張雪華，賈燕

濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧272011

Thl7細(xì)胞在急性髓系白血病中表達(dá)失衡的研究

張雪華，賈燕

濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧272011

研究Thl7細(xì)胞在急性髓系白血病(AML)患者骨髓與外周血中的表達(dá)水平，進(jìn)一部探討急性髓系白血病的發(fā)病機(jī)制。并探討Thl7細(xì)胞比例的改變與病人臨床的相關(guān)性。方法①用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR)分別檢測AML初診組、化療完全緩解及正常對照組骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17轉(zhuǎn)錄因子（RORC)的表達(dá)水平。②用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測AML初診組、化療完全緩解及正常對照組外周血中Thl7細(xì)胞所占比例。結(jié)果AML初診組外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平（0.98±0.058）明顯低于完全緩解組（2.08±0.76）及正常對照組（1.79±0.306），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。AML初診組(中位數(shù)0.000 036 418 3范圍0.000 003 328 5～0.001 410 087 1）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs)RORC mRNA的表達(dá)水平明顯低于完全緩解組（中位數(shù)0.000 187 543 4范圍0.000 025 426 0～0.001 221 892 7）及正常對照組（中位數(shù)0.002 644 026范圍0.000 063 627 0～0.000 956 465 1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。初診組（中位數(shù)0.000 036 798 3范圍0.000 005 010 3～0.000 512 556 9）骨髓單個(gè)核（BMMCs)RORC，顯著低于完全緩解組（中位數(shù)0.000 102 885 9范圍0.000 014 073 4～0.001 568 208 7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001)。初診的AML患者接受治療達(dá)到完全緩解后外周血RORC mRNA的表達(dá)恢復(fù)到正常水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Thl7細(xì)胞表達(dá)失衡可能與AML的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

急性髓系白血病，Th17細(xì)胞；RORC；mRNA

急性髓系白血病(AML)是一種血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要發(fā)生于成年人。近年來治療方法雖然有所改進(jìn)對于大多數(shù)類型的AML患者預(yù)后依舊不良。部分患者經(jīng)化療難以獲得緩解，或者獲得緩解后復(fù)發(fā)。近年來，大量研究關(guān)于免疫系統(tǒng)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用表明Th亞群失衡有利于惡性血液系統(tǒng)疾病的發(fā)展。Th17細(xì)胞與Treg都來源于初始T細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+細(xì)胞，在機(jī)體免疫防御中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受功能相互拮抗，在維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在AML患者的骨髓中表達(dá)失衡。而且多項(xiàng)研究表明腫瘤的微環(huán)境中Treg細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。研究Th17細(xì)胞在急性髓系白血病中的變化，有利于對急性髓系白血病發(fā)病機(jī)制的研究，為急性髓系白血病（AML)免疫治療提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集90例初診AML患者（42例女性，48例男性）78例完全緩解的AML患者（31例女性及48例男性）28名正常對照（13名女性，15名男性）外周血和部分初診者和完全緩解者的骨髓，并搜集相應(yīng)的臨床資料。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)對胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行研究

使用肝素抗凝的外周血全血與同等體積的RPMI 1 640培養(yǎng)基（400 μL）在終濃度50 ng/mLPMA（phorbol myristate acetate）、1 μM離子霉素和500 ng/mL莫能霉素（monensin）刺激下，在37℃、5%CO2孵育4 h。PMA和離子霉素的藥理作用是T細(xì)胞活化劑，是一種TCR復(fù)合物產(chǎn)生的模擬信號(hào)，并有激活任何特異性T細(xì)胞抗原的優(yōu)勢。莫能霉素是用來阻止細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子在細(xì)胞積累。孵育后，用PE-Cy5標(biāo)記的CD3和抗CD8單克隆抗體染色,在室溫下,避光持續(xù)20 min；表面染色后,細(xì)胞固定破膜，然后根據(jù)說明書用FITC標(biāo)記的anti-IFN,PE標(biāo)記的anti-IL-17。同時(shí)給出了同型對照，以確認(rèn)抗體特異性。最后使用Beckman gallios cytometer(Beckman Coulter,USA)流式細(xì)胞儀對染色細(xì)胞進(jìn)行了分析，并配備Summit軟件光盤。分析Th亞群時(shí)首先在淋巴細(xì)胞中畫出CD3+CD8-的細(xì)胞。然后在CD3+CD8-的門中分析Th17(CD3+CD8-IL-17+)細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測Th17細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA的表達(dá)量

