富盈昕,劉春瑩,郭美娟,趙 耀,金鳳燮,魚(yú)紅閃

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

酶轉(zhuǎn)化在淫羊藿苷提取中的應(yīng)用

富盈昕,劉春瑩,郭美娟,趙 耀,金鳳燮,魚(yú)紅閃*

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

目前生產(chǎn)淫羊藿苷的過(guò)程中,其副產(chǎn)物朝藿定A、B、C等黃酮未被利用好。篩選出了將淫羊藿苷廢渣中朝藿定A、B、C等黃酮轉(zhuǎn)化成淫羊藿苷的A.sp.y39菌酶,將其應(yīng)用于以淫羊藿提取物為原料制備淫羊藿苷的工藝。將150 g西安岳達(dá)淫羊藿提取物,溶解于60%乙醇、經(jīng)D-280脫色柱脫色、結(jié)晶得到30.5 g淫羊藿苷;其廢渣朝藿定A、B、C混合黃酮,經(jīng)A.sp.y39菌酶轉(zhuǎn)化,又得到16.6 g淫羊藿苷。共得到純度90%以上的淫羊藿苷47.1 g;淫羊藿苷的提取率由傳統(tǒng)的20.3%提高到31.4%;相比于傳統(tǒng)方法,淫羊藿苷的提取率提高了50%以上。本文為節(jié)約淫羊藿資源提供了依據(jù)。

淫羊藿提取物,淫羊藿黃酮苷酶,淫羊藿苷,朝藿定A、B、C

淫羊藿為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpimediumL.)多年生草本植物,在我國(guó)分布的種類(lèi)有40余種。中國(guó)藥典(2010年版)規(guī)定,淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)、箭葉淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)、朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)四種淫羊藿地上部分,可用于中草藥。淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[1],其主要有效成分是淫羊藿黃酮,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)70余種淫羊藿黃酮,淫羊藿中80%～90%以上的黃酮為淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(Epimedin B)、朝藿定C(Epimedin C);其中50%以上為淫羊藿苷,其他40%左右的黃酮為朝藿定A、B和C[2]。淫羊藿中主要黃酮的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 主要淫羊藿黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 Common epimedium flavonoids

表1 常見(jiàn)的淫羊藿黃酮Table 1 Common epimedium flavonoids

國(guó)內(nèi)淫羊藿提取物的質(zhì)量,以淫羊藿苷含量來(lái)表示[3-4]。淫羊藿苷具有防抑郁[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7]等功能,也具有抗皮膚老化、抗皺紋、美白等功能[8]。只有一個(gè)糖基的淫羊藿次苷或戊糖基苷元的活性則更高[9]。

目前雖可利用大孔樹(shù)脂吸附法或制備色譜分離法等對(duì)少量黃酮進(jìn)行分離[10-14],但該操作復(fù)雜、產(chǎn)業(yè)化成本高;淫羊藿苷的提取方法較多[15]。也有利用酶轉(zhuǎn)化淫羊藿苷制備淫羊藿次苷、苷元的報(bào)道[16-17],但生物轉(zhuǎn)化制備淫羊藿苷的研究報(bào)道很少。

市銷(xiāo)的淫羊藿提取物中除了淫羊藿苷之外,還含有朝藿定A、B和C黃酮;為了提高從市銷(xiāo)的淫羊藿提取物提取淫羊藿苷的提取率,本文首先篩選了產(chǎn)淫羊藿黃酮苷酶微生物，利用其酶,以市銷(xiāo)的淫羊藿提取物為原料,分離提取淫羊藿苷,并利用酶轉(zhuǎn)化法將廢渣中的朝藿定A、B和C(主要成分)轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷,提高淫羊藿苷的提取率,為節(jié)約淫羊藿資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種Aspergillussp.y39、Aspergillussp.y90、Aspergillussp.y48 由本實(shí)驗(yàn)室從大曲中分離得到;淫羊藿苷、朝藿定A、B、C標(biāo)準(zhǔn)品 南京廣潤(rùn)生物制品有限公司;淫羊藿提取物(淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%) 北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司、吉林省宏久生物科技股份有限公司、西安岳達(dá)植物科技有限公司產(chǎn)品;蘆丁 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;G60 F254薄層層析板 德國(guó)Merck公司;D-280大孔樹(shù)脂、硅膠(300～400目) 天津南開(kāi)大學(xué)試劑廠;乙腈(色譜級(jí)) 美國(guó)天地(TEDIA)公司;甲醇等其他試劑 均為分析純(純度大于99.5%),天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

