朱作藝，張 玉，王君虹，黎天天，李 雪，王 偉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 320021；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

離子色譜-抑制電導(dǎo)、紫外串聯(lián)檢測肉類產(chǎn)品中的生物胺

朱作藝1,2，張 玉1,2，王君虹1,2，黎天天1，李 雪1,2，王 偉1,2*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 320021；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

建立1種陽離子交換色譜分離，抑制型電導(dǎo)-紫外串聯(lián)檢測法測定肉類產(chǎn)品中腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺、精胺、酪胺等7種生物胺的方法。樣品經(jīng)甲烷磺酸溶液提取，乙腈沉淀蛋白后，采用IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保護柱和IonPac CS17 (250 mm×4 mm) 分析柱進行分離，采用甲基磺酸溶液作為淋洗液進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。結(jié)果表明，在最佳色譜條件下，7種生物胺能達到較好的分離效果，在一定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，方法檢出限在0.35～3.16 mg·kg-1，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.1% (n=6)。采用該方法對風(fēng)干牛肉、小黃魚及帶魚樣品進行測定，樣品加標(biāo)回收率在88.2%～108.8%。該方法簡單、方便，具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，適用于各肉類產(chǎn)品中多種生物胺的同時測定。

離子色譜； 生物胺； 抑制電導(dǎo)； 紫外； 肉類產(chǎn)品

生物胺是一類低分子量含氨基化合物的總稱，可看作是氨分子上1～3個氫原子被烷基或芳香基所取代得到的物質(zhì)。按化學(xué)結(jié)構(gòu)來分類，生物胺可分為脂肪族(尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)、雜環(huán)族(組胺、色胺等)等。也可將其分為單胺(酪胺、組胺、苯乙胺、色胺等)與多胺(腐胺、精胺、亞精胺等)。

食品中的生物胺主要來源于游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基形成的產(chǎn)物。有文獻報道稱，部分生物胺是通過醛酮的胺化作用形成的[1-2]。生物胺廣泛存在于富含氨基酸、蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品、肉制品和發(fā)酵制品中，如干酪、酒類、發(fā)酵香腸、調(diào)味品等[3-9]。通常腐敗變質(zhì)的食品中含高水平的生物胺。

生物胺作為生物體內(nèi)正常的生理組分，適量的生物胺對維持機體正常生理功能具有重大意義。生物胺作為蛋白、核酸、激素的前體物質(zhì)，與生物體中蛋白質(zhì)、核酸、激素的合成有關(guān)；同時一定量的色胺、組胺、精胺、尸胺等在調(diào)節(jié)生長、增強代謝活力、控制血壓、消除自由基等方面具有顯著作用。但當(dāng)人體攝入過量的生物胺時，會引起頭疼、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及生命[10]。生物胺中毒性最大的是組胺，毒性次之的酪胺則易引起偏頭痛和高血壓等不適反應(yīng)。生物胺中的尸胺和腐胺雖然毒性較小，但是能抑制組胺和酪胺代謝酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性。同時尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等易與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌性物質(zhì)亞硝胺[11]。

生物胺分析檢測方法包括分光光度法、熒光測定法、薄層層析法、高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等[12]。分光光度法與熒光測定法只用于檢測較受重視的生物胺，如組胺和酪胺。目前，色譜法是最常用的生物胺分析檢測方法[13-17]。食品中生物胺的測定主要存在兩方面的困難：1)樣品基質(zhì)復(fù)雜，一些含量水平低的生物胺易被樣品中的其他組分干擾；2)生物胺分子量小，絕大多數(shù)生物胺本身既沒有熒光特性，也沒有特異的紫外吸收基團，因此多數(shù)檢測方法如高效液相色譜法、氣相色譜法需要對樣品進行繁瑣復(fù)雜的衍生化處理，同時還存在副產(chǎn)物的干擾。離子色譜是液相色譜的一種，可用于分析陰陽離子、極性及部分弱極性的有機化合物，具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好、樣品用量少等特點。生物胺在酸性溶液中呈陽性，帶正電荷，可用陽離子色譜柱進行分離。與高效液相法相比，離子色譜法檢測生物胺不需要衍生過程，方法簡單，減少了衍生化帶來的干擾和衍生物不穩(wěn)定等問題，從而使分析方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性得到提高。目前離子色譜法測定生物胺主要通過抑制電導(dǎo)檢測，但仍有部分生物胺(如酪胺)利用電導(dǎo)無法檢測。因此，本試驗將抑制電導(dǎo)與紫外檢測器串聯(lián)，實現(xiàn)具有電導(dǎo)信號生物胺(腐胺、尸胺、組胺等)與無電導(dǎo)信號生物胺(酪胺)的同時檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Dionex ICS-3000離子色譜儀(美國戴安公司)，配有DP雙泵(帶脫氣裝置)，DC檢測/色譜單元(雙溫控區(qū))，EG淋洗液發(fā)生器單元；Chromeleon色譜工作站；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS檢測器(美國戴安公司)；AS自動進樣器(美國戴安公司)；Dionex IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保護柱，Dionex IonPac CS17 (250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm電化學(xué)自再生抑制器；超純水系統(tǒng)；渦旋混勻器；離心機；0.22 μm尼龍濾膜過濾頭。

