李曉斌 趙國(guó)棟 劉 振 吳婷婷 何周瑞 鄧海峰 楊開(kāi)倫(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

3～6月齡伊犁馬腸道微生物群落多樣性的研究

李曉斌 趙國(guó)棟 劉 振 吳婷婷 何周瑞 鄧海峰 楊開(kāi)倫*
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

本試驗(yàn)旨在研究3～6月齡伊犁馬腸道微生物群落的多樣性，揭示斷奶前馬駒腸道菌群演替的規(guī)律，從微生物學(xué)角度為此階段馬駒生長(zhǎng)發(fā)育及腸道健康研究提供理論依據(jù)。試驗(yàn)選取平均體重為(89.75±8.81) kg、出生日期相同的3月齡伊犁馬5匹，進(jìn)行為期90 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。分別在試驗(yàn)的第0天(即試驗(yàn)開(kāi)始的前1天)、第30天、第60天、第90天采集馬駒糞便樣品，從每份樣品中提取微生物基因組總DNA，采用Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣品微生物群落多樣性。結(jié)果顯示：1)對(duì)5匹馬駒的20份糞樣進(jìn)行測(cè)序，共獲得有效序列數(shù)157 665條，獲得平均操作分類(lèi)單元(OTUs)1 117個(gè)。2)馬駒糞便中微生物群落α多樣性指數(shù)(ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))隨著馬駒月齡的增加呈波動(dòng)性變化，但各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。3)在門(mén)水平上，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、螺旋體菌門(mén)(Spirochaetes)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、無(wú)壁菌門(mén)(Tenericutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、TM7、廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)，其中以厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)及疣微菌門(mén)的豐度較高；在科水平上，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌分別為芽孢桿菌科(Bacillaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、動(dòng)球菌科(Planococcaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、BS11、RFP12、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)；在屬水平上，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌分別為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、德庫(kù)菌屬(Desemzia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Ureibacillus、Paludibacter、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希式桿菌屬(Escherichia)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、密螺旋體屬(Treponema)、艱難桿菌屬(Mogibacterium)。由此得出，采用Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)能夠準(zhǔn)確地對(duì)3～6月齡伊犁馬腸道微生物群落進(jìn)行分類(lèi)研究；厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)是3～6月齡伊犁馬腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

伊犁馬；Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)；腸道微生物群落；多樣性

馬是單胃動(dòng)物，其盲腸相當(dāng)于反芻動(dòng)物的瘤胃，可容納28～36 L的消化物和消化液。通過(guò)盲腸內(nèi)容物或糞便培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其微生物種類(lèi)有400～500種，數(shù)量可達(dá)1010～1012個(gè)/g[1-2]。定植于腸道內(nèi)的微生物參與腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及合成，是動(dòng)物腸道重要的組成部分。因此，促進(jìn)馬匹腸道微生物區(qū)系的建立，維持腸道正常菌群的平衡對(duì)馬匹消化吸收、腸道健康和免疫調(diào)控意義重大[3]。馬駒出生時(shí)腸道是無(wú)菌的，在分娩、哺乳及與周?chē)h(huán)境接觸過(guò)程逐漸感染細(xì)菌。隨著馬駒年齡、生活環(huán)境、飼糧結(jié)構(gòu)、健康狀況等的改變，腸道微生物的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、豐度隨之發(fā)生變化[4]。在應(yīng)激條件下這些因素的改變會(huì)導(dǎo)致馬駒腸道微生物區(qū)系紊亂，并引起腹瀉，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡。腸道菌群的平衡在馬的生長(zhǎng)發(fā)育、健康狀況方面扮演著重要角色[5]。早期補(bǔ)飼對(duì)馬駒生長(zhǎng)發(fā)育意義重大，過(guò)早的攝入補(bǔ)喂料對(duì)馬駒腸道微生物結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生一定的影響。3月齡馬駒隨著母乳減少逐漸開(kāi)始增加補(bǔ)喂料，飼糧由液態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為固態(tài)，其腸道微生物的種類(lèi)和豐度也隨之發(fā)生變化，從而影響馬駒腸道健康和生長(zhǎng)發(fā)育。鑒于此，本試驗(yàn)以3～6月齡的伊犁馬為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)糞便中微生物群落的多樣性，研究馬駒從3月齡到6月齡內(nèi)腸道微生物定植、演替的規(guī)律，為研究開(kāi)發(fā)適宜馬駒健康的微生物制劑或腸道微生物疾病防治等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間：2014年7月至2014年10月；試驗(yàn)地點(diǎn)：新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選取平均體重為(89.75±8.81) kg、出生日期相同的3月齡伊犁馬哺乳馬駒5匹。5匹馬駒與其母馬來(lái)自同一放牧草場(chǎng)，且母馬年齡(11歲)、胎次(7胎)均相同。在哺乳條件下，每天每匹馬駒按照體重的0.6%補(bǔ)喂精料補(bǔ)充料(每30 d調(diào)整1次補(bǔ)喂量，具體見(jiàn)表1)，并投喂等量的優(yōu)質(zhì)苜蓿干草，進(jìn)行為期90 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。分別在試驗(yàn)的第0天(即試驗(yàn)開(kāi)始的前1天)、第30天、第60天、第90天12:00前采集馬駒糞便樣品。

