王巖巖，邢建民，陳紅歌

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β-胡蘿卜素合成的代謝工程研究進展

王巖巖1，邢建民2，陳紅歌1

1 河南農業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州 450002 2 中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190

β-胡蘿卜素是自然界中最重要的商業(yè)化生產的植物色素之一，具有多種生理功能和生物活性。自上世紀60年代開始，隨著系統(tǒng)生物學概念的提出以及對類胡蘿卜素合成途徑研究的不斷深入，系統(tǒng)代謝工程在提高類胡蘿卜素產量方面發(fā)揮了重要作用。文中在介紹β-胡蘿卜素傳統(tǒng)生產方法的基礎上，重點介紹了如何運用系統(tǒng)代謝工程手段構建β-胡蘿卜素高產菌株，并分析了進一步提高工程菌β-胡蘿卜素產量所面臨的主要問題及可能的解決方案，為β-胡蘿卜素的高效生產提供了思路。

β-胡蘿卜素，前體物質，合成途徑，系統(tǒng)代謝工程

β-胡蘿卜素，分子式為C40H56，相對分子質量536.85，含有8個異戊二烯單位的類胡蘿卜素 (圖1)，主要有全反式、9-順式、13-順式及15-順式4種形式，是一種紫紅色至暗紅色有光澤的結晶粉末，稀溶液呈橘黃色。不溶于水，可溶于許多有機溶劑，如氯仿、二硫化碳、丙酮、癸烷和十二醇等，但在甲醇、乙醇中幾乎不溶解。由于分子內含有共軛雙鍵，β-胡蘿卜素在高溫、強酸、氧氣和光照條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化還原反應，但在堿性條件下較穩(wěn)定[1]。自然界所有光合生物中均含有β-胡蘿卜素，用于促進光吸收，防止光能破壞氧自由基并能吸引昆蟲傳粉以促進種子傳播[2]。

β-胡蘿卜素具有優(yōu)越的生理功能，不僅是合成人體維生素A的前體物質，具有較強的抗氧化活性，而且對于增強人體免疫力、預防慢性疾病、促進細胞縫隙間連接交流、減少動脈硬化、延緩衰老以及有效抑制癌細胞的增殖等都具有重要意義[3]，廣泛用于藥品、化妝品、保健品和食品添加劑等[4]。近年來，采用直接提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法等生產β-胡蘿卜素的工作都相繼展開，但都有其限制因素，人們一直探索新方法，力求實現β-胡蘿卜素的大規(guī)模生產。隨著系統(tǒng)生物學概念的提出，代謝工程的迅猛發(fā)展以及對類胡蘿卜素合成途徑研究的不斷深入，β-胡蘿卜素的產量有了大的突破，但仍存在一些問題。

本文在介紹β-胡蘿卜素傳統(tǒng)生產方法的基礎上，將重點對系統(tǒng)代謝工程手段構建β-胡蘿卜素高產菌株的研究進行深入探討，分析存在的主要問題并提出解決辦法。

1 天然β-胡蘿卜素生產方法的研究

1.1 采用植物生產

高等植物的光合色素為葉綠素A、葉綠素B和類胡蘿卜素，類胡蘿卜素作為輔助色素廣泛存在于葉綠體中，對葉綠素捕獲光能加以補充。自然界中，許多植物包括綠葉蔬菜、水果、塊根塊莖、花卉等均含有豐富的β-胡蘿卜素 (表1)。工業(yè)上，一般采取將胡蘿卜皮粉碎通過有機溶劑或超臨界流體萃取的方法生產β-胡蘿卜素，但面臨高消耗、低產出、環(huán)境污染等問題。

圖1 β-胡蘿卜素的結構式

表1 幾種常見食物中類胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的含量[5-6]

Table 1 Content of total carotene and β-carotene in some food[5-6]

NamesCarotenoids content (mg/100 g)β-carotene content (mg/100 g)β-carotene percentage in carotenoids (%) Sweet potato2.23±0.231.87±0.1484.10±5.07 Carrot8.85±2.006.50±1.4669.70±6.96 Pumpkin2.06±0.771.16±0.5755.10±8.19 Mango2.21±1.151.71±0.9576.90±7.55 Tomato3.09±0.100.06±0.0119.00±1.41 Green chillies2.44±0.461.13±0.8049.60±8.82 French beans1.26±0.030.39±0.0231.00±1.79