99%甲基磺酸(MSA，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm-1去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)品為酪胺(Tyramine)、腐胺(Putrescine)、尸胺(Cadaverine)、組胺(Histamine)、苯乙胺(Phenylethylamine)、亞精胺(Spermidine)和精胺(Spermine)，均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

準(zhǔn)確稱取各生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，置于50 mL容量瓶中，用10 mmol·L-1的MSA定容至刻度，搖勻，分別配制成1 000 mg·L-1的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

分別取適量的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用10 mmol·L-1的MSA進行稀釋，配制成一系列濃度的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 淋洗液配制

MSA (100 mmol·L-1)。取6.5 mL的99% MSA，用去離子水定容到1 L。

1.3 色譜條件

色譜柱為Dionex Ionpac CG17保護柱(50 mm×4 mm)和Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)；流動相為MSA梯度淋洗液(程序見表1)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；抑制電流103 mA；電導(dǎo)檢測池溫度35 ℃；紫外檢測波長276 nm；進樣量25 μL。

表1 淋洗液梯度程序

1.4 樣品前處理

樣品在勻漿機上徹底粉碎勻漿，取5 g待測樣品，加入50 mL的10 mmol·L-1的MSA，超聲提取30 min，冷凍離心機(溫度4 ℃，8 500 r·min-1)離心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈渦旋混勻，離心后取上層液體4 mL用去離子水稀釋到10 mL，混勻后過0.22 μm濾膜后進樣上機。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

生物胺是一類堿性含氮化合物，存在于肉制品基體內(nèi)部，因此需要對樣品進行充分的粉碎和勻漿后用酸溶液提取，將提取液在高速離心機上離心后取上清液稀釋。肉制品的上清液中含有大量的蛋白質(zhì)大分子，根據(jù)離子色譜的特點，必須先沉淀蛋白質(zhì)。由于乙腈的介電常數(shù)較小，沉淀蛋白質(zhì)的效率相對較高，而強酸和中性鹽的方法對樣品本身的pH干擾較大，同時會帶入其他干擾離子，因此用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑，操作方便，沉淀效果好。

2.2 流動相選擇和梯度的優(yōu)化

本試驗采用Dionex Ionpac CS17弱陽離子交換色譜柱，MSA作為淋洗液，在酸性流動相條件下，不同種類的生物胺根據(jù)所帶電荷的差異、離子半徑的大小以及極化程度的不同進行分離。在CS17陽離子交換色譜柱上，初始設(shè)置淋洗液濃度為等度的12 mmol·L-1的MSA，尸胺和腐胺之間沒有達到基線分離，組胺保留時間及與其他組分之間的分離效果較好，而亞精胺、苯乙胺、精胺等保留時間過長，因此對淋洗液的條件進行了梯度優(yōu)化，將初始淋洗液濃度降到10 mmol·L-1的MSA，腐胺與尸胺在低濃度淋洗液條件下能達到較好的分離，在12 min后增加淋洗液濃度進行梯度洗脫，按照表1中的甲烷磺酸淋洗液梯度條件能夠同時對7種生物胺進行較好地分離(標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1)。由于酪胺經(jīng)過抑制后缺少電荷，無電導(dǎo)信號，而通過紫外檢測具有良好的信號，從而可實現(xiàn)酪胺與其他生物胺的同時測定。