1.3 飼養(yǎng)管理及飼糧組成

試驗(yàn)馬駒與母馬均飼養(yǎng)于室外馬舍(長(zhǎng)75 m×寬40 m)。馬駒08:00—18:00拴系飼養(yǎng)，其余時(shí)間自由活動(dòng)。將馬駒全天的精料補(bǔ)充料分成3等份，分別在08:00、13:00、17:00使用料兜(料兜由本試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其大小和深淺符合馬駒采食精料，確保不影響馬駒呼吸及防止馬駒仰頭將精料撒出)補(bǔ)喂。所有試驗(yàn)馬駒每天提供等量[(1.00±0.25) kg]的優(yōu)質(zhì)苜蓿干草，自由飲水。樣品采集當(dāng)天馬駒室內(nèi)圈舍飼養(yǎng)，08:00將馬駒牽入室內(nèi)圈舍，單槽單欄位飼養(yǎng)，防止馬駒糞便互相混合。飼喂后打掃圈舍，為12:00前采集糞樣做準(zhǔn)備。精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1 精料補(bǔ)充料補(bǔ)喂量

1.4 馬駒糞便樣品采集

于試驗(yàn)的第0天、第30天、第60天、第90天的08:00將馬駒牽入室內(nèi)圈舍，單欄位拴系并套帶收糞袋。將每匹馬駒自進(jìn)圈后至12:00排出的全部糞便收集于集糞桶內(nèi)，混合均勻后，采用5點(diǎn)取樣法采集馬駒糞樣，每個(gè)點(diǎn)采集5 g，再將5個(gè)點(diǎn)共25 g糞樣混合均勻后立即裝入密封袋，-20 ℃冷凍保存，待測(cè)。

1.5 微生物測(cè)定樣品分組編號(hào)

在后續(xù)樣品測(cè)定及分析中分別將試驗(yàn)的第0天、第30天、第60天、第90天的樣品記為4個(gè)組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5匹馬駒的樣品視為1個(gè)組。

1.6 糞樣高通量測(cè)序分析

總DNA提取、PCR擴(kuò)增及Illumina HiSeq測(cè)序及結(jié)果分析均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

1.7 數(shù)據(jù)處理

Metastats分析使用R軟件在各分類(lèi)水平下做組間的置換檢驗(yàn)(permutation test)，得到P值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法對(duì)于P值進(jìn)行修正。組間差異顯著的物種分析利用R軟件做組間t檢驗(yàn)(t-test)。

表2 精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克精料補(bǔ)充料提供The premix provided the following per kg of the concentrate supplement：VA 3 000 IU，VB120 mg，VB220 mg，VB66 mg，VC 20 mg，VD 1 000 IU，VE 500 IU，泛酸 pantothenic acid 10 mg，煙酰胺 nicotinamide 100 mg，Cu 25 mg，F(xiàn)e 107 mg，Mn 81 mg，Zn 74 mg，I 6 mg，Se 14 mg，Co 3 mg，氯化膽堿 choline chloride 120 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were measured values.

