彭騫騫 周 瑩 王雪敏 馮京海 甄 龍， 張少帥 常 玉 石玉祥 張敏紅*(.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京0093；.河北工程大學農學院，邯鄲0560)

不同相對濕度對間歇性26 ℃環(huán)境下肉雞盲腸菌群多樣性的影響

彭騫騫1,2周 瑩1*王雪敏2馮京海1甄 龍1，2張少帥1常 玉1石玉祥2張敏紅1**
(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.河北工程大學農學院，邯鄲056021)

本試驗旨在研究不同相對濕度(RH)對間歇性26 ℃環(huán)境下肉雞盲腸菌群多樣性的影響。選取29日齡愛拔益加(AA)肉雞180只轉入環(huán)境控制艙，隨機分成3個組(RH分別為30%、60%和85%)，每組6個重復，每個重復10只雞(公母各5只)。從29日齡開始，每天10：00—16：00(6 h)溫度維持26 ℃，RH分別為30%、60%和85%，剩余時間溫度為21 ℃，RH為60%。試驗共14 d。采用16S rDNA的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術，結合特異性和共性條帶割膠回收DNA進行克隆和測序，分析RH在間歇性26 ℃偏熱處理第7天和第14天時對盲腸內容物菌群結構和多樣性的影響。結果表明：1)試驗第7天，30%RH組肉雞盲腸DGGE條帶數(菌群豐富程度)高于60%RH組，而85%RH組低于60%RH組；試驗第14天，30%、85%RH組肉雞盲腸DGGE條帶數均高于60%RH組。2)聚類分析顯示，試驗第7天，85%RH對盲腸菌群影響明顯；試驗第14天，30%RH對盲腸菌群影響明顯。但隨著處理時間推移，30%RH對肉雞盲腸菌群影響越大。3)間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH組肉雞盲腸內共性菌群是Faecalibacteriumprausnitzii；在試驗第7天，30%、85%RH組肉雞盲腸中特異性菌群是Stomatobaculumlongum。結果提示：間歇性26 ℃環(huán)境下，低濕(30%RH)和高濕(85%RH)影響肉雞盲腸菌群的結構和多樣性，且不同處理時間RH的影響不同。

相對濕度；間歇熱；肉雞；盲腸菌群；變形梯度凝膠電泳

家禽腸道菌群對宿主營養(yǎng)吸收和腸道發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，進而影響家禽的生長與健康[1]。環(huán)境因素、飼糧和日齡均可影響腸道菌群[2-5]。研究報道，熱應激作用下，肉雞盲腸內菌群數量變化明顯，乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量顯著降低，大腸桿菌和產氣莢膜梭菌的數量顯著升高[6]，飼糧可顯著影響胃腸道菌群的組成和代謝活性[7]。長期以來，對家禽消化道菌群的研究，多利用傳統純培養(yǎng)法對菌群數量進行檢測[8]，但結果不夠準確。原因是由于胃腸道菌群絕大多數是厭氧的，但當下技術還不夠成熟，由此可見基礎培養(yǎng)方法對腸道菌群的分析局限性很大。據報道，用傳統培養(yǎng)技術，雞腸道內50%以上的正常菌群不易被檢測[9]。隨著現代新型技術的發(fā)展，分子生物學為研究腸道菌群提供了科學方便的方法[10]。本實驗室利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術研究發(fā)現，26 ℃持續(xù)偏熱處理減少了肉雞盲腸菌群的多樣性[11]，而且發(fā)現間歇性偏熱環(huán)境(26和31 ℃)和相對濕度(RH)誘導的應激顯著影響肉雞的生產性能、體溫和酸堿平衡[12]。目前為止，利用DGGE技術對肉雞腸道菌群影響因素的研究在飼糧成分[7,13]、日齡大小[14-17]、熱應激[18-19]方面有所報道，但有關RH在間歇性26 ℃環(huán)境下對肉雞腸道菌群的研究未見報道。因此，本試驗通過對肉雞盲腸菌群16S rDNA的DGGE圖譜進行分析，研究間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH對肉雞盲腸菌群多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選取180只29日齡健康愛拔益加(AA)肉雞，體重(1 210±13) g，隨機分成3個組，每組6個重復，每個重復10只雞(公母各5只)。試驗在動物營養(yǎng)學國家重點實驗室環(huán)境控制艙內進行，溫度、RH自動控制(精度分別為±1 ℃和±7%)，無風，24 h光照。試驗肉雞飼養(yǎng)在本實驗室研發(fā)的單層平養(yǎng)籠具[20]上，自由采食與飲水。試驗動物所用飼糧與文獻[21-22]保持一致。

