肖振勇+盧國輝+覃軍+閆憲磊+陳家康+李學(xué)東

【摘要】目的研究人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hPDBMSCs）紋狀體移植對帕金森?。≒D）模型大鼠行為學(xué)的影響。方法體外傳代培養(yǎng)hPDBMSCs，使用6OHDA制備大鼠PD模型并隨機(jī)分為移植組、假手術(shù)組、模型組，對移植組大鼠右側(cè)紋狀體進(jìn)行hPDBMSCs移植，術(shù)后1 W、2 W、4 W進(jìn)行行為學(xué)檢測。免疫組化檢測移植后1 W、2 W及4W各組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)。結(jié)果hPDBMSCs移植后2 W、4 W，移植組大鼠阿樸嗎啡誘導(dǎo)的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于假手術(shù)組及模型組（P<0.01）；免疫組化顯示移植組損傷側(cè)黑質(zhì)部位移植后4 W TH陽性細(xì)胞數(shù)較移植前明顯增加（P<0.01）；與假手術(shù)組相比，移植術(shù)后1 W、2 W、4 W移植組TH陽性細(xì)胞明顯增多（P<001）。結(jié)論hPDBMSCs移植能夠抑制PD模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元喪失，改善PD模型大鼠的行為學(xué)癥狀，具有一定的治療作用。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；底蛻膜；神經(jīng)保護(hù)；帕金森病

中圖分類號：R742.5；R457.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells（hPDBMSCs） striatum transplantation in the treatment of Parkinsons disease（PD） on rat models.MethodshPDBMSCs were cultured in vitro.PD rat models were prepared by 6OHDA and divided into transplantation group，sham operation group and model group.HPDBMSCs transplantation was performed on the right striatum of the transplantation group，and behavioral detection was carried out 1W，2W and 4W after operation.Immunohistochemical method was used to detect expression of tyrosine hydroxylase （TH） in wounded sides among all the groups 1W，2W and 4W after transplantation.Results2W and 4W after transplantation，mean rotational circle induced by apomorphine（APO） in the transplantation group were lower than those in the sham operation group and the model group（P<0.01）.Immunohistochemistry showed that TH positive cell numbers of the substantia nigra in the wounded sides 4W after transplantation significantly increased compared with those before transplantation in the transplantation group（P<0.01）.Compared with the sham operation group，TH positive cell numbers 1W，2W and 4W after transplantation in the transplantation increased more significantly（P<0.01）.ConclusionhPDBMSCs transplantation can inhibit the loss of dopaminergic neuron，improve behavioral symptoms of PD model rats，it has certain treatment effects.

【Key words】mesenchymal stem cells；decidua basalis；neuroprotection；PD

帕金森?。≒arkinsons Disease，PD）是一種較為常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前臨床上尚無有效方法延緩疾病的進(jìn)展。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始探索通過細(xì)胞移植來延緩或抑制中腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，從而恢復(fù)神經(jīng)環(huán)路中多巴胺遞質(zhì)的水平治療PD。目前已有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）移植能夠改善帕金森病模型大鼠的行為學(xué)癥狀。人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells，hPDBMSCs）具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)、免疫表型和功能特點(diǎn)[1]。因而，本實(shí)驗(yàn)擬通過對PD大鼠紋狀體進(jìn)行hPDBMSCs移植，探討人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對PD模型大鼠的行為學(xué)的影響。

1資料與方法1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用大鼠均為SPF級SD大鼠，雌雄各半，共100只，體重180～220 g，8～12周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號：SCXK桂2003-0005）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑及器材DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；6羥基多巴（6hydroxydopamine，6OHDA）、阿樸嗎啡（apomorphine，APO）、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH；Sigma公司，美國）；SP三步法免疫組化試劑盒及SP兩步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）；腦立體定向儀（Stoelting公司，美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱（SHEL LAB公司，美國），Eppendorf 5810R低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），ULWCD0.30倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)（Leica公司，德國）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1hPDBMSCs的復(fù)蘇與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為hPDBMSCs細(xì)胞系，為南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科盧國輝博士所饋贈，相關(guān)細(xì)胞分離培養(yǎng)過程及鑒定結(jié)果見文獻(xiàn)[1]。復(fù)蘇過程中需將凍存的hPDBMSCs細(xì)胞從液氮罐中取出，快速移入37℃溫水中進(jìn)行解凍，完全解凍后移入離心管中加入10倍體積的DMEM/F12培養(yǎng)基，置入離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速為1000 rpm。去除上清液后用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，按1×106/L密度接種于25T培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合達(dá)到80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，定期在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。傳代3次后留取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.2.2帕金森病大鼠模型的制作參照大鼠腦立體定向圖譜[2]，使用6OHDA建立PD大鼠模型，右側(cè)中腦黑質(zhì)致密部（SNc）靶點(diǎn)坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，中線偏右1.7 mm，硬膜下7.5 mm。右側(cè)中腦腹側(cè)被蓋（VTA）靶點(diǎn)坐標(biāo)：前囟后4.6 mm，中線偏右0.9 mm，硬膜下7.3 mm。分別向各靶點(diǎn)位置緩慢注入6OHDA 4 μg（用0.2%抗壞血酸生理鹽水配制成2 μL）。注藥速度為1 μL/min，留針5 min后緩慢退針。術(shù)后一周開始觀察大鼠行為學(xué)變化，并進(jìn)行APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，腹腔注藥10 min后人工計(jì)數(shù)30 min內(nèi)大鼠恒定向左旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，一周一次，連續(xù)3周，若恒定向左旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>210 r/30min，則視為成功制作PD大鼠模型。