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析

測(cè)序結(jié)果及α多樣性數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。對(duì)5匹馬駒的20份糞樣進(jìn)行測(cè)序，共獲得有效序列數(shù)157 665條，以97%的序列一致性(identity)，將序列共聚類(lèi)成4 471個(gè)操作分類(lèi)單元(OTUs)。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)序覆蓋率均達(dá)到96%以上，說(shuō)明本試驗(yàn)中獲得的序列代表了微生物界96%以上的細(xì)菌種系型，測(cè)序覆蓋率好，且各時(shí)間點(diǎn)均觀察到較豐富的物種。馬駒糞便中微生物群落α多樣性指數(shù)(ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))隨著馬駒月齡的增加呈波動(dòng)性變化，但各時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 β多樣性分析

基于OTUs水平的主成分分析(PCA)結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中主成分1(PC1)為第1主坐標(biāo)，對(duì)檢測(cè)到的總微生物的代表性貢獻(xiàn)率為17.28%，主成分2(PC2)為第2主坐標(biāo)，貢獻(xiàn)率為9.68%；4個(gè)組20個(gè)樣品能夠較明顯的區(qū)分開(kāi)，第0天、第30天能夠明顯與第60天、第90天分開(kāi)，第60天與第90天能夠明顯分開(kāi)，說(shuō)明同一時(shí)間點(diǎn)微生物群落的組成相似。

圖2左側(cè)顯示的是非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類(lèi)樹(shù)結(jié)構(gòu)，右側(cè)顯示的是各組在門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度分布?？梢钥闯?，第0天、第30天聚為一類(lèi)，第60天、第90天聚為一類(lèi)，說(shuō)明隨著馬駒月齡的增加，微生物群落趨于復(fù)雜化和多樣化。

表3 測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

圖1 主成分分析結(jié)果

2.3 馬駒腸道微生物構(gòu)成及分布豐度

綜合分析測(cè)序樣品的序列數(shù)，本試驗(yàn)研究了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)馬駒糞便中微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行了比較。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在各分類(lèi)水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在不同分類(lèi)水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例。

2.3.1 3～6月齡馬駒門(mén)水平上腸道微生物豐度

在門(mén)水平上馬駒腸道微生物豐度數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。由表中數(shù)據(jù)可知，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、螺旋體菌門(mén)(Spirochaetes)、無(wú)壁菌門(mén)(Tenericutes)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、TM7、廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)，占菌群分類(lèi)的98%以上，1%左右的為其他未被分類(lèi)的菌門(mén)，門(mén)水平上腸道微生物豐度柱狀圖如圖3所示。其中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)及疣微菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。隨著月齡的增加，馬駒糞便中各微生物的豐度發(fā)生了不同程度的變化。厚壁菌門(mén)的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為33.19%、32.90%、73.72%和67.89%，第60天時(shí)極顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)，第90天時(shí)顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.05)。放線菌門(mén)的豐度在試驗(yàn)第60天時(shí)達(dá)到1.34%，顯著高于試驗(yàn)第0天和第30天時(shí)(P<0.05)。無(wú)壁菌門(mén)的豐度隨著馬駒月齡的增加而增加，在試驗(yàn)第90天時(shí)為3.05%，顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.05)。擬桿菌門(mén)的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為40.97%、43.44%、0.49%和2.75%，第60天和第90天時(shí)極顯著低于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)。螺旋體菌門(mén)的豐度隨著馬駒月齡的增加先降低后趨于平穩(wěn)，試驗(yàn)第0天時(shí)為3.13%，與之相比，在試驗(yàn)第30天、第60天和第90天時(shí)顯著降低(P<0.05)。變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、TM7、廣古菌門(mén)的豐度在整個(gè)試驗(yàn)期無(wú)顯著性變化(P>0.05)，其中變形菌門(mén)的豐度在試驗(yàn)第30天時(shí)降低，第60天和第90天時(shí)又有所升高，與第0天時(shí)接近。

Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)；Spirochaetes：螺旋體菌門(mén)； Tenericutes：無(wú)壁菌門(mén)；Fusobacteria：梭桿菌門(mén)；Actinobacteria：放線菌門(mén)；Euryarchaeota：廣古菌門(mén)；Others：其他。圖3同 The same as Fig.3.