1.2 試驗設計

22日齡肉雞在21 ℃、RH為60%的環(huán)境適應1周。29日齡時，將肉雞分別轉入3個環(huán)境控制艙，RH分別為30%、60%和85%，溫度在10：00—16：00(6 h)維持在26 ℃，剩余時間溫度為21 ℃，RH為60%至試驗結束，共14 d。

1.3 樣品的收集與處理

分別于試驗第7天和第14天，每組隨機選取6只雞(公母各3只，每重復選1只)，禁食12 h后處死，用5%新潔爾滅浸泡3 min，全身消毒，打開腹腔，結扎盲腸兩端，剪下后轉移至超凈工作臺，用無菌剪刀剪開盲腸腸壁，將同一組的6個樣品迅速混合均勻，放入無菌的2 mL離心管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 盲腸樣品分析

1.4.1 細菌總DNA的提取

[23]，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法，提取樣品基因組總DNA(由北京億鳴復興生物科技有限公司完成)。提取的基因組總DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因組總DNA 16S rDNA V3區(qū)擴增

根據參考文獻[24]設計出16S rDNA V3區(qū)引物(由北京億鳴復興生物科技有限公司合成)，見表1。

表1 引物序列

PCR擴增體系(50 μL)為：10×PCR緩沖液5 μL；dNTP(2.5 mmol/μL)3.2 μL；TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.4 μL；GC357F(20 μmol/μL)1 μL；517R(20 μmol/μL)1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火0.5 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit對PCR產物進行純化回收。PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient。

1.4.3 基因組總DNA 16S rDNA V3區(qū)擴增片段DGGE

取10 μL PCR的產物，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統進行凝膠電泳分析。采用濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠、變性梯度為30%～60%、150 V、60 ℃下在1×TAE緩沖液中電泳5～8 h。DGGE完畢后，參考文獻[25]進行硝酸銀染色。染色完畢后，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統掃描成像。

1.4.4 割膠回收差異條帶和共性條帶并克隆測序

用滅菌的手術刀切下條帶，目的條帶的回收采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit。以回收產物為模板，按1.4.2方法再次擴增16S rDNA V3區(qū)，把重新擴增的DNA片段切膠回收、純化，將產物連接在Pmd18-T載體上，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆，北京億鳴復興生物科技有限公司進行測序。測序結果分析在GenBank的Blast中進行。

1.5 數據處理

DGGE圖譜采用Quantity One軟件對每個樣品的條帶數目進行量化分析，用非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析。根據DGGE圖譜樣品條帶數及每個條帶灰度值，對各樣品中細菌多樣性指數進行分析。樣品的多樣性用香農-維納指數(H)、均勻度(E)和豐富度(S)表示。其算法如下：

式中：Pi為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐富度，Ni為第i條帶的豐富度；S是某樣品中所有條帶數目總和。

