屈 戀,高 璇,劉雄民,劉田元,賴 芳

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530004)

檸檬桉果實(shí)單寧的提取純化及抗氧化活性

屈 戀,高 璇,劉雄民*,劉田元,賴 芳

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530004)

采用超聲波輔助提取法對(duì)檸檬桉果實(shí)中的單寧進(jìn)行提取,比較溶劑提取法和超聲波輔助提取法的得率。用溶劑法、大孔吸附樹脂法及兩種方法聯(lián)用純化粗提物,并考察了單寧的總抗氧化性、對(duì)DPPH·和·OH自由基的清除能力。結(jié)果表明,檸檬桉果實(shí)單寧的超聲輔助提取得率為9.43%。大孔吸附樹脂純化的最佳工藝參數(shù)為:以X-5樹脂為吸附樹脂,上樣流速1.0 mg/mL、上樣質(zhì)量濃度0.6 mg/mL、洗脫流速1.5 mg/mL、乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)60%。乙酸乙酯萃取物、大孔樹脂純化物、乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化物、乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化物大孔吸附樹脂的純度分別為32.05%、58.52%、83.07%、85.31%,大孔樹脂純化物的總抗氧化性最大,為單寧酸的135.47%;在濃度為0.01 mg/mL時(shí),粗提物和上述樣品對(duì)DPPH·清除率達(dá)到最大,分別為66.09%、52.48%、92.18%、44.10%、44.09%;而在濃度1.0 mg/mL時(shí),對(duì)·OH自由基的清除率分別為67.92%、58.17%、68.12%、61.68%、74.61%。

檸檬桉果實(shí),單寧,純化,抗氧化

檸檬桉(Eucalyptuscitriodora),廣泛種植于廣西、廣東及福建、浙江、云南、四川等地,是良好的速生用材樹種和很好的芳香油樹種[1]。檸檬桉化學(xué)成分研究集中于枝葉,其揮發(fā)油的主要化學(xué)成分是香茅醛、香茅醇、異胡薄荷醇和乙酸香茅酯[2-6]。此外,對(duì)檸檬桉果實(shí)的揮發(fā)油也做了相應(yīng)的研究,其主要成分是1R-α-蒎烯、γ-松油烯、石竹烯[7]。單寧(Tannins),又名鞣質(zhì),是一種廣泛存在于植物葉、皮、莖、果實(shí)中的物質(zhì),單寧是多酚中高度聚合的化合物,根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特性分為縮合單寧和水解單寧兩大類。單寧富有多種獨(dú)特的生理活性,如抗菌、抗氧化和抗過敏作用。李麗等[8]研究了香蕉皮中單寧的抗菌作用,發(fā)現(xiàn)在相同的抑菌條件下,香蕉皮單寧的抑菌效果比常用的苯甲酸鈉好,對(duì)酵母菌的抑制作用較強(qiáng),其次是霉菌和細(xì)菌。王川等[9]對(duì)葡萄籽單寧的抗氧化能力和清除活性氧自由基的能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明葡萄籽單寧能提高豬油和芝麻油的抗氧化能力,而且效果強(qiáng)于檸檬酸和VC。葡萄籽單寧對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基具有一定的清除能力,清除效果要優(yōu)于常用的苯甲酸和甘露醇。顧海峰[10]等制備了不同分子量的柿子單寧,并研究其抗氧化活性發(fā)現(xiàn)高分子量柿單寧具有較強(qiáng)清除自由基能力。楊文錕等[11]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)柿子單寧的濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí),對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率能達(dá)到95%,表明柿子單寧有很強(qiáng)的抗過敏活性。單寧類物質(zhì)主要為多酚基抗氧化化合物,該物質(zhì)被證實(shí)可以使肌體免于自由基介導(dǎo)損傷而減小慢性疾病的威脅[12],所以單寧被認(rèn)為還具有抗誘變、抗癌等作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取的方法對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧進(jìn)行提取,分別采用乙酸乙酯萃取法、大孔吸附樹脂純化法、乙酸乙酯萃取法和大孔吸附樹脂純化法聯(lián)用分離純化檸檬桉果實(shí)粗提物,考察不同純度單寧的總抗氧化性和清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的能力,評(píng)價(jià)其抗氧化性能,為檸檬桉果實(shí)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬桉果實(shí) 2015年7月采自廣西大學(xué)西校園;二苯代苦味肼基(DPPH·) 購于Sigma公司;AB-8、S-8、X-5、D101、HPD826、HPD400 南開大學(xué)化工廠;單寧酸標(biāo)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;抗壞血酸 分析純,上海試四赫維化工有限公司;無水乙醇、無水碳酸鈉、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、磷酸鈉、鉬酸銨 分析純,廣東光華科技股份有限公司。