圖2 基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

圖3 3～6月齡馬駒門(mén)水平上腸道微生物豐度柱狀圖

2.3.2 3～6月齡馬駒科水平上腸道微生物豐度

在科水平上馬駒腸道微生物豐度數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。由表中數(shù)據(jù)可知，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌科分別為芽孢桿菌科(Bacillaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、動(dòng)球菌科(Planococcaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、BS11、RFP12、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，科水平上腸道微生物豐度柱狀圖如圖4所示。芽孢桿菌科的豐度在試驗(yàn)第60天時(shí)為22.31%，極顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)，顯著高于第90天時(shí)(P<0.05)。乳桿菌科的豐度在試驗(yàn)第90天時(shí)為5.77%，極顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)。瘤胃球菌科的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為11.93%、10.19%、3.44%和7.66%，第60天時(shí)極顯著低于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)，顯著低于第90天時(shí)(P<0.05)。毛螺旋菌科的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為6.98%、6.45%、2.96%和6.88%，第60天時(shí)顯著低于第0天、第30天和第90天時(shí)(P<0.05)。紫單胞菌科的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為2.58%、0.40%、0.02%和0.14%，第60天時(shí)極顯著低于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)。BS11的豐度在試驗(yàn)第0天、第30天、第60天和第90天時(shí)分別為8.95%、15.98%、0.06%和0.53%，第60天和第90天時(shí)顯著低于第0天和第30天時(shí)(P<0.05)。莫拉氏菌科、動(dòng)球菌科、肉桿菌科、RFP12的豐度在整個(gè)試驗(yàn)期無(wú)顯著性變化(P>0.05)

表5 3～6月齡馬駒科水平上腸道微生物豐度

Others：其他；Porphyromonadaceae：紫單胞菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科；Ruminococcaceae：瘤胃球菌科；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Carnobacteriaceae：肉桿菌科；Planococcaceae：動(dòng)球菌科；Moraxellaceae：莫拉氏菌科；Bacillaceae：芽孢桿菌科。

圖4 3～6月齡馬駒科水平上腸道微生物豐度柱狀圖

Fig.4 The histograms of abundances of micrbiota in intestine of 3- to 6-month-old colts at family level

2.3.3 3～6月齡馬駒屬水平上腸道微生物豐度

在屬水平上馬駒腸道微生物豐度數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。由表中數(shù)據(jù)可知，馬駒糞便中10大優(yōu)勢(shì)菌屬分別是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、德庫(kù)菌屬(Desemzia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Ureibacillus、Paludibacter、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希式桿菌屬(Escherichia)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、密螺旋體屬(Treponema)、艱難桿菌屬(Mogibacterium)，屬水平上腸道微生物豐度柱狀圖如圖5。乳桿菌屬的豐度在試驗(yàn)第90天時(shí)為5.77%，極顯著高于第0天、第30天和第60天時(shí)(P<0.01)。芽孢桿菌屬的豐度在試驗(yàn)第60天時(shí)為4.11%，極顯著高于第0天和第30天時(shí)(P<0.01)。

