李秋嫻，朱劍霞，古裕蓮，呂玉冰

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州511400)

LncRNA GAS5對結(jié)腸癌細胞生長及化療藥物作用的影響

李秋嫻，朱劍霞，古裕蓮，呂玉冰

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州511400)

目的檢測長鏈非編碼RNA生長抑制特異因子5(Lnc RNA GAS5)對結(jié)腸癌細胞的凋亡和生長的影響及其與化療藥物的敏感性是否有關(guān)聯(lián)。方法siRNA干擾結(jié)腸癌細胞株SW480 LncRNA GAS5基因，檢測細胞的存活率，加入化療藥物5氟尿嘧啶(5-FU)，檢測細胞的克隆形成能力，流式細胞儀檢測干擾前后細胞的凋亡。結(jié)果siRNA干擾結(jié)腸癌細胞SW480 LncRNA GAS5基因后，加入化療藥物5氟尿嘧啶，敲除GAS5基因后癌細胞存活率比敲除GAS5基因前多，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；敲除GAS5基因后，結(jié)腸癌細胞的克隆形成能力比敲除GAS5基因前強，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；流式細胞儀檢測敲除GAS5前后的結(jié)腸癌細胞，敲除GAS5后結(jié)腸癌細胞凋亡數(shù)量降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論GAS5可促進結(jié)腸癌細胞的凋亡；GAS5能促進化療藥物對結(jié)腸癌細胞的作用；GAS5可能作為抑癌基因存在于結(jié)腸癌細胞中，為結(jié)腸癌的分子靶向治療提供依據(jù)。

結(jié)腸癌；LncRNA GAS5；凋亡；增殖；5氟尿嘧啶

近年來的研究表明，長鏈非編碼RNAs具有調(diào)節(jié)多種生物過程的潛能，它們在多種腫瘤中存在異常表達。LncRNAs通過多種途徑參與基因表達，包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和染色體重構(gòu)[1]。研究表明許多人類疾病與lncRNAs的異常表達有關(guān)，特別是腫瘤。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)LncRNAs存在異常調(diào)節(jié)，提示LncRNAs可能作為潛在的致癌或抑癌RNAs[2]。

生長抑制特異因子5(growth arrest-specific 5 GAS5)在內(nèi)顯子中編碼多種核RNA，在外顯子中產(chǎn)生LncRAN。已證實GAS5在腎癌細胞株A498中低表達，上調(diào)GAS5的表達可抑制癌細胞的增殖，促進癌細胞凋亡和細胞周期停滯[3]。GAS5在前列腺癌細胞的表達與其細胞凋亡有關(guān)，轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛐「蓴_RNA后，GAS5表達增高，細胞凋亡增加及細胞生存率下降[4]。GAS5在乳腺癌組織中表達低于正常組織，并可獨立地誘導(dǎo)乳腺癌細胞生長停滯，促進凋亡[5]。有文獻報道GAS5的低表達會導(dǎo)致抑制血細胞的凋亡及加速細胞周期的進程，其正常表達是保持T細胞系的正常生長死亡及維持外周血T淋巴細胞穩(wěn)定的必要因素，它在細胞凋亡和細胞周期中的調(diào)控作用具有重大的意義[6]。有研究稱GAS5促進細胞凋亡是通過誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素效應(yīng)器作用于糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合域，令其缺乏營養(yǎng)或生長因子[7]。本研究通過敲除結(jié)腸癌細胞株SW480 LncRNA GAS5，研究LncRNA GAS5在結(jié)腸癌細胞的凋亡、增殖和對化療藥物的敏感性，為結(jié)腸癌的分子靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SiRNA干擾GAS5基因培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞SW480，在細胞達到對數(shù)增長期時開始實驗，制備細胞懸液5 000個/ML，接種到6孔板中，每孔做2個重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁培養(yǎng)4 h后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW620細胞。SiRNA引物5'-AGCTGGAAG TTGAAATGG，3'-CAAGCCGACTCTCCATACC，蘇州吉碼生物科技有限公司。

1.2 半數(shù)致死量確定制備細胞懸液5 000個/mL，接種到96孔板中，每孔約100 μL細胞懸液，每孔做3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁培養(yǎng)4 h，加入不同濃度的毒性物質(zhì)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，加入10 μL CCK8，孵化2 h，測定450 nm吸光度。

1.3 細胞活性檢測在96孔板中接種細胞懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5%CO2的條件下)；向每孔加入10 μL的CCK8溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h；用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.4 平板克隆抑制試驗取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用；將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50個、100個、200個細胞的梯度密度分別接種并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻；置于37℃，5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周；棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心浸洗2次；加4%多聚甲醛固定細胞5 mL固定15 min；然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，拍照。隨后加入10%冰醋酸溶液2 mL，靜置30 min，待結(jié)晶紫溶解后，取100 μL加入96孔板中，酶標儀讀取各孔560 nm波長處A值并計算克隆抑制率?？寺∫种坡?%)=(對照組A560-加藥組A560)/對照組A560×100%。

1.5 凋亡試驗用不含EDTA的胰酶消化細胞后收集細胞；用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，收集1～5× 105細胞；加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞；加入5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻；避光、室溫反應(yīng)10 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測，重復(fù)3次，取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-FU半數(shù)致死量的確定5-FU對SW480細胞的半數(shù)致死量的確定，最終可得出LD50=94 ng/mL，見圖1。