KQ-600DB型數(shù)控超聲清洗器 云南昆山超聲儀器有限公司;Agilent-8453E型紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)安捷倫公司;HL-2恒流泵 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬桉果實(shí)單寧提取方法的篩選

1.2.1.1 脫脂檸檬桉果實(shí)粉末的制備 參考文獻(xiàn)[14-15]中的方法,取新鮮的檸檬桉果實(shí)在恒溫干燥箱中60 ℃烘干,將其粉碎過40目篩,得到干燥的檸檬桉果實(shí)粉末原料。稱取100.0 g干燥檸檬桉果實(shí)粉末按1∶4料液比加入石油醚在70 ℃油浴條件下對(duì)原料進(jìn)行回流脫脂,干燥密封保存。

1.2.1.2 超聲提取法 取5.0 g脫脂后檸檬桉果實(shí)粉末,以1∶20料液比加入50%的乙醇水溶液,超聲功率800 W,63 ℃下提取45 min,離心過濾得到粗提液。

1.2.1.3 乙醇提取法 取5.0 g脫脂后檸檬桉果實(shí)粉末,以1∶20料液比加入50%的乙醇水溶液,63 ℃下提取45 min,比較兩者的單寧得率。

1.2.2 單寧的定性和定量分析

1.2.2.1 粗提液的定性分析 粗提液和單寧酸標(biāo)液分別滴加1%的明膠溶液,觀察溶液顏色的變化。粗提液和單寧酸標(biāo)液分別滴加0.3% FeCl3溶液,觀察溶液顏色的變化。37%～40%的甲醛1 mL和濃鹽酸2 mL加入粗提液中,沸水浴30 min,觀察是否出現(xiàn)沉淀。

1.2.2.2 粗提液的定量分析 根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法,取0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg·mL-1系列濃度的單寧酸于25 mL容量瓶中,采用福林酚法顯色,紫外可見分光光度計(jì)在500～900 nm范圍掃描最大吸收波長(zhǎng),再在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定系列標(biāo)液吸光度。以單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度m(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。量取一定體積提取液,用福林酚法顯色后,測(cè)定其在工作波長(zhǎng)處的吸光值,根據(jù)線性方程及公式(1)計(jì)算檸檬桉果實(shí)中單寧的得率。

式(1)

式中,V為容量瓶的體積(25 mL);W為檸檬桉果實(shí)中單寧得率(%);m為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的提取液中所含單寧的含量(mg·mL-1);V1為提取液的總體積(mL);V2為測(cè)定時(shí)所取提取液的體積(mL);M為檸檬桉果實(shí)的質(zhì)量(g)。

1.2.3 檸檬桉果實(shí)單寧樣品的分離與純化

1.2.3.1 乙酸乙酯萃取 100 mL粗提液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出溶劑后40 ℃干燥。干燥后的粗提物用適量50%乙醇溶解后,緩緩加入無水乙醇,邊加邊攪拌使得最終乙醇水體積比為9∶1,充分?jǐn)嚢韬?在室溫下靜置24 h后,離心(4200 r·min-1,10 min),40 ℃下回收乙醇。用等體積的石油醚萃取3次,收集水相,水相用等體積氯仿萃取3次,收集水相,再用等體積的乙酸乙酯萃取6次,合并6次萃取的乙酸乙酯相,收集乙酸乙酯相和乙酸乙酯萃余相,分別在40 ℃下回收乙酸乙酯,40 ℃恒溫烘干得到檸檬桉果實(shí)單寧的乙酸乙酯萃取相和乙酸乙酯萃余相純化樣品[14-15]。將乙酸乙酯萃取和萃余相溶解通過大孔樹脂純化后,得到萃取經(jīng)大孔樹脂純化物和萃余經(jīng)大孔樹脂純化物。