使用Ficoll密度梯度離心法分離AML患者EDTA抗凝的外周血與骨髓PBMCs和BMMCs。利用常規(guī)Trizol方法進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。具體造作步驟如下：①收集1×106細(xì)胞分入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol充分混勻，保存于-20～-80℃的冰箱中，以防止RNA降解。(放入-80℃儲(chǔ)存的標(biāo)本，向其中加入1 mL Trizol，用移液槍反復(fù)吹吸至無明顯沉淀，移入一新EP管中，室溫靜置5 min。②加入氯仿（Trizol的1/5體積量，200 uL），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿易揮發(fā)，震蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開），待充分成成乳糜狀，室溫靜置5 min。③12 000 rpm 4℃離心15 min（從離心機(jī)中小心取出Ep管，此時(shí)勻漿液分為三層，即無色的上清液，中間的白色蛋白層，下層為有機(jī)相），吸取上清液，移至一新的Ep管中。（切忌吸出中間層）④加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置10 min。⑤12 000 rpm 4℃離心15 min，一般在離心后試管底部會(huì)出現(xiàn)白色沉淀，用移液器吸棄上清。⑥緩慢沿離心管壁加入75%乙醇500 uL（切勿觸及沉淀）,輕輕上下顛倒，12 000 rpm 4℃離心5 min，小心棄去乙醇，室溫放置15 min，使乙醇揮發(fā)。⑦各管中分別加入適量的DEPC-ddH2O混勻溶解，-80℃保存，盡快反轉(zhuǎn)。⑧儀器測定RNA濃度和純度。把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA反轉(zhuǎn)錄體系如表1。

表1 反轉(zhuǎn)體系(20 uL)

短暫離心混勻后，37℃反應(yīng)15 min，85℃5 s，短暫離心使管壁的水份沉于管底。實(shí)時(shí)熒光定量檢測反應(yīng)體系如表2。

表2 反應(yīng)體系(10 uL)

2 結(jié)果

2.1 Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA在骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)

AML初診患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMCs)中RORC表達(dá)（中位數(shù)0.000 036 8范圍0.000 005 01～0.000 513）較緩解組（中位數(shù)0.000 103范圍0.000 014 1～0.001 57），顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001)[圖1]。AML初診組(中位數(shù)0.000 036 4范圍0.000 003 33～0.001 41）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs)RORC mRNA的表達(dá)水平明顯低于完全緩解組（中位數(shù)0.000 188范圍0.000 025 4～0.001 22）及正常對照組（中位數(shù)0.00264范圍0.000 063 6～0.000 956），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001) [圖2]。

2.2 Th17亞群細(xì)胞在AML患者外周血中失衡

圖1

圖2

圖3

圖4

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Th17細(xì)胞在AML的外周血中失衡。Th17在適應(yīng)性免疫中起重要的作用，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在初診組中(0.987±0.058)相對于緩解組(2.08± 0.76)和正常對照組（1.79±0.31)明顯降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)[圖3]。

2.3 化療使初診患者的Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC回復(fù)到正常水平

為進(jìn)一步了解Th17細(xì)胞在急性髓系白血病中的作用，追蹤隨訪28例急性髓系白血病(AML)患者從初診到經(jīng)過化療達(dá)到完全緩解。該研究發(fā)現(xiàn)AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞RORC的表達(dá)水平經(jīng)過化療后恢復(fù)到正常水平[圖4]。

4 討論

急性髓系白血病是一種起源于骨髓造血干細(xì)胞的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，主要發(fā)生于成年人，嚴(yán)重威脅人類的生存健康。近年來隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高和新藥的開發(fā)，急性髓系白血病(AML)的治療有了很大的提高，但是對于大多數(shù)類型的AML預(yù)后依舊不良。大量的研究表明免疫系統(tǒng)的失衡能夠促進(jìn)急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展。Frida Ewald Sander的研究表明Th細(xì)胞的失衡可引起急性髓系白血病細(xì)胞的免疫逃逸，與急性髓系白血病的復(fù)發(fā)有關(guān)[1],最進(jìn)研究[2]表明在急性髓系白血病中Treg細(xì)胞和與它相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10及其重要的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3在初診的白血病患者骨髓中比通過治療完全緩解后的病人骨髓中明顯增高。Th17細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)的重要因子在免疫性疾病和炎性疾病中起著重要的作用。已有研究表明Th17細(xì)胞與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但仍存在著爭議。在一些惡性腫瘤疾病Th17細(xì)胞與患者的生存預(yù)后成正相關(guān)，而在一些類型的癌癥中Th17與患者的生存預(yù)后成負(fù)相關(guān)[3]。Th17細(xì)胞在抗腫瘤的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，通過釋放炎性因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫殺傷腫瘤細(xì)胞，然而Amicarella F等人認(rèn)為Th17在結(jié)腸癌中起雙刃劍的作用，既有促進(jìn)疾病發(fā)展的作用也有阻礙疾病發(fā)展的作用[4-5]。

Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞都起源于初始的CD4+細(xì)胞，它們之間相互拮抗對維護(hù)機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要的作用[6]。Th17/Treg的比例失調(diào)能夠促進(jìn)一些疾病的發(fā)生例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，SLE等[7-9]。Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，促使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。Th17主要通過IL-17等細(xì)胞因子動(dòng)員、募集和活化中性粒細(xì)胞，介導(dǎo)促炎性反應(yīng)。在之前的研究已證明Treg細(xì)胞在初診急性髓系白血病病人骨髓與外周血中都有明顯的升高[10]。在血液系統(tǒng)其他腫瘤中已發(fā)現(xiàn)Th17/Tregs失衡的現(xiàn)象，例如李晶晶等人在骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)Th17/ Treg失衡的現(xiàn)象[11]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以被升高的Treg細(xì)胞抑制，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[12]。

該研究表明Th17的轉(zhuǎn)錄因子RORC在初診急性髓系白血患者的外周血單個(gè)核和骨髓單個(gè)核細(xì)胞中明顯的比治療緩解的患者和正常人明顯的降低，甚至不表達(dá)。Th17細(xì)胞在初診組外周血比治療緩解后患者外周血和正常人外周血也明顯的降低。結(jié)合之前關(guān)于Treg細(xì)胞的研究可以推斷Th17/Treg細(xì)胞存在著失衡。Th17/ Treg的失衡可能對急性髓系細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展起其重要的作用。Th17的減少降低了對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用，而增加的Treg細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。研究急性髓系細(xì)胞白血病中Th17的失衡有利于對急性髓系白血病發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步闡述，可為急性髓系白血病的免疫治療提供有力的參考依據(jù)。

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Research on Thl7 Cell in the Imbalance Expression in the Acute Myeloid Leukemia

ZHANG Xue-hua,JIA Yan
Jining First People’s Hospital,Jining,Shandong Province,272011 China

ObjectiveTo research the expression level of Thl7 cell in bone marrow and peripheral blood of AML patients and further study the pathogenesis pf acute myeloid leukemia and correlation between Thl7 cell ratio change and patients clinical manifestations.MethodsThe expression level of RORC in bone marrow and peripheral blood in the AML first-visit group,chemotherapy complete remission group and normal control group were tested by the RT-PCR.The Thl7 cell ratio in peripheral blood in the AML first-visit group,chemotherapy complete remission group and normal control group was tested by the flow cytometry.ResultsThe Th17 cell expression level in the peripheral blood in the AML first-visit group was obviously lower than that in the chemotherapy complete remission group and normal control group,[（0.98±0.058）vs（2.08± 0.76）,（1.79±0.306）],and the difference had statistical significance（P＜0.05),the（PBMCs)RORC mRNA expression level in the AML first-visit group(median:0.000 036 418 3,range;0.000 003 328 5～0.001 410 087 1),was obviously lower than that in the complete remission group,(median:0.000 187 543 4,range:0.000 025 426 0～0.001 221 892 7)and in the normal control group,(medians:0.002 644 026,range:0.000 063 627 0～0.000 956 465 1),and the difference had statistical significance,P＜0.001,and the（BMMCs)RORC in the first-visit group(medians:0.000 036 798 3,range:0.000 005 010 3～0.000 512 556 9)was obviously lower that in the complete remission group,(medians:0.000 102 885 9,range:0.000 014 073 4～0.001 568 208 7),and the difference had statistical significance（P＜0.001）,and the RORC mRNA expression returned to the normal level after treatment in the AML first-visit group with statistical significance.ConclusionThe imbalance expression of Thl7 cells may be related to the occurrence and development of AML.

Acute myeloid leukemia;Th17 cell;RORC;mRNA

R733.71

A

1672-5654（2017）03（b）-0041-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.08.041

2016-12-12）

張雪華（1987-），女，山東濟(jì)寧人，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：血液腎臟。