劉 旗 陳 蕓 鄧俊良 任志華 楊顏銥 高 爽 陳 憧(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

利用高通量測(cè)序技術(shù)分析川中黑山羊瘤胃
纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)

劉 旗 陳 蕓 鄧俊良*任志華 楊顏銥 高 爽 陳 憧
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境公害與
動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

本試驗(yàn)旨在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究川中黑山羊瘤胃纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)。選取3只4月齡川中黑山羊[體重(15.53±0.21) kg]，正常飼喂20 d后采集瘤胃液(A)樣品，間隔40 d后再次采集瘤胃液(F)樣品，提取樣品總DNA后，擴(kuò)增真核生物18S rRNA V4區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序。結(jié)果表明：1)共獲得高質(zhì)量有效序列242 321條，聚類后得1 650個(gè)操作分類單位(OTU)。2)A樣品、F樣品在alpha多樣性Chao、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)上，差異不顯著(P>0.05)。3)在綱水平分類上，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品相對(duì)豐度最高的均為纖毛門，側(cè)口綱(A樣品為46.0%、F樣品為44.7%)，2個(gè)樣品的相對(duì)豐度差異不顯著(P>0.05)。4)在科水平分類上，A樣品優(yōu)勢(shì)科為頭毛科(31.8%)，其次為均毛科(14.2%)；F樣品優(yōu)勢(shì)科為頭毛科(42.8%)；并且F樣品頭毛科相對(duì)豐度顯著高于A樣品(P<0.05)，A樣品均毛科相對(duì)豐度顯著高于F樣品(P<0.05)。5)在屬水平分類上，A樣品與F樣品相對(duì)豐度最高的屬均為多加多泡雙毛屬(A樣品為20.9%、F樣品為25.4%)，無顯著差異(P>0.05)；存在顯著性差異的屬是均毛屬、頭毛屬、腹甲雙毛屬、刺甲雙毛屬相對(duì)豐度，其中A樣品均毛屬(14.1% vs. 1.9%)、腹甲雙毛屬相對(duì)豐度(2.8% vs. 1.5%)顯著高于F樣品(P<0.05)，而頭毛屬(6.7% vs. 12.5%)、刺甲雙毛屬相對(duì)豐度(0.3% vs. 2.5%)顯著低于F樣品(P<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，幼齡川中黑山羊瘤胃液纖毛蟲相對(duì)豐度最高的種屬為多加多泡雙毛屬，瘤胃中還有許多未被分類鑒定且相對(duì)豐度較高的真核生物，需要進(jìn)一步研究。

川中黑山羊；瘤胃纖毛蟲；種群結(jié)構(gòu)；多樣性；MiSeq測(cè)序

反芻動(dòng)物瘤胃中棲息著大量細(xì)菌、原蟲、真菌和古菌，其中原蟲主要指纖毛蟲，數(shù)量為1×104～1×106個(gè)/mL[1-2]。纖毛蟲數(shù)量雖然比細(xì)菌少，但體積大，占整個(gè)瘤胃微生物生物量的30%～80%[3]，在瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中具有重要生物學(xué)意義，包括穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境(pH、發(fā)酵類型、甲烷生成、氨濃度)，降解纖維素、蛋白質(zhì)及防止宿主中毒(硝酸鹽、亞硝酸鹽、酸)等[4-9]。纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)受年齡、飼糧結(jié)構(gòu)和地域等因素的影響[1,10-11]。有研究表明，在新生幼畜的瘤胃內(nèi)沒有纖毛蟲，隨著年齡的增長(zhǎng)幼畜瘤胃內(nèi)纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)發(fā)生著劇烈的變化[12-14]。隨著反芻家畜營(yíng)養(yǎng)與疾病研究的不斷深入，反芻家畜瘤胃內(nèi)纖毛蟲種群構(gòu)成、種群關(guān)系變化及其與宿主之間復(fù)雜的關(guān)系成為瘤胃營(yíng)養(yǎng)代謝研究的熱點(diǎn)。