1.2.3.2 大孔樹脂的靜態(tài)篩選 稱取已預(yù)處理的X-5、HPD826、D-101、S-8、HPD400和AB-8型樹脂各2 g,分別裝入250 mL錐形瓶中,然后加入50 mL質(zhì)量濃度為10.59 mg/mL的單寧粗提液,置于搖床中,溫度為30 ℃,振蕩速率為110 r·min-1,振蕩24 h后過濾,然后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇50 mL洗脫樹脂,分別測(cè)定濾液及洗脫液中單寧的含量,計(jì)算樹脂的吸附率、解吸率及回收量,選出最佳大孔吸附樹脂。

稱取6份2 g已預(yù)處理的X-5大孔吸附樹脂,分別裝入250 mL錐形瓶中,然后加入50 mL已知質(zhì)量濃度的單寧粗提液,置于搖床中,溫度為30 ℃,振蕩速率為110 r·min-1,振蕩24 h后過濾,然后改變洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%),測(cè)定樹脂的解析率,確定最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

式(2)

式(3)

回收量(mg)=洗脫液中單寧的含量(mg)

1.2.3.3 X-5樹脂對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧的分離工藝考察 稱取10 g已預(yù)處理的X-5大孔吸附樹脂,濕法裝柱。每次量取100 mL樣品溶液上柱,收集流出液。參考其他文獻(xiàn)并且結(jié)合檸檬桉果實(shí)粗提液的含量,上樣濃度為0.59 mg/mL,通過改變上樣液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min),以吸附率為指標(biāo),確定最佳上樣流速;

上樣流速為1.0 mL/min,改變上樣液質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),通過吸附率和吸附量的選擇,確定最佳上樣質(zhì)量濃度;

以0.6 mg/mL上樣質(zhì)量濃度和1.0 mL/min上樣濃度上樣,吸附完成后,通過改變洗脫流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min),通過解吸率確定最適洗脫流速。

1.2.3.4 各純化樣品的純度測(cè)定 通過不同的純化方法得到不同的純化樣品,采用福林酚法測(cè)定其中單寧的含量,取一定體積的各純化物樣品于事先稱重的培養(yǎng)皿中,烘干至恒重,計(jì)算單寧占純化樣品總質(zhì)量的比例,即為單寧的純度。

純度(%)=一定體積純化樣品中單寧的含量(mg)/一定體積純化樣品的總質(zhì)量(mg)

式(4)

1.2.4 單寧的抗氧化性的測(cè)定

1.2.4.1 總抗氧化性的測(cè)定 依次取10 mL的刻度試管分別編號(hào),各加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL,再分別加入0.6 mol/L濃硫酸、28 mmol/L鉬酸銨、4 mmol/L磷酸鈉各2.0 mL,混勻后于95 ℃溫度下,水浴90 min,在695 nm處測(cè)定其吸光度,每個(gè)濃度平行測(cè)定3次,取平均值。以單寧酸作為對(duì)照,以蒸餾水作參比液,吸光度越大,總抗氧化能力越強(qiáng)[16-17]。

1.2.4.2 DPPH·的清除作用 配制濃度為4×10-3mol/L DPPH·無水乙醇溶液。取樣品溶液2 mL和2 mL DPPH·溶液搖勻后,放置30 min,以蒸餾水和乙醇1∶1比例做空白,在517 nm處測(cè)定吸光度記為A1,2 mL蒸餾水加DPPH·溶液,搖勻,在517 nm測(cè)定吸光度A0,2 mL樣品溶液加2 mL蒸餾水,搖勻,在517 nm測(cè)定吸光度A2。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次,取平均值。以單寧酸作為對(duì)照[18-21],依照上述方法測(cè)定,根據(jù)公式(2)分別計(jì)算樣液和單寧酸對(duì)DPPH·的清除率:

式(5)

式中,A1為樣品對(duì)DPPH·作用后的吸光度數(shù)值；A2為樣品自身的吸光度;A0為DPPH·本身吸收數(shù)值。清除率越大,說明樣品對(duì)DPPH·的清除效果越好。

1.2.4.3 ·OH的清除作用 參考文獻(xiàn)[15]中的方法,用蒸餾水分別配制9 mmol/L的FeSO4溶液和9 mmol/L的過氧化氫溶液;用無水乙醇配制9 mmol/L的水楊酸溶液[14-15,19]。測(cè)定各樣液對(duì)·OH的清除作用。清除率越大,說明樣品對(duì)·OH的清除效果越好。清除自由基活力SA(Scavenging activity)可用公式(6)表示:

式(6)

式中,Ai為加入待測(cè)液的吸光度；Aj為加入待測(cè)液不加的吸光度;Ac為不加待測(cè)液時(shí)的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照對(duì)應(yīng)公式進(jìn)行計(jì)算,平行測(cè)定三次,并用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬桉果實(shí)單寧的提取方法

單寧常用的提取方法有:溶劑法、超聲波輔助提取和微波輔助提取等。本文主要采用超聲波輔助提取,但也考察了溶劑法對(duì)檸檬桉果實(shí)中單寧的提取。乙醇提取法和超聲波輔助提取法兩種方法單寧的得率分別為:4.69%和9.43%。提取結(jié)果說明在1∶20的料液,50%的乙醇水溶液,提取溫度63 ℃條件下提取時(shí)間45 min,相同提取條件下,采用超聲波輔助提取可以較大的提高單寧的得率,在一定程度上減少單寧的提取時(shí)間,提高工作效率;從另一方面來說,提取時(shí)間的減少也可以降低溫度對(duì)單寧結(jié)構(gòu)的影響,從而保證單寧的結(jié)構(gòu)特性,保持其活性。

2.2 單寧的定性與定量分析

2.2.1 單寧的定性分析 加入1%的明膠溶液后,單寧酸和粗提液中均出現(xiàn)了白色的絮狀物;加入0.3% FeCl3溶液后,單寧酸和粗提液中均變?yōu)槟G色,兩者都呈現(xiàn)出了單寧的顯色特征,證明了粗提物中含有單寧類物質(zhì)。甲醛加濃鹽酸和粗提液沸水浴反應(yīng)后,溶液出現(xiàn)紅色沉淀,證明粗提物中為縮合單寧。

2.2.2 單寧的定量分析 經(jīng)福林酚法對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧粗提物和單寧酸標(biāo)品顯色后,用紫外分光光度計(jì)在650～850 nm處掃描，結(jié)果如圖1所示。檸檬桉果實(shí)的提取物與單寧酸的光譜特征相似,說明樣品中含有單寧類物質(zhì)。

圖1 單寧酸、粗提物溶液的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 The Uv-vis absorption spectra of tannic acid and sample solution注：1-單寧酸;2-粗提物。

表1 6種大孔樹脂對(duì)樣品中單寧的靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果Table 1 Results of adsorption and desorption for tannin six types resin

經(jīng)福林酚法顯色后,單寧酸標(biāo)品在760 nm處有最大吸收,粗提液也在此處有最大吸收,所以采用單寧酸作為檸檬桉果實(shí)單寧的對(duì)照品。以吸光值A(chǔ)和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度m得到回歸方程為:A=93.781m+0. 0584(R2=0.9995),A為吸光度,m為單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。由此可得檸檬桉果實(shí)中單寧的含量為9.43%。