Waters 2695高效液相色譜分析儀、Waters 2996紫外檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;色譜柱Kromasil C18柱(5 μm,φ250 mm×4.6 mm) 大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廢渣淫羊藿混合黃酮制備 將淫羊藿提取物溶解于10倍重量體積的60%乙醇溶液中,上樣至與溶液等體積的D-280大孔脫色樹(shù)脂柱,反復(fù)吸附3～4次;再用約12倍柱體積60%乙醇溶液洗脫,減壓濃縮、待大量淫羊藿苷沉淀析出,真空抽濾沉淀,用50%冰凍乙醇溶液洗滌2次,干燥,得到第一批淫羊藿苷。

其母液減壓濃縮,溶解于適量的50%乙醇溶液,靜置1 d后有淡黃色淫羊藿苷沉淀析出;真空抽濾,再用50%冰凍乙醇溶液洗滌,干燥,得到第二批淫羊藿苷。

其母液再經(jīng)D-280大孔樹(shù)脂柱脫色、減壓濃縮、干燥,得到廢渣淫羊藿混合黃酮,用于轉(zhuǎn)化制備淫羊藿苷。

1.2.2 淫羊藿黃酮苷酶菌種的篩選 酶液的制備[18]:分別將A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48菌株,在含有0.3%淫羊藿混合黃酮和0.01%蘆丁的4%麥汁培養(yǎng)基中,30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6～7 d,離心除菌、加入3倍體積甲醇,過(guò)夜、沉淀酶蛋白,離心收集酶蛋白沉淀,溶解于1/10培養(yǎng)液體積的0.02 mol/L、pH5.0醋酸緩沖液,離心(7000 r/min,8 min)除渣,得到均有淫羊藿黃酮苷酶活力的三種酶液。

三種酶液分別與淫羊藿混合黃酮反應(yīng):3 mL各酶液與等體積的7%質(zhì)量濃度的淫羊藿混合黃酮溶液(用0.02 mol/L、pH5.0的醋酸緩沖液配制)混合,在45 ℃下?lián)u床反應(yīng),分別在3、6、9、12 h取樣,以薄層層析法(TLC法)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行程度,確定淫羊藿混合黃酮轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷的最佳產(chǎn)酶菌種。

1.2.3 酶轉(zhuǎn)化廢渣制備淫羊藿苷 將廢渣淫羊藿混合黃酮用0.02 mol/L、pH5.0醋酸緩沖液配制成7%質(zhì)量濃度的底物溶液,與等體積酶液混合,45 ℃下攪拌反應(yīng),在反應(yīng)3、6、9、12 h時(shí)取樣,用TLC法檢測(cè)反應(yīng)程度;若反應(yīng)完全,加入3倍體積甲醇(純度大于99.5%),靜置過(guò)夜、離心(7000 r/min,8 min)收集上清,經(jīng)D-280樹(shù)脂脫色、減壓濃縮、干燥,得到淫羊藿苷含量高的反應(yīng)物。將反應(yīng)物溶解于其重量3倍的50%乙醇,靜置1 d后有淡黃色淫羊藿苷沉淀析出,真空抽濾、用50%冰凍乙醇溶液洗滌、干燥,得到酶轉(zhuǎn)化的淫羊藿苷。

1.2.4 淫羊藿黃酮的檢測(cè) 用薄層層析(TLC)法和高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)淫羊藿黃酮。

TLC法:用毛細(xì)管吸取樣品溶液,點(diǎn)樣于TLC板上,每個(gè)點(diǎn)相距0.4 cm,依照樣品濃度確定點(diǎn)樣次數(shù);在展開(kāi)劑V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)=8∶7∶1∶1中展開(kāi)、吹干,254 nm紫外線(xiàn)下觀察。TLC板中各淫羊藿黃酮含量比例,用Bandscan軟件(Glyko Inc.,1998)分析[19]。