目前山羊瘤胃微生物的研究對(duì)象主要是波爾山羊等，而我國(guó)特有小品種羊研究甚少。川中黑山羊原產(chǎn)于四川省金堂縣、樂至縣一帶，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美、繁殖率高、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)優(yōu)秀的黑山羊品種，于2010年1月15日，正式列入《中國(guó)國(guó)家畜禽遺傳資源目錄》。但目前對(duì)川中黑山羊瘤胃微生物的研究尚未見報(bào)道。

高通量測(cè)序(high-throughput sequencing)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種研究微生物生態(tài)學(xué)的全新技術(shù)手段，能全面地反映樣品微生物的結(jié)構(gòu)與組成。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究羊瘤胃微生物的報(bào)道主要有關(guān)于細(xì)菌，對(duì)瘤胃纖毛蟲的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究川中黑山羊瘤胃原生動(dòng)物纖毛蟲結(jié)構(gòu)，旨在為我國(guó)黑山羊種質(zhì)資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為川中黑山羊微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

選取3頭健康雄性4月齡川中黑山羊，平均體重為(15.53±0.21) kg，供瘤胃液采集。試驗(yàn)動(dòng)物單欄飼喂(飼喂精料給足青草)、自由飲水。精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，飼喂量按照體重2%飼喂，粗料為新鮮青草，每天08：00和17：00飼喂。

表1 精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供Premix provided the following per kg of the diet:Fe (as ferrous sulfate) 30 mg,Cu (as copper sulfate) 10 mg,Zn (as zinc sulfate) 50 mg,Mn (as manganese sulfate) 60 mg,VA 2 937 IU,VD 343 IU,VE 30 IU。

2)營(yíng)養(yǎng)水平均為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 樣品采集與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)飼10 d后開始正式試驗(yàn)，正常飼喂20 d后，于第21天晨飼前采集瘤胃液(A)樣品，間隔40 d后再次采集瘤胃液(F)樣品，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，參照王繼文等[15]的方法(胃管真空泵抽吸樣品法)采集樣品。

1.3 18S rDNA的擴(kuò)增及高通量測(cè)序

瘤胃微生物基因組DNA的提取，參照試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書進(jìn)行，采用紫外可見分光光度計(jì)(NanoDrop-ND1000)測(cè)定提取的DNA濃度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。提取質(zhì)量合格的DNA樣品送至上海派森諾生物科技有限公司擴(kuò)增真核生物18S rDNA V4區(qū)(420 bp)，通用引物為V547F：5＇-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3＇；V4R：5＇-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3＇。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用Axygen凝膠回收試劑盒回收。對(duì)文庫質(zhì)檢和定量，將合格的文庫利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)以Fastq格式保存，利用Flash 1.2.7軟件篩選(按照引物和Index信息，識(shí)別分配入對(duì)應(yīng)樣本，并去除嵌合體等疑問序列)獲取每個(gè)樣本的有效序列，再運(yùn)用QIIME 1.8.0識(shí)別疑問序列(要求序列長(zhǎng)度≥150 bp，且不允許存在模糊堿基N之外，剔除5＇端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1的序列以及含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列)，篩選得到高質(zhì)量序列，調(diào)用Uclust這一序列比對(duì)工具[16]，對(duì)前述獲得的高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)劃分[17]，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，根據(jù)每個(gè)OTU在每個(gè)樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件。獲得的OTU與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，通過GenBank鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。alpha多樣性指數(shù)(Chao、ACE、Shannon、Simpson指數(shù))的計(jì)算利用Mothur 1.30.1軟件完成[18]。2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品菌群相對(duì)豐度差異顯著性分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 樣品測(cè)序深度和多樣性分析

本次試驗(yàn)6個(gè)樣品共獲得242 321條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣品含有(40 386±4 082)條序列?；谙嗨贫却笥?7%的原則，將獲得的高質(zhì)量序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得1 650個(gè)OTU，剔除稀有OTU后，其中A樣品獲得175個(gè)，F(xiàn)樣品獲得197個(gè)，樣品間差異不顯著(P>0.05)，2個(gè)樣品間共享OTU為143個(gè)(圖1)。本試驗(yàn)瘤胃液樣品的稀釋曲線見圖2，如圖所示，在本試驗(yàn)的測(cè)序深度下，除了A1樣品外，其余各樣品稀釋曲線最終均趨于平緩，表明本試驗(yàn)的測(cè)序深度可以覆蓋各樣品中大多數(shù)微生物。