2.3 檸檬桉果實(shí)單寧分離純化工藝

2.3.1 大孔樹脂的靜態(tài)篩選 以樹脂對(duì)單寧的吸附能力與解吸能力為指標(biāo),通過樹脂靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)選擇樹脂類型,結(jié)果如表1所示。在實(shí)驗(yàn)條件下,X-5型樹脂對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧的吸附效果最好,吸附率為85.99%,解吸率為93.47%。S-8型樹脂雖然解吸率最高98.52%,但總的回收量低于X-5型樹脂。綜合比較,選擇X-5型大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 洗脫劑乙醇濃度對(duì)樹脂靜態(tài)解吸的影響 檸檬桉果實(shí)單寧經(jīng)過大孔樹脂吸附后,要達(dá)到純化的目的就要將其從樹脂中洗脫下來。常見的洗脫劑有水、甲醇、丙酮和乙醇,考慮到成本以及毒理性[21],所以采用乙醇水溶液,并研究乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響,結(jié)果見圖2。因?yàn)閱螌幓衔锱c大孔樹脂之間能產(chǎn)生強(qiáng)烈的氫鍵作用,用水作為洗脫劑并不能將其從大孔樹脂上完全洗脫,體積分?jǐn)?shù)低的乙醇溶液只能洗脫少部分的單寧,并且隨著乙醇濃度的上升,解吸率增加,在60%時(shí)達(dá)到最大,之后稍有下降,故選擇60%的乙醇為最適宜洗脫劑濃度。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧靜態(tài)解吸的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on static desorption efficiency

2.3.3 X-5樹脂對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧的分離工藝考察

2.3.3.1 上樣流速對(duì)X-5型大孔樹脂吸附單寧的影響 由圖3可看出,上樣流速越大,吸附率反而越低。在考察上樣流速的影響時(shí),保持上樣濃度一致,所以只需考察各個(gè)上樣流速的吸附率大小。這是因?yàn)樯现魉龠^大,單寧與樹脂的接觸時(shí)間過短,來不及被樹脂吸附就已經(jīng)流出樹脂柱。當(dāng)上樣流速在0.5～1.0 mL/min時(shí)吸附率在85%以上且變化不大,雖然在0.5 mL/min的流速下,吸附效果最好,但工作效率低。綜合考慮選擇1.0 mL/min的流速上樣。

圖3 不同洗脫流速對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧的吸附效果的影響Fig.3 The effect of feed elution rate on adsorption effect of tannin

2.3.3.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)X-5型大孔樹脂吸附單寧的影響 不同的檸檬桉果實(shí)單寧質(zhì)量濃度下的吸附率和吸附量如圖4所示,隨著樣液濃度的上升,吸附率下降,吸附量上升。從吸附率來說,0.2 mg/mL的上樣濃度達(dá)到了97.74%,但是吸附量卻只有0.1955 mg/mL,工作效率不高,沒有充分發(fā)揮樹脂吸附能力,所以不選擇0.2 mg/mL為上樣濃度。而以0.6 mg/mL的質(zhì)量濃度上樣,吸附率達(dá)到了91.79%,吸附量達(dá)到了0.5507 mg/mL。吸附率和吸附量均較高,所以選擇0.6 mg/mL為單寧的上樣質(zhì)量濃度。

圖4 樣液濃度對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧吸附效果的影響Fig.4 The effect of feed concentration on adsorption effect of tannin

2.3.3.3 不同解吸速率對(duì)單寧洗脫的影響 解吸速率對(duì)單寧的影響如圖5所示,在0.5、1.0、1.5 mL/min的洗脫流速下,解吸率均達(dá)到94%以上,而且差別不大,之后流速越大,解吸率越低,是因?yàn)樗俣忍?洗脫劑未能與被吸附的單寧充分作用,單寧沒有被完全洗脫。雖然較低的洗脫流速解吸率大,但工作效率低,所以選擇最終1.5 mL/min的洗脫速率。