A為抑制電導(dǎo)檢測；B為紫外檢測；1為腐胺，2為尸胺，3為組胺，4為亞精胺，5為苯乙胺，6為精胺，7為酪胺，圖2同圖1 生物胺的標(biāo)準(zhǔn)色譜

從圖1中可以看出，其中個別生物胺(苯乙胺)的峰較寬，主要原因是生物胺結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)或雜環(huán)等結(jié)構(gòu)，而離子交換樹脂的基體是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，這些結(jié)構(gòu)與色譜柱的基體具有相似相溶性，從而導(dǎo)致峰寬較寬。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

為了考察分析方法的線性關(guān)系及檢出限，將7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品用10 mmol·L-1的MSA稀釋得到一系列濃度，按照色譜條件1.3節(jié)對上述系列濃度進行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)r和檢出限(信噪比S/N=3)等如表2所示。被測組分的峰面積與進樣濃度呈良好線性關(guān)系，且線性范圍寬，檢測限較低，適于樣品中低含量生物胺檢測分析。

2.4 方法的重現(xiàn)性

通過對同一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.3節(jié)色譜條件平行分析6次考察方法的重復(fù)性，其中7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1。試驗結(jié)果表明，7種生物胺的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于4.1%(表2)，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 生物胺線性關(guān)系、檢出限及重現(xiàn)性

生物胺線性范圍/(mg·L-1)相關(guān)系數(shù)方法檢出限/(mg·kg-1)峰面積RSD/%腐胺0.1～1000.99900.351.8尸胺0.1～1000.99980.431.2組胺0.2～1000.99961.092.5亞精胺0.1～1000.99960.392.9苯乙胺0.5～1000.99991.763.6精胺0.1～1000.99910.562.6酪胺0.5～1000.99983.164.1

2.5 樣品測定及加標(biāo)回收率

按照1.4節(jié)樣品前處理和1.3節(jié)色譜條件對風(fēng)干牛肉、冰鮮小黃魚及帶魚樣品進行測定，外標(biāo)法定量，其中風(fēng)干牛肉樣品及加標(biāo)色譜圖如圖2所示。通過在樣品中加入一定濃度的混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，平行測定3次，加標(biāo)回收率結(jié)果見表3，加標(biāo)回收率在88.2%～108.8%，RSD均小于4.8%，表明該方法符合樣品分析的要求。

3 小結(jié)

綜上所述，本方法采用陽離子交換分離，抑制型電導(dǎo)檢測測定了肉類樣品中的腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺以及精胺，同時將電導(dǎo)檢測器與紫外檢測器串聯(lián)，紫外作為電導(dǎo)檢測的補充，實現(xiàn)了多種生物胺與無電導(dǎo)信號的酪胺的同時檢測。該方法簡單、方便，通過方法學(xué)驗證，線性范圍寬，線性關(guān)系良好，方法具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。該方法避免了其他色譜法復(fù)雜和煩冗的衍生過程，又可實現(xiàn)多種生物胺的同時檢測，適用于一系列復(fù)雜樣品基體中生物胺的測定。

圖2 風(fēng)干牛肉樣品(a)及加標(biāo)(b)色譜圖

生物胺風(fēng)干牛肉小黃魚帶魚測定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%測定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%測定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%腐胺37.2101.44.89.593.62.14.292.33.3尸胺10.0105.91.314.994.71.93.691.52.6組胺12.496.70.4-98.31.1-94.90.9亞精胺15.9108.80.95.2102.41.84.898.32.3苯乙胺-91.63.2-88.23.6-90.44.0精胺66.9101.32.013.6103.52.56.8105.72.2酪胺39.898.90.911.898.21.4-96.52.7

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2016-12-25

浙江省自然科學(xué)基金(LQ15C200006，LY15C200010)；國家自然科學(xué)基金(31401495)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項目

朱作藝(1987—)，女，助理研究員，研究方向為食品質(zhì)量與安全，E-mail: zhuzuoyi2008@126.com。

王 偉，E-mail: wangwei5228345@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170407

TS251

B

0528-9017(2017)04-0572-05

文獻著錄格式：朱作藝，張玉，王君虹，等. 離子色譜-抑制電導(dǎo)、紫外串聯(lián)檢測肉類產(chǎn)品中的生物胺[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：572-576.