圖1 OTU維恩圖

圖2 樣品稀釋曲線

主成分分析結(jié)果見圖3，如圖所示，2個(gè)樣品聚類在一起。主成分分析獲得主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率為70.84%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率為23.80%。

alpha多樣性常用于反映微生物群落的豐富度和均勻度，常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度Chao和ACE指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon和Simpson指數(shù)。2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的alpha多樣性結(jié)果見表2，與A樣品相比，F(xiàn)樣品群落豐富度指數(shù)(Chao和ACE指數(shù))稍低，但差異不顯著(P>0.05)，而群落均勻度及多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson指數(shù))稍高，差異亦不顯著(P>0.05)。

圖3 主成分分析結(jié)果

2.2 瘤胃原生動(dòng)物纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)

表3中列出了纖毛蟲在綱、科、屬上的種群分布，各分類水平中不屬于纖毛蟲的均未列出，包括新麗鞭毛菌門、鏈形門和微孢子門等，雙毛屬(Diplodinium)含量過低而未列出。綱分類水平上，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品相對(duì)豐度差異不顯著(P>0.05)，且相對(duì)豐度最高的均為纖毛門，側(cè)口綱?？扑椒诸惿?，A樣品中均毛科相對(duì)豐度顯著高于F樣品(P<0.05,14.2% vs. 1.9%)，F(xiàn)樣品中頭毛科相對(duì)豐度顯著高于A樣品(P<0.05,42.8% vs. 31.8%)。屬分類水平上，所有樣品中共有9個(gè)屬被鑒定出，各樣品中纖毛蟲屬水平上種群組成見圖4；已知屬中，多甲多泡雙毛屬相對(duì)豐度最高(A樣品為20.9%，F(xiàn)樣品為25.4%)，且2個(gè)樣品間差異不顯著(P>0.05)；內(nèi)毛屬、腹甲雙毛屬、頭毛屬與刺甲雙毛屬在2個(gè)樣品中存在顯著差異(P<0.05)，A樣品中內(nèi)毛屬、腹甲雙毛屬顯著高于F樣品(P<0.05)，而頭毛屬、刺甲雙毛屬顯著低于F樣品(P<0.05)；2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品中均含有為未知屬(A樣品為35.4%，F(xiàn)樣品為35.6%，未在表中列出)。因此，2個(gè)樣品中纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)存在較大差異。

表2 取樣深度為33 019時(shí)的瘤胃微生物alpha多樣性指數(shù)對(duì)比

表3 瘤胃液中纖毛蟲種群分布

圖4 屬水平上瘤胃纖毛蟲種群組成

3 討 論

3.1 川中黑山羊瘤胃真核生物多樣性分析

通過單樣品的OTU和alpha多樣性分析來反映微生物群落的豐富度和多樣性。本試驗(yàn)通過MiSeq測(cè)序平臺(tái)，平均每個(gè)樣品獲得275個(gè)OTU，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于應(yīng)用該技術(shù)研究瘤胃細(xì)菌所得OTU數(shù)(962～2 499)[15,19-20]，并且alpha多樣性指數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于應(yīng)用該技術(shù)研究瘤胃細(xì)菌所獲結(jié)果[Chao指數(shù)(836～2 687)[15,18,21]、ACE指數(shù)(330～841)[18-19]、Shannon指數(shù)(3.85～8.28)][19-21]，由此可見瘤胃內(nèi)細(xì)菌豐富度及多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瘤胃內(nèi)真核生物。此外本次所獲Shannon指數(shù)(3.024、3.089)相對(duì)王新峰等[22]應(yīng)用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)研究山羊瘤胃纖毛蟲獲得的Shannon指數(shù)(0.824)較高，可見針對(duì)群落多樣性的研究，高通量測(cè)序技術(shù)明顯優(yōu)于PCR-DGGE技術(shù)。