3 討 論

3.1 3～6月齡馬駒腸道微生物群落多樣性

近年，Illumina高通量測(cè)序技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域廣泛使用。利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠更深入、直觀、準(zhǔn)確地通過(guò)腸道微生物群落的穩(wěn)定性和多樣性的變化反映動(dòng)物的胃腸道健康和生長(zhǎng)發(fā)育情況[3,6-8]。Proughbred等[9]對(duì)8匹去勢(shì)純血馬的14份糞樣進(jìn)行測(cè)序，共獲得有效序列488 213條，OTUs的平均范圍為1 200～3 000個(gè)。Yatsunenk等[10]研究顯示，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)在人糞便中共檢測(cè)出97%以上覆蓋率的微生物細(xì)菌，OTUs超過(guò)2 000個(gè)。Costa等[11]在11匹馬糞便中共獲得有效序列數(shù)6 536 523條。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)Illumina HiSeq測(cè)序獲得5匹馬駒4個(gè)階段20個(gè)糞樣細(xì)菌16S rDNA有效序列數(shù)157 665條，且隨著馬駒月齡的增加獲得有效序列數(shù)在增加，從試驗(yàn)第0天的23 549條增加到第90天的53 617條；平均獲得1 117個(gè)OTUs，且OTUs數(shù)也隨著馬駒月齡的增加在增加，從試驗(yàn)初的1 005個(gè)增加到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的1 347個(gè)。通過(guò)α多樣性分析，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著馬駒月齡的增加，糞便樣品的α多樣性指數(shù)中ACE、Chao1、Shannon指數(shù)逐漸升高，Simpson指數(shù)則隨著馬駒月齡的增加逐漸降低，說(shuō)明隨著馬駒月齡的增長(zhǎng)、飼糧的變更，馬駒腸道微生物種類(lèi)越來(lái)越豐富，與Sakaitani等[4]報(bào)道的結(jié)果一致。隨著馬駒月齡的增加，馬駒采食的固體飼草料成為腸道系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，飼糧類(lèi)型的變更是影響腸道微生物結(jié)構(gòu)變化的主要因素[12]。本試驗(yàn)中，馬駒逐漸用精料補(bǔ)充料及苜蓿干草替代母乳，隨著母馬泌乳量的減少，馬駒在補(bǔ)喂定量精料補(bǔ)充料的基礎(chǔ)上，采食的粗飼料(苜蓿干草)增加，飼糧類(lèi)型逐漸改變。因此，隨著馬駒的生長(zhǎng)，馬駒糞便中檢測(cè)出微生物的種類(lèi)和數(shù)量更豐富、更多樣、更復(fù)雜。該結(jié)果與Combes等[13]在家兔上的研究結(jié)果一致，即日齡對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性和復(fù)雜性有顯著影響，其原因與飼糧的改變有直接的關(guān)系。

表6 3～6月齡馬駒屬水平上腸道微生物豐度

Others：其他；Mogibacterium：艱難桿菌屬；Treponema：密螺旋體屬；Carnobacterium：肉食桿菌屬；Escherichia：埃希式桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Desemzia：德庫(kù)菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬。

Others：其他；Mogibacterium：艱難桿菌屬；Treponema：密螺旋體屬；Carnobacterium：肉食桿菌屬；Escherichia：埃希式桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Desemzia：德庫(kù)菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬。

圖5 3～6月齡馬駒屬水平上微生物豐度柱狀圖

Fig.5 The histograms of abundances of micrbiota in intestine of 3- to 6-month-old colts by genera level

3.2 3～6月齡馬駒腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

馬腸道微生物定植的研究相對(duì)于反芻動(dòng)物較少。馬駒胎糞中沒(méi)有細(xì)菌，與馬駒腸道無(wú)菌結(jié)果相一致[4]。乳酸桿菌、梭狀芽胞桿菌、腸桿菌在馬駒出生后第3天從糞便中分離出來(lái)，12周齡的馬駒腸道纖維水解菌和乳酸菌的水平和成年馬相似[14]。當(dāng)馬駒到42日齡時(shí)，在其糞便中檢測(cè)到比母馬更豐富的微生物種群，且與母馬的相似度達(dá)到60%。在其他一些研究中，馬駒在42～80日齡與母馬腸道微生物種群相似度達(dá)到50%。因此，研究馬駒腸道微生物區(qū)系早期的建立對(duì)馬駒腸道健康及生長(zhǎng)發(fā)育意義重大。

許宇靜等[15]采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)研究斷奶幼兔盲腸微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)其在門(mén)水平上主要由厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和疣微菌門(mén)組成；在科水平上主要由瘤胃球菌科、毛螺旋菌科、擬桿菌科和紫單胞桿菌科組成。白秀娟等[16]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，斷奶仔兔腸道主要優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(mén)、毛螺旋菌科等。谷莉[17]采用454高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同飲食結(jié)構(gòu)條件下小鼠腸道厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)在馬駒糞便中檢測(cè)到豐度占99%以上門(mén)為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)、螺旋體菌門(mén)、無(wú)壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、TM7、廣古菌門(mén)，從豐度來(lái)看厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、螺旋體菌門(mén)為主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。與以上結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是單胃大型動(dòng)物和小型動(dòng)物腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌。本試驗(yàn)中，馬駒在門(mén)水平上發(fā)現(xiàn)較多的菌群，這與種間差異有關(guān)。Dougal等[6]研究結(jié)果顯示，在5匹純血馬和5匹矮種馬的大腸內(nèi)容物中檢測(cè)到的主要優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、螺旋體菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)。由此說(shuō)明在相同的種屬間腸道微生物菌群組成更接近。