HPLC法:稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg,淫羊藿提取物、酶反應(yīng)產(chǎn)物等樣品各4 mg,分別溶于10 mL的50%乙醇中,制成0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、0.4 mg/mL樣品溶液,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,待用。流動(dòng)相,乙腈(A)-水(B):0～8 min,17% A～27% A;8～32 min,27% A,32～60 min,27% A～85% A;60～70 min,85% A,70～80 min,85% A～90% A;進(jìn)樣量,10 μL;柱溫,35 ℃;體積流量,1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng),273 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 市銷(xiāo)的淫羊藿提取物原料的分析

用HPLC法對(duì)三種市銷(xiāo)淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量均為20%)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。

圖2 市銷(xiāo)的淫羊藿提取物的HPLC圖Fig.2 The HPLC of epimedium extract注:1,朝藿定A;2,朝藿定B;3,朝藿定C;4,淫羊藿苷。

圖2中各淫羊藿黃酮的峰面積比例,可視為質(zhì)量分?jǐn)?shù)的含量比例。北京珅奧基公司淫羊藿提取物中,朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比約為6∶11∶25∶58;西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物中上述四種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比約為5∶19∶19∶57;吉林宏久公司淫羊藿提取物中上述四種物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比則為6∶8∶25∶61。

由此可見(jiàn),市銷(xiāo)的淫羊藿提取物中,淫羊藿苷和朝藿定A、B、C的含量比例約為60∶40,除了含有20%的淫羊藿苷,還含13%～14%左右的朝藿定A、B、C。

2.2 產(chǎn)淫羊藿黃酮苷酶的微生物篩選

為了充分利用上述淫羊藿黃酮,研究廢渣生物轉(zhuǎn)化,分別對(duì)A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48三種菌株所產(chǎn)的酶進(jìn)行研究。結(jié)果表明,三種菌所產(chǎn)的酶均能水解淫羊藿黃酮,最佳產(chǎn)酶條件均為30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6～7 d。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物酶反應(yīng)效果好,所以將三種菌所產(chǎn)的酶液分別與西安岳達(dá)公司淫羊藿混合黃酮反應(yīng),在3、6、9、12 h取樣,進(jìn)行TLC檢測(cè),結(jié)果如圖3所示。用Bandscan軟件對(duì)圖3 TLC板中淫羊藿黃酮的含量比例進(jìn)行分析,其結(jié)果(取三次實(shí)驗(yàn)平均值)如表1所示。

圖3 不同菌所產(chǎn)的酶對(duì)朝藿定混合黃酮的轉(zhuǎn)化Fig.3 Conversion of epimediun flavonoids of second mother solution in different enzyme-reaction time注:1,淫羊藿苷元標(biāo)準(zhǔn)品;2,淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品;3,朝藿定A標(biāo)準(zhǔn)品;4,朝藿定B標(biāo)準(zhǔn)品;5,朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)品，6:淫羊藿次苷I、II標(biāo)準(zhǔn)品，Y:淫羊藿提取物原料；S,淫羊藿苷分離后的母液黃酮；母液黃酮反應(yīng)時(shí)間:a、b、c、d依次為3、6、9、12 h。

表1 不同菌酶、不同反應(yīng)時(shí)間下各淫羊藿黃酮含量(%)Table 1 The epimedium flavonoids content in different enzyme-reaction time(%)

從圖3和表1可以看出,A.sp.y39菌酶與淫羊藿混合黃酮反應(yīng)6 h,朝藿定A、B、C明顯減少,淫羊藿苷明顯增加;反應(yīng)9 h和12 h,淫羊藿苷質(zhì)量含量分?jǐn)?shù)從原料的56.5%,提高到85%～86%,而朝藿定A、B、C含量降低。說(shuō)明,A.sp.y39菌酶能水解朝藿定A的末端3-O-葡萄糖基、朝藿定B的末端3-O-木糖基、朝藿定C的末端3-O-鼠李糖基,轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷。因此,該酶適合于從朝藿定A、B、C制備淫羊藿苷。

A.sp.y90菌酶與混合黃酮反應(yīng)3 h,有淫羊藿次苷生成;反應(yīng)12 h,主要產(chǎn)物為淫羊藿次苷,其含量比例達(dá)48%,產(chǎn)物淫羊藿苷含量比例只有21%。說(shuō)明,A.sp.y90菌酶不僅水解朝藿定A、B、C的末端3-O-糖基,得到淫羊藿苷,還進(jìn)一步水解一個(gè)淫羊藿苷糖基,得到淫羊藿次苷。因此,該酶適合于從朝藿定A、B、C制備淫羊藿次苷。