1.2 采用藻類生產

β-胡蘿卜素在藻類中廣泛存在[7]，如佛氏綠膠藻、杜氏藻、泥生顫藻等。目前，杜氏鹽藻因其能生成大量β-胡蘿卜素而成為工業(yè)上最重要的杜氏藻物種[8]，產量高達細胞干重的16%。Gómez等[9]發(fā)現，合成的天然β-胡蘿卜素是順式 (主要是9-順式)和全反式的混合物，這兩種異構體的比例受環(huán)境條件的影響，如溫度、輻射、鹽度等。終產品中，由于全反式-β-胡蘿卜素容易結晶，而9-順式結構不形成晶體，所以，兩種異構體的相對比例在提取和后處理過程中也會發(fā)生變化[8]。該法在澳大利亞和以色列首先達到工業(yè)規(guī)模，科寧 (屬巴斯夫公司) 成為世界上最重要的利用生產天然β-胡蘿卜素的公司，中國、美國、印度等國家也在逐漸嘗試。但該法生產β-胡蘿卜素需要高濃度的鹽水湖、強烈的光照、干旱的氣候，不適用于許多國家。

1.3 采用微生物發(fā)酵生產

自然界中，除植物、藻類外，微生物也能大量合成β-胡蘿卜素，如部分真菌和細菌。在真菌中，目前主要利用絲狀真菌如三孢布拉氏霉菌[10]和酵母如紅法夫酵母、白球擬酵母等生產β-胡蘿卜素。Roukas團隊[11-13]證明，通過氧脅迫、改良提取方法和優(yōu)化培養(yǎng)條件可以提高三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素的產量。細菌中，主要利用歐文氏菌、成團泛菌等生產β-胡蘿卜素，其本身含有存在于染色體上的β-胡蘿卜素合成基因——牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因 ()、八氫番茄紅素合成酶基因 ()、八氫番茄紅素脫氫酶基因 ()、番茄紅素環(huán)化酶基因 ()。利用這些野生菌株生產β-胡蘿卜素周期短、代謝快、相對安全，比植物、藻類效率更高，但野生菌株生活性能差，終產量低，難以實現工業(yè)化。

2 系統(tǒng)代謝工程策略生產β-胡蘿卜素

隨著高通量技術迅猛發(fā)展，逐漸闡釋了基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和通量組學，再結合新穎的計算技術，萌生了系統(tǒng)生物學的概念。因此，系統(tǒng)代謝工程 (Systems metabolic engineering) 被定義為系統(tǒng)層面的代謝工程——整合了系統(tǒng)生物學的組學和計算技術、合成生物學的精細化設計能力以及進化工程的隨機突變方法[14-15]，即通過大數據和模型的使用，組合不同來源的多種酶分子來構建新的代謝路徑，以達到改善細胞表型的目的。

系統(tǒng)代謝工程的實施流程[16]通常有以下環(huán)節(jié)：首先理性設計宿主菌生產目標產物的代謝路徑；然后加以實驗，評估細胞的生長和代謝水平；通過測定中間代謝產物的積累量和每個反應的活性，找出代謝路徑的限速步驟并利用計算技術來預測流量分布情況。上述檢測和評估獲得的信息用于構建新一輪生產目標產物的優(yōu)化途徑。系統(tǒng)代謝工程對于開發(fā)出目標產物產量及效率最大化、過程消耗最小化的微生物菌株具有重要的意義。

近年來，以模式生物如大腸桿菌、釀酒酵母等為出發(fā)菌株，綜合運用系統(tǒng)代謝工程策略來生產 β-胡蘿卜素的方法已成為大量合成多種類胡蘿卜素產品的新模式，利用工程菌提高β-胡蘿 卜素的產量有了很大進展。如Yang等[17]通過在中共表達外源基因同時引入MVA途徑，使得β-胡蘿卜素產量達到3.2 g/L，是目前報道的最高產量；Zhao等[18]調整代謝過程中各模塊相關基因的表達以增強前體物和能量供應，產量為2.1 g/L；Nam等[19]在合成培養(yǎng)基中補充氨基酸從而取代復合培養(yǎng)基，得到2.47 g/L的β-胡蘿卜素；Li等[20]利用CRISPR/Cas9的方法對中的各基因進行改造并組合調控，β-胡蘿卜素的產量達到2.0 g/L。由此可見，利用工程菌生產β-胡蘿卜素具有其獨特的優(yōu)勢。