2 結果與分析

2.1 肉雞盲腸菌群結構分析

各部位樣品均是6只雞盲腸內含物的混合物。持續(xù)偏熱處理影響肉雞盲腸菌群的PCR-DGGE圖譜(圖1)，相同時間、不同RH處理下的圖譜均有差異。采用Quantity One軟件將肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜進行數字化分析，結果顯示：試驗第7天，30%RH組細菌條帶比60%RH組增加了2條，85%RH組細菌條帶比60%RH組減少了1條；試驗第14天，30%、85%RH組細菌條帶比60%RH組分別增加了8和5條。結果表明：試驗第7天，30%RH增加了肉雞盲腸菌群的多樣性，85%RH減少了肉雞盲腸菌群的多樣性；試驗第14天，30%、85%RH均增加了肉雞盲腸菌群的多樣性。相同RH處理，不同時間對肉雞盲腸菌群的PCR-DGGE圖譜影響也有差異。30%、85%RH組條帶在試驗第14天比第7天增加了5條，60%RH組則減少了1條，這說明30%、85%RH組處理時間對肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，而60%RH組則影響較小。

聚類分析結果(圖2)顯示，試驗第7天，30%、85%RH組和60%RH組的相似系數分別為71.2%、64.4%；試驗第14天，30%、85%RH組和60%RH組的相似系數分別為52.9%、65.2%；試驗第14天較第7天，30%RH組相似系數較85%RH組明顯下降。以上結果表明，試驗第7天，85%RH對盲腸菌群影響明顯；試驗第14天，30%RH對盲腸菌群影響明顯，且隨著處理時間推移，30%RH對肉雞盲腸菌群影響越大。

圖譜中數字為切膠編號 The numbers in the profiles showed excised gel No.。

圖1 肉雞盲腸內容物PCR-DGGE圖譜

Fig.1 PCR-DGGE profiles generated from cecum contents of broilers

2.2 肉雞盲腸菌群多樣性分析

根據PCR-DGGE圖譜中樣品條帶數目及每個條帶的強度，對各樣品中細菌多樣性指標進行分析。由表2可知，不同RH處理下肉雞盲腸菌群多樣性指標存在差異。試驗第7天，30%RH組盲腸菌群香農-維納指數和豐富度是2.81和20，85%RH組為2.65和17；試驗第14天，30%RH組盲腸菌群香農-維納指數和豐富度是3.03和25，85%RH組為2.96和22；且在整個試驗期間30%RH組香農-維納指數和豐富度均高于60%、80%RH組。試驗第7天，85%RH組香農-維納指數和豐富度均低于60%RH組；試驗第14天，30%、85%RH組香農-維納指數和豐富度均高于60%RH組。在試驗全期，各組的均勻度都在92%以上。結果表明，30%RH提高了肉雞盲腸菌群多樣性指數和豐富度；試驗第7天，85%RH降低了肉雞盲腸菌群多樣性指數和豐富度；試驗第14天，30%、85%RH提高了肉雞盲腸菌群多樣性指數和豐富度。

圖2 肉雞盲腸菌群PCR-DGGE聚類分析

時間Time相對濕度RH/%香農-維納指數Shannon?Wienerindex均勻度Evenness豐富度Richness第7天The7thday302．810．9420602．740．9518852．650．9317第14天The14thday303．030．9425602．620．9217852．960．9622

2.3 肉雞盲腸特異性菌群和共性菌群分析

從肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜中分別割膠回收了2個共性條帶和4個特異性條帶(見圖1中箭頭所指)，PCR擴增后克隆到Pmd18-T載體并測序，在 GenBank數據庫中進行比對分析，測序結果見表3，試驗第7、14天時盲腸均檢測到2和6號條帶(Faecalibacteriumprausnitzii)；間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH處理后，盲腸菌群也會出現明顯差異，在試驗第7天，1號條帶(Stomatobaculumlongum)均出現在30%、85%RH組，而60%RH組未發(fā)現；在試驗第14天，1和5號條帶(Stomatobaculumlongum和Faecalibacteriumprausnitzii)在30%RH處理下均不生長，在60%、85%RH組均被測出，4號條帶(Clostridiumthermosuccinogenes)均出現在30%、60%RH組，而85%RH組未發(fā)現。以上結果說明，在試驗第7天，30%、85%RH促進了Stomatobaculumlongum生長；在試驗第14天，30%RH抑制了Faecalibacteriumprausnitzii的定植，85%RH抑制了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。