A.sp.y48菌酶與混合黃酮反應(yīng)12 h,主要產(chǎn)物是淫羊藿苷元和淫羊藿次苷,其含量比例分別為43%和31%。說(shuō)明,A.sp.y48菌酶不僅能水解朝藿定A、B、C的末端3-O-糖基,得到淫羊藿苷,還進(jìn)一步水解一個(gè)淫羊藿苷糖基,得到淫羊藿次苷,再水解一個(gè)淫羊藿次苷糖基,得到淫羊藿苷元。因此,該酶適合于從朝藿定A、B、C制備淫羊藿苷元和淫羊藿次苷。

綜上,從朝藿定A、B、C轉(zhuǎn)化制備淫羊藿苷的最佳產(chǎn)酶菌種為A.sp.y39,應(yīng)用于如下實(shí)驗(yàn)。

2.3 從淫羊藿提取物分離淫羊藿苷及其廢渣

利用D-280大孔樹(shù)脂分離法、結(jié)晶法,以各公司提供的淫羊藿提取物為原料,制備淫羊藿苷,并得到主要含朝藿定A、B、C的廢渣。

分別從北京珅奧基公司淫羊藿提取物、吉林宏久公司、西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物中,分離淫羊藿苷,其母液經(jīng)脫色、濃縮、干燥,可得廢渣,結(jié)果如表2所示。

表2 淫羊藿苷及其廢渣含量及淫羊藿苷得率Table 2 Content of icariin and its waste offscum and the yield of icariin

從表2可知,從100 g北京珅奧基公司淫羊藿提取物中得到20.5 g淫羊藿苷(純度90%以上),得率為20.5%;其母液經(jīng)脫色、濃縮、干燥得到30.8 g廢渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黃酮類(lèi)物質(zhì)。從100 g吉林宏久公司淫羊藿提取物,得到20.3 g淫羊藿苷(純度90%以上),得率為20.3%;從母液得到28.9 g廢渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黃酮類(lèi)物質(zhì)。從150 g西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物,得到30.5 g淫羊藿苷(純度90%以上),得率為20.3%;從母液得到52 g廢渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黃酮類(lèi)物質(zhì)。

由此可見(jiàn),從各市銷(xiāo)的淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量20%)中,均可以分離得20%左右的淫羊藿苷;其母液廢渣經(jīng)脫色干燥,可得到約30%重量得率的廢渣。進(jìn)一步研究酶轉(zhuǎn)化上述廢渣,制備淫羊藿苷。

2.4 分離淫羊藿苷及其廢渣酶轉(zhuǎn)化制備淫羊藿苷的批量實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物酶反應(yīng)效果好,因此以下采用西安岳達(dá)公司的提取物為原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。將150 g西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物,溶解在1500 mL的60%乙醇溶液中,上樣于等體積D-280大孔脫色樹(shù)脂柱,反復(fù)吸附3～4次,用12倍柱體積60%乙醇溶液洗脫,洗脫液減壓濃縮、沉淀真空抽濾,再用50%冰乙醇洗沉淀、干燥,得到第一批淫羊藿苷20.8 g;經(jīng)HPLC檢測(cè)(圖略),純度90%以上。

其母液(第一次)再經(jīng)D-280大孔樹(shù)脂吸附脫色、減壓濃縮、干燥,得到母液總黃酮73 g;經(jīng)HPLC檢測(cè),淫羊藿苷和朝藿定A、B、C含量比例為6.65∶21.2∶24.8∶47.4。

由此可知,第一次淫羊藿苷結(jié)晶過(guò)程中,淫羊藿苷含量(HPLC峰面積比)從原料的56.5%,下降到47.4%。但母液總黃酮中還含有大量的淫羊藿苷,需進(jìn)行第二次結(jié)晶分離。向其母液總黃酮中,加入240 mL的50%乙醇,使朝藿定A、B、C溶解,靜置1 d后將沉淀真空抽濾,再用50%冰凍乙醇溶液洗2次,干燥,得到第二批淫羊藿苷9.7 g,經(jīng)HPLC檢測(cè),純度90%以上。

其母液(第二次)再經(jīng)D-280大孔樹(shù)脂吸附脫色、減壓濃縮、干燥,得到廢渣52 g,經(jīng)HPLC檢測(cè),朝藿定A、B、C和淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10.5∶18.9∶44.2∶26.4。從淫羊藿提取物分離淫羊藿苷過(guò)程中,母液中黃酮組成的變化,如表3所示。

