh unit (P>0.05), but significantly improved egg yolk color at 1, 2, 4 and 12 weeks (P<0.05). 3) DietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide had significantly improved effects on serum glucose content at 2, 3, 4, 12, 16 and 20 weeks and serum urea content at 2, 3, 8, 12 and 20 weeks (P<0.05), and serum glucose content in group 3 at 2, 3, 4 and 8 weeks and group 4 at 3, 4, 8 and 20 weeks was increased significantly compared with group 2 (P<0.05). DietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide significantly increased counts of blood leucocytes, lymphocytes, intermediate cell and neutrophils (P<0.05), intermediate cell count in group 3 at 1, 3, 4, 8 and 12 weeks and group 4 at 3 weeks was significantly higher than that in group 2 (P<0.05), and neutrophils count in group 3 at 1, 3, 4 and 8 weeks and group 4 at 1, 3 and 8 weeks was significantly higher than that in group 2 (P<0.05). Meanwhile, dietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide significantly increased platelet count at 3, 16 and 24 weeks (P<0.05). DietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide significantly increased serum immunoglobulin A content at 16 weeks, immunoglobulin G content at 1 and 4 weeks and immunoglobulin M content at 2, 4 and 8 (P<0.05), and the improved effects in groups 3 and 4 were better than those in group 2 (P<0.05). 4) DietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide significantly decreased fecalEscherichiacolicount and the ratio ofEscherichiacolitoLactobacillusincecum(P<0.05), significantly increased jejunal, ileal and cecalBifidobacteriumcount (P<0.05). Accordingly, dietaryBacillussubtilisand its combination with alfalfa polysaccharide can improve performance and egg quality, reduce fecal and cecalEscherichiacolicount and increase intestinalBifidobacteriumcount of laying hens. Additionally, the effects of combination ofBacillussubtilisand alfalfa polysaccharide on improving serum biochemical indices and enhancing immunity are superior toBacillussubtilis.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：1687-1703]

laying hens;Bacillussubtilis; alfalfa polysaccharide; performance; egg quality; blood indices; microbial flora

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.029

2016-11-10

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2013BAD10B04)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項經(jīng)費(CARS-41-K16)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS08)

郭軍蕊(1988—)，女，河南新鄉(xiāng)人，博士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail： gjr217@yeah.net

*通信作者：董曉芳，副研究員，碩士生導師，E-mail： xiaofangd1124@sina.com

S816.7

A

1006-267X(2017)05-1687-17