表2 各樣品純度Table 2 Purity of samples

表3 不同純度單寧的抗氧化活性Table 3 Antioxidant capacity from different purification tannin

圖5 不同洗脫流速對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧解吸的影響Fig.5 The effect of elution rate on desorption efficiency

2.3.4 純化方法對(duì)單寧純度的影響 采用不同的純化方法純化樣液,結(jié)果如表2所示。

由表2可得,不同的純化方法得到的樣品純度不同。粗提物經(jīng)過乙酸乙酯萃取后純度約為粗提物的3.4倍,大孔樹脂純化后純度約為粗提物的6.1倍,萃取和大孔樹脂純化聯(lián)用得到的乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化的樣品純度約為粗提物的9.1倍,乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化的樣品純度約為粗提物的8.8倍。說明采用溶劑萃取和大孔樹脂聯(lián)用的純化方法能有效地提高檸檬桉果實(shí)單寧提取物的純度,效果較好。

2.4 檸檬桉果實(shí)單寧的抗氧化活性

2.4.1 總抗氧化性的考察 以單寧酸為對(duì)照品,考察了不同純度的單寧質(zhì)量濃度在0.01～0.1 mg/mL時(shí)的總抗氧化性,結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同質(zhì)量濃度試樣的總抗氧化性Fig.6 The total oxidation resistance of different concentration samples

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),總抗氧化性隨著樣液濃度的增加而增加,樣品均在0.1 mg/mL時(shí)有最好的總抗氧化性，此時(shí)各物質(zhì)的總抗氧化性大小為:抗壞血酸>大孔樹脂純化>單寧酸>粗提物>乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化>乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化>乙酸乙酯萃取,其中大孔樹脂純化的總抗氧化性是單寧酸的135.47%,是抗壞血酸的70.52%。

2.4.2 DPPH·的清除效果考察 DPPH·的清除效果的結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同質(zhì)量濃度試樣對(duì)DPPH·的清除效果Fig.7 The DPPH·scavenging effect of differnent samples

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),樣品對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度增加而增加,在0.01 mg/mL時(shí)達(dá)到最大,最大清除率見表3,其中大孔樹脂純化物在0.06 mg/mL時(shí)的清除率與單寧酸相近,都達(dá)到了85%,表現(xiàn)出較高的清除能力。根據(jù)表3的IC50值,各樣品對(duì)DPPH·自由基的清除率依次為:單寧酸>大孔樹脂純化>抗壞血酸>粗提物乙酸乙酯萃取>乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化>乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化,與圖7反映的結(jié)果一致。純度最高的乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化物對(duì)DPPH·的清除率最低,有可能是在實(shí)驗(yàn)過程,純化步驟太多,引起單寧的失活,從而導(dǎo)致對(duì)DPPH·的清除率的下降。

總體來說,在相同的試劑濃度下,檸檬桉果實(shí)單寧對(duì)DPPH·自由基的清除能力要高于文獻(xiàn)[15]巨尾桉單寧對(duì)這種自由基的清除能力。

2.4.3 ·OH自由基的清除效果的考察 結(jié)果見圖8。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),樣品對(duì)·OH的清除率隨著濃度的增加而增加,但是幅度不大,在1.0 mg/mL處達(dá)到最大值,清除率見表3。清除能力依次為:抗壞血酸>乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化>大孔樹脂純化>粗提物>單寧酸>乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化>乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化的清除效果是單寧酸的113.77%,大孔樹脂純化的清除效果是單寧酸的103.87%,粗提物的清除能力是單寧酸的103.57%。總體來說檸檬桉中單寧對(duì)·OH的清除能力比較好。

圖8 不同質(zhì)量濃度試樣對(duì)·OH的清除效果Fig.8 The ·OH free radical scavenging effect of differnent samples