Kittelmann等[23]通過454焦磷酸測(cè)序平臺(tái)研究家養(yǎng)綿羊瘤胃真核生物組成，其結(jié)果中Simpson指數(shù)浮動(dòng)較大(0.004～0.767)，紫花苜蓿牧場(chǎng)放牧(胃管插管采樣)組Simpson指數(shù)僅為0.004，飼喂谷粒圈養(yǎng)組(屠宰法采樣)組Simpson指數(shù)為0.096，而夏季放牧和冬季放牧2組(永久瘺管采樣)Simpson指數(shù)相差不大(0.711和0.731)。本研究結(jié)果(Simpson指數(shù)0.765、0.784)與Kittelmann等[23]研究結(jié)果(0.004、0.096)相差較大，這可能是受到了飼糧結(jié)構(gòu)的影響。瘤胃真核生物作為瘤胃內(nèi)飼糧消化吸收的重要組成成分，飼糧結(jié)構(gòu)變化是影響群落多樣性的關(guān)鍵因素[21,24]。Kobayashi[25]認(rèn)為飼糧結(jié)構(gòu)的單一性可能是影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物多樣性的原因。此外，也可能是測(cè)序平臺(tái)、品種與飼養(yǎng)方式不同引起的。

另外，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品對(duì)比下，alpha多樣性指數(shù)無顯著差異。由此可見，短時(shí)間內(nèi)瘤胃真核生物多樣性不會(huì)發(fā)生顯著變化。

3.2 川中黑山羊瘤胃纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)分析

本次試驗(yàn)在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品中均含有大量未知屬，所占的比例高達(dá)35.4%與35.6%，這充分顯示出瘤胃內(nèi)還有很多有價(jià)值的真核生物種群信息需要深入挖掘。所有樣品中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)屬(均毛屬、密毛屬、頭毛屬、多加多泡雙毛屬、腹甲雙毛屬、刺甲雙毛屬、真雙毛屬、雙毛屬、內(nèi)毛屬)，其中多加多泡雙毛屬為最優(yōu)勢(shì)種屬，這與以往大部分研究結(jié)果并不一致。大部分研究結(jié)果表明，內(nèi)毛屬為山羊瘤胃內(nèi)最優(yōu)勢(shì)種屬，包括徐淮白山羊(81.3%)[26]、內(nèi)蒙古山羊(74.25%)[27]、呼倫貝爾草原綿羊(77.1%)[28]，西班牙山羊(74%～85%)[29]和家養(yǎng)綿羊(40%)[23]等。而本試驗(yàn)結(jié)果中內(nèi)毛屬僅占總纖毛蟲的2.6%、1.3%，引起這種差異可能由于飼糧結(jié)構(gòu)的不同。本試驗(yàn)飼糧以牧草為主，牧草為南方牧草，南方牧草與其他地區(qū)牧草相比，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量低，但粗纖維含量高[30]，而多甲多泡雙毛屬木聚糖酶和葡聚糖酶活力旺盛，內(nèi)毛屬只有微弱的作用[31]，因此高纖維牧草可能是導(dǎo)致此結(jié)果的誘因。此外，也有可能是因?yàn)轱曫B(yǎng)方式的因素，Mishima等[32]研究稱放養(yǎng)坦桑福尼亞瘤牛短角牛瘤胃纖毛蟲內(nèi)毛屬含量(7.0%～25%)顯著低于大部分家養(yǎng)反芻動(dòng)物(80%～99%)；Coleman[14]稱放牧有利于反芻動(dòng)物瘤胃原蟲的定植，放牧的羔羊在正常飼養(yǎng)條件下3～6個(gè)月即可獲得與成年羊類似的原蟲種群；Franzolin等[33]研究2種飼養(yǎng)方式下印度水牛瘤胃微生物的組成，結(jié)果表明放牧組瘤胃纖毛蟲總數(shù)及組成明顯優(yōu)于飼喂組。除了飼糧結(jié)構(gòu)與飼養(yǎng)方式的影響外，日齡等也會(huì)影響瘤胃微生物；Hungate[11]稱幼齡反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物呈酸性，妨礙瘤胃原生動(dòng)物的定值；另外，高通量測(cè)序技術(shù)也會(huì)對(duì)真實(shí)種群結(jié)構(gòu)有所影響，Kittelmann等[34]稱高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)果使體積較小的纖毛蟲屬(內(nèi)毛屬、端毛屬和雙毛屬等)含量被低估，而體積較大的種屬(后毛屬、前毛屬、真雙毛屬、硬甲雙毛屬和多甲多泡雙毛屬等)含量被高估。