此外，在鼠、豬、馬、牛等的研究中發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是其胃腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌群[18-20]，且厚壁菌門(mén)是攝食纖維飼料動(dòng)物胃腸道促進(jìn)纖維分解的主要菌群[21]。厚壁菌門(mén)能從纖維飼料中獲取更多能量滿足動(dòng)物生長(zhǎng)需要[22]。胃腸道菌群的豐度與消化能力有直接的關(guān)系[23-24]。厚壁菌門(mén)為馬駒優(yōu)勢(shì)菌群，這與盲腸、結(jié)腸為馬屬動(dòng)物主要的消化場(chǎng)所有關(guān)。擬桿菌門(mén)雖然隨著馬駒月齡的增加豐度有所降低，但仍然是馬駒腸道的優(yōu)勢(shì)菌群。擬桿菌門(mén)是草食動(dòng)物利用碳水化合物的主要菌群[25]，這與馬駒攝入纖維飼料有直接的關(guān)系。在單胃動(dòng)物豬的研究中，飼糧中添加抗生素會(huì)減少擬桿菌門(mén)的數(shù)量[26]。本試驗(yàn)精料補(bǔ)充料中并未添加有抗生素成分的藥品，但在試驗(yàn)前母馬使用過(guò)驅(qū)蟲(chóng)藥(主要成分為碘醚柳胺)，是否因?yàn)檫@個(gè)原因?qū)е埋R駒腸道擬桿菌門(mén)豐度降低有待于進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)中，隸屬于厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌科、乳桿菌科和瘤胃球菌科，隸屬于擬桿菌門(mén)的紫單胞菌科及螺旋體菌門(mén)的毛螺旋菌科隨著馬駒月齡的增加呈顯著性變化。研究顯示，草食動(dòng)物反芻或非反芻類(lèi)腸道內(nèi)包括毛螺旋科、纖維桿菌屬等在內(nèi)的細(xì)菌與其食草特性相關(guān)[27-28]。12周齡(3月齡左右)的馬駒腸道纖維降解菌數(shù)量和母馬相似[4]。在科水平上這些細(xì)菌豐度的變化與飼糧纖維含量的增加有直接的關(guān)系。毛螺旋菌科的細(xì)菌參與纖維素的降解[29]，其主要作用是降解植物飼料細(xì)胞壁中的果膠、果糖、纖維二糖等，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸等)，為動(dòng)物及腸道微生物提供能量。研究表明，飼糧變更是導(dǎo)致腸道微生物改變的首要原因[12]。在本試驗(yàn)中，隨著母馬泌乳量減少，馬駒采食固體飼糧的量逐漸增加，故而纖維攝入量增加，這可能是促進(jìn)與纖維降解相關(guān)菌種豐度增加的原因。

此外，變形菌門(mén)是動(dòng)物消化道的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其菌群龐大、種類(lèi)多樣，在臨床研究中對(duì)胃腸道疾病診斷意義重大。很多致病菌包括大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、霍亂弧菌、幽門(mén)螺桿菌都屬于變形菌門(mén)的γ-變形綱[30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，變形菌門(mén)在整個(gè)試驗(yàn)期間豐度沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，在科、屬水平上排在前10的優(yōu)勢(shì)菌群中未發(fā)現(xiàn)屬于變形菌門(mén)的有害菌。由此說(shuō)明，隨著馬駒月齡的增加，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等有益菌豐度的增加抑制或穩(wěn)定了屬于變形菌門(mén)的有害菌豐度的增加，從而維持馬駒腸道微生物細(xì)菌的穩(wěn)定性，保證馬駒腸道的健康。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)采用Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)獲得獲得5匹馬駒4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的20個(gè)糞樣的有效序列數(shù)為157 665條，平均OTUs 1 117個(gè)，滿足測(cè)序條件。

② 厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)為3～6月齡伊犁馬腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌群。

[1] PIETZAK M.Bacterial colonization of the neonatal gut[J].Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,2004,38(4):389-391.

[2] GORBACK S L,PLAUT A G,HAHAS L,et al.Studies of intestinal microflora.Ⅱ.Microorganisms of the small intestine and their relations to oral and fecal flora[J].Gastroenterology,1967,53(6):856-867.