以下將詳細介紹利用系統(tǒng)代謝工程構建β-胡蘿卜素工程菌時β-胡蘿卜素生物合成路徑的設計、路徑的優(yōu)化以及宿主菌的基因工程改造等措施。

2.1 β-胡蘿卜素生物合成路徑的設計與優(yōu)化

目前用于生產β-胡蘿卜素的微生物主要是、等，在這些微生物中構建β-胡蘿卜素合成途徑通常包括3個功能相對獨立的模塊：糖酵解模塊、前體物質合成模塊和β-胡蘿卜素合成模塊，如圖2所示。類胡蘿卜素通過一系列的異戊二烯化合物合成，其前體物是異戊二烯焦磷酸 (IPP)，共有2條合成途徑即甲羥戊酸(MVA) 途徑和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑。及其他原核生物通過MEP 途徑縮合丙酮酸 (Pyruvate) 和甘油醛-3-磷酸 (G3P) 為IPP[21]；真核細胞、細胞質以及植物線粒體利用MVA途徑轉換乙酰輔酶A生成IPP。

圖2 β-胡蘿卜素生物合成路徑

IPP (C5) 及其同分異構體二甲基丙烯焦磷酸 (DMAPP) (C5)，在FPP 合成酶IspA的催化下經兩步連續(xù)反應合成FPP (C15)，再通過編碼的GGPP合成酶產生GGPP (C20)，接下來由八氫番茄紅素合成酶 (CrtB) 催化兩分子的GGPP 形成無色的八氫番茄紅素 (C40)，在八氫番茄紅素脫氫酶 (CrtI) 作用下，生成紅色的番茄紅素 (C40)，再由番茄紅素環(huán)化酶 (CrtY) 催化生成黃色的β-胡蘿卜素 (C40)。

2.1.1 利用MEP途徑合成IPP

及其他原核生物通過MEP途徑為 β-胡蘿卜素的合成提供前體物質IPP。葡萄糖或甘油通過糖酵解產生丙酮酸和G3P，二者經1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (Dxs) 形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸 (DXP)，再由一系列類異戊二烯酶——DXP 還原異構酶 (Dxr)、4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶 (IspD)、4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶 (IspE)、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶 (IspF)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸合成酶 (IspG) 和4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶 (IspH)，將DXP 轉化為C5異戊二烯亞單 位——IPP和DMAPP，這兩種物質通過異戊烯焦磷酸異構酶 (Idi) 相互轉化[22]。

前體物丙酮酸和G3P 等量利用，缺少任何一種物質都會減少體內萜類的合成[23]。如，敲除丙酮酸激酶 (PykFA) 能夠平衡二者的利用率，調控異戊二烯途徑的代謝流來增強類胡蘿卜素的產量[24]；敲除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因() 來阻斷G6P到磷酸戊糖途徑 (PPP) 的轉化，通過RT-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction) 得到的轉錄組分析結果顯示，敲除菌株中MEP代謝路徑的限速基因和顯著上調[25]。磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 也是重要前體物之一，當碳水化合物加入時，PEP 通過磷酸轉移酶系統(tǒng) (PTS) 被消耗，所以敲除PTS相關基因能夠增加PEP和G3P的濃度[26]。Das等[23-27]發(fā)現，從G3P 到丙酮酸過程中通過相關酶的過表達或鈍化 (如過表達磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 (Pps)) 來控制G3P和丙酮酸的代謝流平衡后，均能顯著增加β-胡蘿卜素的產量。由于丙酮酸是生物體的主要代謝產物，參與許多生理反應，若要使代謝流盡可能多地走向β-胡蘿卜素合成方向，必須減少副產物如乳酸、乙酸的生成。

通過調節(jié)MEP 途徑提高β-胡蘿卜素產量的幾個方法：1) 過表達類異戊二烯關鍵基因[28-29]，如和。Dxs和Idi被認為是類異戊二烯合成途徑的限速步驟，一般通過基因修飾來增加這兩個酶的活性[30]。Yuan研究小組[22,31]使用強啟動子T5 對MEP途徑中、、和等基因調控后，可以增強目的途徑代謝流，導致β-胡蘿卜素產量增加4.5倍。Alper等[32]構建啟動子文庫來調控MEP代謝路徑上酶的表達水平，結合流式細胞儀 (Becton Dickinson FACScan) 篩選出最優(yōu)表現型，通過轉錄組分析進行驗證。Zhao等[33]使用多個不同強度的調控元件對中MEP途徑的8個基因組合調控，β-胡蘿卜素產量提高的幅度比僅使用強啟動子效果要好得多；2) 抑制競爭路徑異戊二烯焦磷酸的利用，減弱或敲除旁路代謝過程。