2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品相對(duì)比下，相對(duì)豐度最高的均為多加多泡雙毛屬，并無顯著差異。而均毛屬、腹甲雙毛屬、頭毛屬和刺甲雙毛屬存在顯著差異。這種差異可能是飼糧結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果，在長(zhǎng)期高纖維牧草飼喂下，利于消化纖維的頭毛屬等逐漸增多，而利于淀粉多糖消化的均毛屬逐漸減少[35-36]。因此飼糧可能是引起這種變化的主要因素，此外，樣本數(shù)量少也可能影響本研究反映纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)真實(shí)的變化。

4 結(jié) 論

① 本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)分析了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)川中黑山羊瘤胃纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果證明，幼齡川中黑山羊瘤胃纖毛蟲最優(yōu)勢(shì)種屬為多甲多泡雙毛屬，且飼糧顯著影響瘤胃纖毛蟲屬結(jié)構(gòu)的變化。

② 瘤胃真核生物群落豐富度與多樣性在短時(shí)間內(nèi)無顯著差異。

③ 瘤胃中還有許多未被分類鑒定且相對(duì)豐度較高的真核生物，其結(jié)構(gòu)和功能有待深入研究。

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*Corresponding author， professor， E-mail: dengjl213@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Ruminal Ciliate Community Structure ofChuanzhongBlack Goats: An Analysis Using High-Throughput Sequencing Technology

LIU Qi CHEN Yun DENG Junliang*REN Zhihua YANG Yanyi GAO Shuang CHEN Chong
(KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，KeyLaboratoryofEnvironmentalHazardandAnimalDiseaseofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuangAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

This study was designed to reveal the ruminal ciliate community structure ofChuanzhongblack goats using MiSeq sequencing technology. Three 4-month-oldChuanzhongblack goats weighted (15.53±0.21) kg were used to collect rumen fluid, and the samples were collected after normal feeding of 20 (sample A) and 60 d (sample F)， respectively. Total DNA was extracted for amplification V4 area of 18S rRNA, and the products were sequenced by Illumina MiSeq sequencing system. The results showed as follows: 1) a total of 242 321 high quality valid sequences and 1 650 operational taxonomic units were obtained. 2) There were no significant difference on alpha diversity indexes (Chao, ACE, Shannon and Simpson) between samples A and F (P>0.05). 3) At class level, the most abundant class in samples A and F were Ciliophora, Litostomatea (sample A was 46.0%, sample F was 44.7%), and there was no significant difference between samples A and F (P>0.05). 4) At family level, the most abundant family in sample A was Ophryoscolecidae (31.8%) followed by Isotrichidae (14.2%); the most abundant family in sample F was Ophryoscolecidae (42.8%); the relative abundance of Ophryoscolecidae in sample F was significantly higher than that in sample A (P<0.05), and the relative abundance of Isotrichidae in sample A was significantly higher than that in sample F (P<0.05). 5) At genus level, the most abundant ciliate genus wasPolyplastron(sample A was 20.9%， sample F was 25.4%), and there are no significant differences between samples A and F (P>0.05); there were significant differences of the relative abundances ofIsotricha,Ophryoscolex,DiploplastronandEnoploplastron, the relative abundances ofIsotricha(14.1% vs. 1.9%) andDiploplastron(2.8% vs. 1.5%) in sample A were significantly higher than those in sample F (P<0.05), and relative abundances ofOphryoscolex(6.7% vs. 12.5%) andEnoploplastron(0.3% vs. 2.5%) in sample A were significantly lower than those in sample F (P<0.05). In conclusion,Polyplastronis the most abundant genus in the rumen ciliate communities of youthChuanzhongblack goats, and there are still a lot of unclassified and unidentified eukaryotic microorganisms with high abundance worth further study in rumen.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1574-1581]

Chuanzhongblack goat； ruminal ciliate； community structure； diversity; MiSeq sequencing

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.016

2016-11-04

“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT0848);四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃(03572070)

劉 旗(1992—)，男，河南漯河人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹形鳙F醫(yī)與臨床。E-mail: 398772948@qq.com

*通信作者：鄧俊良，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: dengjl213@126. com

S826

A

1006-267X(2017)05-1574-08