1.2.3動(dòng)物分組及細(xì)胞移植將54只PD大鼠模型按照隨機(jī)數(shù)字表分成三組：移植組、假手術(shù)組、模型組，每組18只。再根據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)不同分為1 W、2 W、4 W三個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。將體外傳代培養(yǎng)3次處于對數(shù)生長期的hPDBMSCs進(jìn)行消化離心，用PBS緩沖液重懸將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×105個(gè)/μL備用。分別向移植組和假手術(shù)組大鼠右側(cè)紋狀體部位微量注入5 μL hPDBMSCs和5 μL PBS緩沖液。右側(cè)紋狀體坐標(biāo)為前囟前1.0 mm，正中線左側(cè)3.0 mm，硬膜下5.0 mm。模型組不作任何處理。

1.2.4行為學(xué)評估移植后1 W、2 W、4 W觀察各組大鼠的行為學(xué)變化，并對其行APO旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)用藥后30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，求取平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（rpm/min）。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色檢測TH的表達(dá)各個(gè)亞組的大鼠經(jīng)行為學(xué)評估后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，用4%多聚甲醛灌注固定，切取前囟后4.4 mm至7 mm層面腦組織，2天后行石蠟包埋。石蠟切片經(jīng)過脫蠟、脫水后，用檸檬酸緩沖液熱抗原修復(fù)15 min，室溫冷卻后用PBS緩沖液沖洗3 min。按照SP免疫組化試劑盒說明書行TH免疫組織化學(xué)染色。步驟如下：室溫下3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；正常羊血清工作液封閉，37℃ 10 min，勿洗；每張切片滴加50 μL小鼠抗大鼠TH一抗，陰性對照組滴加等體積PBS，置入4°冰箱中孵育過夜，PBS沖洗3 min×3次；每張切片滴加50 μL生物素化二抗（羊抗小鼠IgG），室溫下孵育15 min后用PBS沖洗3 min×3次；滴加50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)用蒸餾水終止反應(yīng)；切片復(fù)染、脫水透明后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。選取5張切片，在高倍鏡（×400）同一背景下選取5個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)損傷側(cè)與健側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出損傷側(cè)與健側(cè)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用ONEWAY方差分析及t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果2.1PDBMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征在倒置顯微鏡下見復(fù)蘇后細(xì)胞于4 h左右（圖A）出現(xiàn)貼壁生長，也有部分細(xì)胞仍然處于漂浮狀態(tài)，此時(shí)貼壁細(xì)胞的特點(diǎn)是呈巨單核細(xì)胞，形態(tài)不一，可有梭形、多角形或星芒狀突起為單個(gè)或多個(gè)。24 h后換液，可見所有貼壁細(xì)胞多以梭形或者多角形細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞生長至瓶壁的50%左右（圖B）。一般傳代48 h即可長至瓶壁80%水平，細(xì)胞表現(xiàn)出旋渦狀，細(xì)胞形態(tài)大小基本均勻一致。A：4 h后細(xì)胞形態(tài)；B：24 h后細(xì)胞形態(tài)。

2.2行為學(xué)評估結(jié)果實(shí)驗(yàn)中，75只SD大鼠成功造模54只，成功率為72%。主要表現(xiàn)為豎毛、躬身、少動(dòng)、行動(dòng)遲緩、尾僵、頭偏斜、嗅探等。移植術(shù)前各組平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。hPDBMSCs移植術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)APO誘導(dǎo)平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，移植組均低于假手術(shù)組及模型組。術(shù)后2 W及4 W，移植組APO誘導(dǎo)的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較假手術(shù)組及模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。假手術(shù)組和模型組的旋轉(zhuǎn)行為手術(shù)前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較（n=18，rpm/min，±s）

分組1移植前1移植后1 W12 W14 W移植組111.1±1.8110.3±1.718.8±1.6ab15.8±1.4ab假手術(shù)組110.8±1.5111.2±1.4110.9±1.7111.1±2.0模型組111.3±1.7111.2±1.5110.8±2.0110.9±1.6F10.4112.0518.02157.19P10.66710.13910.00091<0.001注：與移植前相比，aP<0.01；與假手術(shù)組相比，bP<0.01。