在6個測序結果中，條帶序列分布于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，與GenBank數據庫中細菌的同源性絕大多數都大于95%，但條帶4數據庫中與之親緣關系最近的已鑒定的菌群的同源性僅為84%。因此這個序列所代表的菌群有可能為新的不可培養(yǎng)菌群。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對

3 討 論

3.1 持續(xù)偏熱環(huán)境對肉雞盲腸菌群多樣性的影響

Zhou等[26]研究表明，PCR-DGGE圖譜分析家禽腸道菌群需具備合適的樣本量，大量試驗結果表明最佳樣本量為5只雞。Gong等[27]采用同樣的分析技術研究肉雞嗉囊到盲腸黏膜細菌的組成，采用的樣本量為5只雞。彭騫騫等[11]在2015年應用DGGE技術對持續(xù)偏熱環(huán)境對肉雞盲腸菌群多樣性的研究，所采用的樣本量為6只雞。因此，本試驗采用6只肉雞盲腸內容物混合樣品，應用DGGE技術分析間歇性26 ℃環(huán)境下RH對肉雞盲腸菌群多樣性的影響。

研究顯示，盲腸對菌群多樣性影響很大[28]。盲腸菌群的多樣性以及1 g糞便含有1×1011CFU菌群使盲腸成為人們關注的焦點[7]。許多研究報道，肉雞腸道中盲腸菌群較豐富[29]。李永洙[19]利用PCR-DGGE技術發(fā)現肉雞生長期對盲腸菌群的影響最大。盲腸內菌群最豐富，隨著日齡的增長菌群種類會增加，28日齡達到穩(wěn)定狀態(tài)[27]。本試驗根據前人研究，選取盲腸對肉雞進行腸道菌群多樣性的研究。

本研究結果顯示，試驗第7天，85%RH降低了盲腸總菌數量，減少了肉雞盲腸菌群的多樣性；試驗第14天，30%、85%RH增加了盲腸總菌數量，改變了肉雞盲腸菌群的多樣性。30%、85%RH組條帶在試驗第14天比第7天增加5條，60%RH組則減少1條。這說明在30%、85%RH組中，處理時間對肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，60%RH組中則影響較小。前人研究表明，間歇性偏熱(26、31℃) 環(huán)境和RH誘導顯著影響肉雞的生長性能、體溫和酸堿平衡；而且85%RH顯著降低肉雞的平均日采食量和平均日增重，但對料重比都沒有顯著影響，顯著升高肉雞的體溫，造成酸堿平衡紊亂[12]。Adams等[30]闡述，持續(xù)29 ℃時，高濕(80% vs. 40%)降低了4～8周齡肉雞的生長率。本試驗研究表明，85%RH先減少后增加肉雞盲腸菌群多樣性，可能由于85%RH改變了肉雞腸道酸堿平衡，導致使腸道菌群平衡遭到破壞，從而降低了機體應對不良因素的能力。

3.2 持續(xù)偏熱環(huán)境對肉雞盲腸菌群結構的影響

家禽腸道中的細菌主要是厚壁門菌[27]。本試驗結果表明，間歇性26 ℃環(huán)境下，30%RH減少了Faecalibacteriumprausnitzii、Stomatobaculumlongum的生長，85%RH減少了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。Faecalibacteriumprausnitzii能代謝腸道未吸收的糖類產品產生大量丁酸，是腸道產生丁酸的主要細菌。它也可以分泌某種尚不明確的物質與丁酸產生抗炎作用，并且可以糾正腸道菌群失調[31-32]。Stomatobaculumlongum在基礎厭氧培養(yǎng)基主要的終末代謝產物是丁酸、乳酸、異戊酸和乙酸[33]。Clostridiumthermosuccinogenes主要發(fā)酵各種碳水化合物，主要產物為琥珀酸、醋酸和甲酸[33]。這3種細菌都屬于不可培養(yǎng)的厚壁門細菌，厚壁門菌和擬桿門菌中的大部分菌可產生降解植物細胞壁的酶，參與植物細胞壁的降解，從而與腸道的消化功能有關。研究表明，丁酸對宿主的腸道健康起到重要作用[34-37]。試驗第14天，30%、85%RH組條帶比試驗第7天增加5條，而60%RH組僅減少1條，由此可見，30%、85%RH對肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，60%RH則影響較小。高濕和低濕應激導致的肉雞腸道菌群數量和種類的改變，目前工作只是對部分條帶進行分析，菌種對其消化吸收是正效應亦或負效應有待進一步全面研究。