[3] DALY K,STEWART C S,FLINT H J,et al.Bacterial diversity within the equine large intestine as revealed by molecular analysis of cloned 16S rRNA genes[J].FEMS Microbiology Ecology,2001,38(2/3):141-151.

[4] SAKAITANI Y,YUKI N,NAKAJIMA F,et al.Colonization of intestinal microflora in newborn foals[J].Journal of Intestinal Microbiology,1999,13(1):9-14.

[5] BLASER M J,FALKOW S.What are the consequences of the disappearing human microbiota[J].Nature Reviews Microbiology,2009,7(12):887-894.

[6] DOUGAL K,DE AL FUENTE G,HARRIS P A,et al.Identification of a core bacterial community within the large intestine of the horse[J].PLoS One,2013,8(10):e77660.

[7] O’DONNELL M M,HARRIS H M B,JEFFERY I B,et al.The core faecal bacterial microbiome of Irish Thoroughbred racehorses[J].Letters in Applied Microbiology,2013,57(6):429-501.

[8] STEWART C J,MARRS E C L,MAGORRIAN S,et al.The preterm gut microbiota:changes associated with necrotizing enterocolitis and infection[J].Acta Paediatrica,2012,101(11):1121-1127.

[9] PROUGHBRED C J,HUNTER J O,DARBY A C,et al.Characterisation of the faecal metabolome and microbiome of thoroughbred racehorses[J].Equine Veterinary Journal,2015,47(5):580-586.

[10] YATSUNENK O T,REY F E,MANARY M J,et al.Human gut microbiome viewed across age and geography[J].Nature,2012,486(7402):222-227.

[11] COSTA M C,STMPFLI H R,ALLEN-VERCOE E,et al.Changes in the equine fecal microbiota associated with the use of systemic antimicrobial drugs[J].BMC Veterinary Research,2015,11:19.

[12] FONTY G,CHAUCHEYRAS-DURAND F.Lescosystèmes digestifs[M].Pairs:Tech & Doc Publishing,2007.

[13] COMBES S,MICHELLAND R J,MONTEILS V,et al.Postnatal development of the rabbit caecal microbiota composition and activity[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,77(3):680-689.

[14] JULLIAND V,DE VAUX A,VILLARD L,et al.Preliminary studies on the bacterial flora of faeces taken from foals,from birth to twelve weeks.Effect of the oral administration of a commercial colostrum replace[J].Pferdeheilkunde,1996,12(3):209-212.

[15] 許宇靜,張煜坤,沈雪梅,等.采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)分析斷奶幼兔盲腸微生物群落的多樣性[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(9):2793-2802.

[16] 白秀娟,劉誠(chéng)剛,杜智恒,等.PCR-DGGE技術(shù)分析斷奶仔兔腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及多樣性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(9):64-69.

[17] 谷莉.不同鼠種的腸道菌群在不同飲食結(jié)構(gòu)干預(yù)中的組成改變[D].博士學(xué)位論文.長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2014.

[18] LEY R E,LOZUPONE C A,HAMADY M,et al.Worlds within worlds:evolution of the vertebrate gut microbiota[J].Nature Reviews Microbiology,2008,6(10):776-788.

[19] CALLAWAY T R,DOWD S E,EDRINGTON T S,et al.Evaluation of bacterial diversity in the rumen and feces of cattle fed different levels of dried distillers grains plus solubles using bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing[J].Journal of Animal Science,2010,88(12):3977-3983.

[20] DE MENEZES A B,LEWIS E,O’DONOVAN M,et al.Microbiome analysis of dairy cows fed pasture or total mixed ration diets[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,78(2):256-265.

[21] BRULC J M,ANTONOPOULOS D A,MILLER M E B,et al.Gene-centric metagenomics of the fiber-adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(6):1948-1953.

[22] RAY A K,BAIRAGI A,SARKAR G K,et al.Optimization of fermentation conditions for cellulase production byBacillussubtilisCY5 andBacilluscirculansTP3 isolated from fish gut[J].Acta Ichthyologica et Piscatoria,2007,37(1):47-53.

[23] JIAO J Z,WANG P P,HE Z X,et al.Invitroevaluation on neutral detergent fiber and cellulose digestion by post-ruminal microorganisms in goats[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2014,94(9):1745-1752.