表3 淫羊藿黃酮的組成比例(%)Table 3 The epimedium flavonoid composition radio(%)

從表3可知,淫羊藿苷提取過(guò)程中,淫羊藿苷含量從原料中的56.5%降為26.4%,不能再結(jié)晶獲得淫羊藿苷。其廢渣母液中朝藿定A、B、C和淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10.5∶18.9∶44.2∶26.4,即朝藿定A、B、C含量比例約為74%。

因此,利用酶轉(zhuǎn)化法,將廢渣母液中朝藿定A、B、C定向轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷,提高其得率。52 g的上述第二次結(jié)晶后的母液廢渣,酶轉(zhuǎn)化9 h時(shí),其80%以上的朝藿定轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷。再經(jīng)D-280大孔樹(shù)脂分離、結(jié)晶,得到酶轉(zhuǎn)化的淫羊藿苷16.6 g,經(jīng)HPLC檢測(cè)(圖4),其純度達(dá)90%以上。

由此,從150 g西安岳達(dá)公司的淫羊藿提取物經(jīng)D-280樹(shù)脂柱脫色分離、2次結(jié)晶,得到含量90%以上的淫羊藿苷30.5 g,原料重量得率為20.3%,還得到52 g廢渣;經(jīng)酶轉(zhuǎn)化、分離得到含量90%以上的淫羊藿苷16.6 g,重量得率為11.1%;三次共得到純度90%以上的淫羊藿苷47.1 g,淫羊藿苷的得率由20.3%提高到31.4%。

圖4 淫羊藿苷產(chǎn)品HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of Icariin product

3 結(jié)論

市銷(xiāo)的淫羊藿提取物中,除了含20%淫羊藿苷外,還含有13%～14%左右的朝藿定A、B、C,為了利用這部分資源,研究了A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48三種菌所產(chǎn)酶對(duì)朝藿定A、B、C的水解作用,確定最佳產(chǎn)酶菌種為A.sp.y39。

以150 g市銷(xiāo)的西安岳達(dá)公司淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量20%)為原料,經(jīng)脫色、兩次結(jié)晶,得到淫羊藿苷30.5 g(得率為20.3%)及主要含朝藿定A、B、C的廢渣52 g;利用A. sp.y39菌所產(chǎn)酶,將廢渣中的朝藿定A、B、C轉(zhuǎn)化成淫羊藿苷16.6 g(得率為11.1%),淫羊藿苷的得率由傳統(tǒng)方法的20.3%提高到31.4%;相比于傳統(tǒng)方法,淫羊藿苷的提取率提高了50%以上。本文為淫羊藿黃酮資源有效的利用提供了依據(jù)。

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Bioconversion utilization of waste-residue from icarrin extraction

FU Ying-xin,LIU Chun-ying,GUO Mei-juan,ZHAO Yao,JIN Feng-xie,YU Hong-shan*

(College of Biotechnology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

In current domestic situation,the by-products containing with flavonoids such as epimedin A,B,C was not being used during the icarrin production from epimedium extract. In this paper,the enzyme fromA.sp.y 39 strain was filtered for transformating epimedin A,B,C in waste offscum of epimedium extract. The 150 g of the market epimedium extract was dissolved in 60% ethyl alcohol for decoloring by D-280 macroporous resin,and then 30.5 g of icariin was obtained from above discolored epimedium extract by crystallization method. Then,16.6 g of icariin was obtained from the waste offscum containing epimedin A,B and C by the enzyme fromA.sp.y39 strain. Finally,47.1 g of icariin(the purity was over 90%)was obtained from 150 g of epimedium extract by above enzyme transformation methods,the yield of icariin was rised from 20.3% to 31.4%. Compared with the traditional method,the extraction rate of icariin was increased by more than 50%,which provided the basis for saving epimedium resources.

eptimedium extract;epimedium flavonoids;icariin;epimendin A,B,C

2016-09-19

富盈昕(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化，E-mail：735974001@qq.com。

*通訊作者:魚(yú)紅閃(1968-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化，E-mail：hongshan@dlpu.edu.cn。

“重大新藥創(chuàng)新”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX09503001-003)；國(guó)家高端外國(guó)專(zhuān)家項(xiàng)目(GDT20152100019)資助。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.024