2.3TH免疫組化染色結(jié)果通過TH免疫組化實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)（見表2、圖2）：模型組與假手術(shù)組手術(shù)前后腦黑質(zhì)部位損傷側(cè)與健側(cè)陽性細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。移植組中，術(shù)后2 W及4 W損傷側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)與健側(cè)陽性數(shù)相比明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

表2各組大鼠黑質(zhì)不同觀察點(diǎn)TH表達(dá)（n=6，%，±s）

分組1移植前1移植后1 W12 W14 W移植組122.1±1.7128.6±1.8ab132.5±2.0ab143.2±1.9ab假手術(shù)組121.5±1.4121.6±1.3121.8±1.5120.9±1.4模型組121.7±1.6122.1±1.2121.7±1.6120.8±1.5F10.23143.09178.711383.27P10.8001<0.0011<0.0011<0.001注：與移植前相比，aP<0.01；與假手術(shù)組相比，bP<0.01。

A：假手術(shù)組1 W時(shí)TH表達(dá)；B：假手術(shù)組2 W時(shí)TH表達(dá)；C：假手術(shù)組4 W時(shí)TH表達(dá)；D：移植組1 W時(shí)TH表達(dá)；E：移植組2W時(shí)TH表達(dá)；F：移植組4 W時(shí)TH表達(dá)。

3討論據(jù)統(tǒng)計(jì)，帕金森病在60歲以上人群中，其發(fā)病率超過1%，是中老年人常見的致殘疾患之一[3]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，PD的主要病變部位在中腦黑質(zhì)部以及紋狀體區(qū)域，主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性凋亡，使黑質(zhì)紋狀體通路DA釋放減少，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂[4]。若能將合成和分泌多巴胺的細(xì)胞移植入黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，替代已死亡的多巴胺細(xì)胞，從理論上講是最為理想的治療措施。正因如此，干細(xì)胞移植治療帕金森病被廣泛研究。間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是一種理想的種子細(xì)胞，主要獲取來源為骨髓、脂肪、羊膜、臍帶等。骨髓是間充質(zhì)干細(xì)胞的最初來源，然而研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞含量低，且在衰老或疾病狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖分化能力將進(jìn)一步下降[5]。此外，目前雖然多數(shù)研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療能夠延緩PD模型大鼠中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元凋亡，從而改善其癥狀[6]。然而，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)同種異體骨髓MSC移植后移植灶周圍可見明顯的免疫反應(yīng)，并不能阻礙中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少和改善模型鼠的行為學(xué)癥狀[7]。但與BMMSCs相比，hPDBMSCs來源更為豐富，獲取方便，培養(yǎng)條件低，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞的一些標(biāo)記物，如SSEA4、TRA160以及TRA181[8]。經(jīng)傳代培養(yǎng)數(shù)十次后hPDBMSCs仍維持原有的細(xì)胞表型，并具有較強(qiáng)的增殖分化能力[1]，此外，有研究表明，胎盤來源的MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，且這種效應(yīng)與MSC的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，無同源性限制[9]。這些結(jié)果表明，hPDBMSCs可能是一種更為原始的MSCs，有可能是一種較為理想的移植細(xì)胞來源。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs作為一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，同樣能夠改善PD大鼠的癥狀，減少多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

移植途徑是干細(xì)胞移植治療中值得關(guān)注的問題，移植后的效果以及移植成功與否在一定程度上取決于移植途徑的正確選擇。對于帕金森病而言，細(xì)胞移植存在多種移植途徑，包括黑質(zhì)移植、紋狀體移植、腦室內(nèi)移植、靜脈移植等。至于何種移植方法更為有效，尚無明確定論。但有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，在BMMSCs中，紋狀體移植效果優(yōu)于腦室內(nèi)移植及靜脈移植[10]，PD模型大鼠行為學(xué)癥狀改善更為明顯。在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs靜脈移植后PD模型大鼠的行為學(xué)癥狀可以得到改善[11]。但通過對比分析，我們發(fā)現(xiàn)采用紋狀體移植后，大鼠行為學(xué)癥狀改善更為明顯。這些結(jié)果提示，紋狀體移植可能是一種更為有效的移植方式，這與既往一些學(xué)者的研究結(jié)果相符[10，12]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植2周后，大鼠黑質(zhì)部位TH陽性細(xì)胞數(shù)量增多。這些數(shù)據(jù)表明在PD大鼠模型中，hPDBMSCs能夠通過某些機(jī)制分化為多巴胺能神經(jīng)元替代受損的多巴胺能神經(jīng)元，或者抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述， hPDBMSCs作為一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，通過紋狀體移植能夠更為有效地延緩多巴胺能神經(jīng)元的凋亡或者替代受損多巴胺能神經(jīng)元，改善PD模型大鼠的癥狀。但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]Lu GH，Wang SY，Xu ZM，et al.Human placental decidua basalis-derived mesenchymal stem cells differentiate into dopamine neuron-like cells with no response to longterm culture in vitro[J].Neuroreport，2012，23（8）：513518.

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（收稿日期：2016-08-16修回日期：2016-10-23）

（編輯：潘明志）