[24] LOOFT T,ALLEN H K,CANTAREL B L,et al.Bacteria,phages and pigs:the effects of in-feed antibiotics on the microbiome at different gut locations[J].The ISME Journal,2014,8(8):1566-1576.

[25] SPENCE C,WELLS W G,SMITH C J.Characterization of the primary starch utilization operon in the obligate anaerobeBacteroidesfragilis:regulation by carbon source and oxygen[J].Journal of Bacteriology,2006,188(13):4663-4672.

[26] LOOFT T,JOHNSON T A,ALLEN H K,et al.In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109(5):1691-1696.

[27] BIAN G R,MA L,SU Y,et al.The microbial community in the feces of the white rhinoceros (Ceratotheriumsimum) as determined by barcoded pyrosequencing analysis[J].PLoS One,2013,8(7):e70103.

[28] DALY K,PROUDMAN C J,DUNCAN S H,et al.Alterations in microbiota and fermentation products in equine large intestine in response to dietary variation and intestinal disease[J].British Journal of Nutrition,2012,107(7):989-995.

[29] SHINKAI T,UEKI T,KOBAYASHI Y.Detection and identification of rumen bacteria constituting a fibrolytic consortium dominated byFibrobactersuccinogenes[J].Animal Science Journal,2010,81(1):72-79.

[30] EVANS N J,BROWN J M,MURRAY R D,et al.Characterization of novel bovine gastrointestinal tractTreponemaisolatesand comparison with bovine digital dermatitis treponemes[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(1):138-147.

*Corresponding author, professor, E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

A Study on Intestinal Microbiota Diversity of 3- to 6-Month-OldYiliHorses

LI Xiaobin ZHAO Guodong LIU Zhen WU Tingting HE Zhourui DENG Haifeng YANG Kailun*
(XinjiangKeyLaboratoryofHerbivoreNutritionforMeat&MilkProduction,XingjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

The current study was conducted to evaluate the intestinal microbiota diversity of 3- to 6-month-oldYilihorses, to reveal the regulation of succession of intestinal micrbiota before weaning, and to provide a theoretical basis for the researches of growth and intestinal health of young horse. Five 3-month-oldYilihorses with the average body weight of (89.75±8.81) kg and the same birth day were selected to conduct a 90-day feeding trial. The feces samples were collected on days 0 (1 day before the experiment), 30, 60 and 90 of the experiment, respectively. The microbial genomic total DNA was extracted from each feces sample. Microbiota diversity of feces was evaluated using Illumina HiSeq sequencing technology. The results showed as follows: 1) twenty feces samples for 5 colts were sequenced, a total of 157 665 effective sequences and 1 117 average operational taxonomic units (OTUs) were acquired. 2) The alpha diversity indexes (ACE, Chao1, Shannon and Simpson indices) of feces microbiota showed fluctuated changes with the age increasing, but the changes were not significant among different time points (P>0.05). 3) At the phylum level, ten dominant bacteria in feces of colts were Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Verrucomicrobia, Spirochaetes, Fusobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, TM7 and Euryarchaeota, and the abundances of Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria and Verrucomicrobia were higher. At the family level, ten dominant bacteria in feces of colts were Bacillaceae, Moraxellaceae, Planococcaceae, Carnobacteriaceae, BS11, RFP12, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae and Porphyromonadaceae. At the genera level, ten dominant bacteria in feces of colts wereAcinetobacter,Desemzia,Lactobacillus,Ureibacillus,Paludibacter,Bacillus,Escherichia,Carnobacterium,TreponemaandMogibacterium. Base on the results, it is concluded that the intestinal microbiota of 3- to 6-month-oldYilihorses can be accurately classified using Illumina HiSeq sequencing technology. The Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Verrucomicrobia were the dominant bacteria in intestine of 3- to 6-month-oldYilihorses.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1535-1544]

Yilihorses; Illumina HiSeq sequencing technology; intestinal microbiota; diversity

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.011

2016-11-11

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012BAD45B01)

李曉斌(1988—)，男，甘肅天水人，博士研究生，研究方向?yàn)椴菔硠?dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝。E-mail： 172387243@qq.com

*通信作者:楊開(kāi)倫，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

S852.6

A

1006-267X(2017)05-1535-10