圖1 5-FU半數(shù)致死量的確定

2.2 SiRNA對細胞活力的影響轉(zhuǎn)染小干擾RNA后，細胞活力和轉(zhuǎn)染前細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，由此得出SiRNA對細胞活力并無明顯傷害和影響，見圖2。

圖2 SiRNA對細胞活力的影響

2.3 5-FU對轉(zhuǎn)染前后結(jié)腸癌細胞存活率的影響加入半數(shù)致死量的5-FU，轉(zhuǎn)染前細胞的存活率低于SiRNA干擾GAS5基因后的細胞，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 平板克隆抑制試驗SiRNA干擾GAS5基因后加入化療藥物5-FU，細胞的集落形成能力比干擾前增加，溶解結(jié)晶紫后，A560分別為(3.7±0.97)和(5.3± 1.01)，克隆抑制率為-(43.17±1.05)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，證明GAS5在化療藥物的作用下可加快細胞的凋亡，降低增殖，見圖4。

2.5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡SiRNA干擾GAS5基因后，加入化療藥物5-FU，細胞的凋亡率為(2.01±0.27)%，比干擾前的(20.21±1.32)%減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，證明GAS5可促進化療藥物對腫瘤細胞的作用，見圖5。

圖3 5-FU對細胞存活率的影響

圖4 平板克隆抑制試驗

圖5 轉(zhuǎn)染前后的細胞凋亡

3 討論

長鏈非編碼RNAs被普遍認為是非蛋白編碼RNA，其分子量大于200 bp，具有調(diào)節(jié)多種生物過程的潛能，它們在多種腫瘤中存在異常表達。LncRNAs逐步被證實為人類惡性腫瘤形成的重要的基因表達調(diào)控器，GAS5是一長鏈非編碼RNA，已在多種腫瘤組織中被檢測到低量表達，它具有促進細胞凋亡，使細胞周期停滯的功能，細胞凋亡受抑制將導(dǎo)致細胞生存期延長，并使突變的細胞繼續(xù)生長，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。GAS5在胃癌組織中的表達要低于正常組織，敲除GAS5可增加YBX1蛋白的轉(zhuǎn)化從而廢除胃癌細胞細胞周期的G1相時間，從而抑制胃細胞的癌變[8]。在惡性胸膜間皮瘤細胞中，lncRNA GAS5表達增加可增強啟動子活性，沉默GAS5可增加糖皮質(zhì)激素反應(yīng)體誘導(dǎo)激活亮氨酸拉鏈和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶-1的表達并縮短細胞循環(huán)[9]。GAS5在外周血的表達穩(wěn)定表達，非小細胞肺癌患者的外周血表達GAS5要明顯低于健康人群血清，術(shù)后表達GAS5比術(shù)前要明顯增多[10]。GAS5在非小細胞肺癌組織中的表達要明顯低于正常組織[11]。有研究把高表達GAS5的黑色素瘤細胞和敲除GAS5的黑色素瘤注入裸鼠后對比腫瘤組織的體積和重量，表明了GAS5在黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移和發(fā)展中起抗癌作用[12]。本研究用小干擾RNA沉默結(jié)腸癌細胞株SW480 GAS5后，細胞的凋亡減少，克隆形成能力增加，加入5-FU后，敲除了GAS5基因的結(jié)腸癌細胞存活率比敲除GAS5基因前強，凋亡數(shù)量減少，從而驗證了GAS5在腫瘤細胞的生長發(fā)育，細胞增殖、凋亡中可能是以抑癌基因參與細胞功能的調(diào)節(jié)，促進細胞凋亡，并增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。腫瘤的形成是多基因多因素導(dǎo)致的，致癌基因的激活、抑癌基因的受抑制是從分子生物學(xué)水平研究腫瘤的方向，本實驗顯示了GAS5基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的角色，為腫瘤的分子靶向治療提供了依據(jù)。

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Effect of LncRNA GAS5 on cancer cell survival and chemosensitivity in colon cancer.

LI Qiu-xian,ZHU Jian-xia, GU Yu-lian,LV Yu-bing.Department of Clinical Laboratory,Panyu District Central Hospital of Guangdong,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of LncRNA GAS5(growth arrest-specific 5)on apoptosis,cell viability and chemosensitivity of colon cancer.MethodssiRNA was used to interfere the expression of LncRNAs GAS5 in SW480 cell line.And the cell survival rate of the cells and the difference of the colony formation ability of the cells after 5 fluorouracil treatment was analyzed.Flow cytometry were introduced to evaluate the function of LncRNA GAS5 on apoptosis and chemosensitivity to 5 fluorouracil.ResultsAfter siRNA inference with SW480 LncRNA GAS5,5 fluorouracil treatment demonstrated cell viability significantly increased after GAS5 knockdown in SW480 cells compared with that before GAS5 knockdown(P＜0.05).Cell apoptosis rate reduced after GAS5 knockdown in SW480 cells(P＜0.05).Meanwhile flow cytometry detection showed colony formation ability significantly promoted(P＜0.05).ConclusionGAS5 could promote colon cancer cell apoptosis.GAS5 could promote the chemosensitivity of colon cancer cells to 5 fluorouracil.GAS5 may act as a tumor suppressor gene exists in colon cancer cells,and provide a new molecular therapy target for colon cancer.

Colon cancer;LncRNAGAS5;Apoptosis;Proliferation;5 fluorouracil

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.002

R735.3+5

A

1003—6350（2017）08—1209—03

2016-11-18)

廣東省廣州市番禺區(qū)科技信息局項目(編號：2014-Z03-066)

李秋嫻。E-mail：178248744@qq.com