綜上可知,不同純度的單寧對(duì)DPPH·和·OH自由基的清除能力差異較大,也不能排除雜質(zhì)中也有能夠清除DPPH·和·OH自由基的物質(zhì),所以影響抗氧化性的因素比較復(fù)雜。但總體的抗氧化趨勢(shì)還是一致的,大孔樹脂純化物和粗提物的抗氧化能力較強(qiáng),乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化物抗氧化能力較弱。而對(duì)兩者清除率差異較大,原因可能在兩者的反應(yīng)條件和機(jī)理不同?？傮w來說,在相同的試劑濃度下,檸檬桉果實(shí)單寧對(duì)DPPH·和·OH自由基的清除能力要高于文獻(xiàn)[13]巨尾桉單寧對(duì)這兩種自由基的清除能力。在對(duì)DPPH·的清除率的探討時(shí),發(fā)現(xiàn)在濃度很小的情況下,大孔樹脂純化物的清除率幾乎達(dá)到了單寧酸的標(biāo)準(zhǔn),而各純化物在加大濃度之后對(duì)DPPH·的清除率均能達(dá)到90%左右。

3 結(jié)論

3.1 以檸檬桉果實(shí)粗提物為原料,提取單寧,得率為9.43%?？疾旄鞣N大孔樹脂對(duì)單寧的靜態(tài)吸附效率,篩選出對(duì)檸檬桉果實(shí)單寧純化效果較好的大孔樹脂為X-5,其吸附率為85.99%,解析率為93.47%,X-5樹脂對(duì)檸檬桉果實(shí)的純化工藝參數(shù)為:上樣流速1.0 mg/mL,上樣質(zhì)量濃度為0.6 mg/min,洗脫流速為1.5 mg/mL,洗脫劑的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

3.2 用不同純化方法得到的檸檬桉果實(shí)單寧的純度差異較大。檸檬桉果實(shí)單寧的大孔樹脂純化物總抗氧化能力是單寧酸的135.47%,是抗壞血酸的70.52%,各種純化物對(duì)DPPH·有一定的清除能力,大部分純化物對(duì)·OH自由基的清除能力都比單寧酸強(qiáng)。各單寧樣品的清除能力呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。總體上,大孔樹脂純化物和粗提物的抗氧化能力較其他純化物強(qiáng),乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化物抗氧化能力較其他純化物弱。其中雜質(zhì)中可能存在一些具有較強(qiáng)抗氧化性的物質(zhì),值得進(jìn)一步研究與探討。

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Study on purification and antioxidant activities of tannins ofEucalyptuscitriodorafruits

QU Lian,GAO Xuan,LIU Xiong-min*,LIU Tian-yuan,LAI Fang

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China)

Extracted tannin fromEucalyptuscitriodorafruits by using ultrasonic-assisted extraction,and compare the yield of tannin from two different methods of solvent extraction and ultrasonic-assisted extraction. The crude extract of tannin was purified by solvent process,macroporous resin adsorption and both methods combined. And the total antioxidant activity,the ability of removal DPPH· and ·OH radical of different samples were examined. The results showed that,tannin in crude extract was 9.43%. The optimum adsorption and separation for the crude extract on X-5 macroporous resin were as follows:the feed concentration of 0.6 mg/mL with flow rate of 1.0 mL/min,the desorption solvent was 60% ethanol with flow rate of 1.5 mL/min. The purified of the ethyl acetate extract,macroporous resin purification substance,ethyl acetate residue purified by macroporous resin,ethyl acetate extracts purified by macroporous resin were 32.05%,58.52%,83.07% and 85.31%. Respectively,the maximum total antioxidant activity was macroporous resin purification substance,135.47% for tannins. The maximum scavenging rate of different samples referred above for DPPH· were 66.09%,52.48%,92.18%,44.10% and 44.09%,when the mass concentration was 0.01 mg/mL. But the maximum scavenging rate of different samples referred above for ·OH were 67.92%,58.17%,68.12%,61.68% and 74.61%,with the concentration of 1.0 mg/mL.

Eucalyptuscitriodora;tannin;purification;antioxidant activity

2016-09-19

屈戀(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail:18776774709@163.com。

*通訊作者:劉雄民(1960-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化工，E-mail:xmliu1@gxu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(11462001)。

TS209

B

1002-0306(2017)08-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.041