4 結 論

① 間歇性26 ℃環(huán)境下，30%、85%RH改變了肉雞盲腸菌群多樣性。

② 間歇性26 ℃環(huán)境下，30%RH處理下的特異性菌是Stomatobaculumlongum和Faecalibacteriumprausnitzii，85%RH抑制了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。

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*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail: zmh66@126.com

(責任編輯 田艷明)

Effects of Different Relative Humidity on Cecal Microflora Diversity of Broilers under Intermittent 26 ℃ Environment

PENG Qianqian1,2ZHOU Ying1*WANG Xuemin2FENG Jinghai1ZHEN Long1,2ZHANG Shaoshuai1CHANG Yu1SHI Yuxiang2ZHANG Minhong1**
(1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofAgriculture,HebeiUniversityof
Engineering,Handan056021,China)

This study was carried out to investigate the effects of different relative humidity (RH) on cecal microflora diversity of broilers under intermittent 26 ℃ environment. One hundred and eighty 29-day-old Arbor Acres (AA) broilers were assigned to three environment chambers (RH were 30%, 60% and 85%, respectively), each chamber contained six cages with ten birds per cage (five males and five females), and each cage as a replicate. When broilers were 29 days of age, the temperature of groups was at 26 ℃, regulating the RH to 30%, 60% and 85%, and the temperature and RH of groups were kept six hours each day at 10:00 to 16:00, and broilers were kept at 21 ℃ and 60% RH in the other time. The trial period lasted for 14 days. The effects of RH on bacterial community and diversity in the cecal digesta of broilers at the 7thand 14thday under intermittent 26 ℃ environment were analyzed by using 16S rDNA-based denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), combined with the cloning and sequencing of DNA recycled by specificity and generality stripe tapping. The results showed as follows: 1) on the 7thday, cecum DGGE bands number (flora abundance) of broilers in 30% RH group was higher than that in 60% RH group, while in 85% RH group was lower than that in 60% RH group; on the 14thday, cecum DGGE bands number of broilers in 30% and 85% RH groups was higher than that in 60% RH group. 2) Cluster analysis showed that on the 7thday, 85% RH affected the cecal microflora obviously, but on the 14thday, 30% RH did. And as treatment time processing, 30% RH made a greater effect on cecal microflora. 3) The common cecal microbiota of different RH groups under intermittent 26 ℃ environment wasFaecalibacteriumprausnitzii, and on the 7thday, the specific cecal microbiota in 30% and 85% RH groups wasStomatobaculumlongum. In conclusion, at the intermittent 26 ℃ environment, 30% and 85% RH can change the structure and diversity of cecal microflora of broilers, and the effects of RH at different processing time are different.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1527-1534]

relative humidity; intermittent partial heat environment; broilers; cecal microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.010

2016-11-04

國家科技支撐計劃課題“畜禽健康養(yǎng)殖環(huán)境控制關鍵技術研究與集成”(2012BAD39B02)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊項目(ASTIP-IAS07)

彭騫騫(1989—)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，畜牧學專業(yè)。E-mail: 18230221210@163.com

S831.4

A

1006-267X(2017)05-1527-08

*同等貢獻作者

**通信作者：張敏紅，研究員，博士生導師，E-mail: zmh66@126.com