2.1.2 利用MVA途徑合成IPP

真核生物、植物的線粒體等利用MVA途徑提供前體物[34]。MVA途徑可分為上游和下游兩部分[35]，上游途徑通過乙酰輔酶A硫解酶 (AtoB)、HMG-CoA合成酶 (MvaS)、HMG-CoA 還原酶 (MvaA) 三種酶將三分子的乙酰輔酶A (Acetyl-CoA) 轉化為甲羥戊酸(MVA)；下游途徑通過甲羥戊酸激酶 (MvaK1)、磷酸甲羥戊酸激酶 (MvaK2) 和二磷酸甲羥戊酸脫羧酶 (MvaD) 3種酶將MVA轉換為IPP。

整個MVA途徑開始于細胞中豐富的乙酰輔酶A，可能比MEP途徑供應IPP 的效率更高，而且在中引入外源MVA途徑可以避免細菌自身的反饋抑制[36-37]，生產大量的異戊二烯化合物。代謝工程上一個巨大的進步是將來自肺炎雙球菌和腸球菌的雜合MVA途徑引入DH5α，結果重組的宿主細胞產生465 mg/L β-胡蘿卜素[35]。Pitera團隊[38]指出MVA 上游路徑中的過表達抑制細胞生長，通過液質聯(lián)用技術得到的代謝組數據表明，隨著HMG-CoA的積累，呈現明顯的生長抑制性狀，推測對產生毒性反應，由此可知，MvaA是MVA途徑的限速酶，可以通過增強同時減弱的表達促使細胞正常生長。本身具有MVA路徑，Verwaal等[39]通過引入GGPP合成酶基因，產生更多的碳流，合成5.9 mg/g β-胡蘿卜素；Yan等[40]通過過表達并添加麥角固醇抑制劑使β-胡蘿卜素細胞干重 (DW) 達到6.3 mg/g；Xie等[41]通過對類胡蘿卜素基因插入可控雙功能啟動子，β-胡蘿卜素增加到7.4 mg/g；最近，利用順序控制FPP的上游、下游以及競爭路徑，即通過葡萄糖的濃度來控制類胡蘿卜素合成途徑、MVA途徑和鯊烯合成途徑中基因的表達水平，在120 h發(fā)酵后，中β-胡蘿卜素產量達到 20.8 mg/g (即1.156 g/L)[42-43]。

2.1.3 β-胡蘿卜素合成模塊及其優(yōu)化

野生菌——歐文氏菌、成團泛菌和三孢布拉氏霉菌中均含有β-胡蘿卜素的結構基因——基因簇，利用基因工程將其整合到模式生物染色體上，以實現由前體物質到β-胡蘿卜素的轉化。FPP是類胡蘿卜素生物合成和其他類異戊二烯分子合成的共同前體物和分支點，其在編碼的八聚異戊二烯焦磷酸合成酶催化下形成泛醌[22]，理論上，的表達會將代謝流量引向泛醌的合成方向，但令人吃驚的是，過表達反而導致β-胡蘿卜素產量的增加。由于編碼GGPP合成酶的基因具有序列多樣性[44]，所以在β-胡蘿卜素合成結構基因的起始處應當選擇一個較為有效的基因。Yoon等[45]表明，成團泛菌比菠蘿泛菌中的基因效率高，在這個模塊中高效控制代謝流走向終產物，β-胡蘿卜素的產量很大程度上取決于CrtE的活性。

蛋白翻譯速率及表達量和RBS的序列密切相關，并且RBS 文庫可以較大范圍地調控基因表達[46]，故能夠通過構建的RBS文庫，篩選出使β-胡蘿卜素產量較高的菌株，如系統(tǒng)生物學中嶄新的計算方法RedLibs (Reduced libraries)，即在優(yōu)化代謝路徑過程中，理性設計一種巧妙的組合文庫，可以大量減少實驗操作[47]。

目的產物的高產經常被自身酶限制，如較低的轉化率和副產物的積累，而蛋白質工程能提供提高酶的特殊性質和底物特異性的方法，包括定向進化和理性設計[48-49]。定向進化是在實驗室條件下篩選突變基因的理想表現型，易錯PCR可以產生突變文庫，DNA改組被用來重新組合存在的突變體。蛋白的理性設計建立在生物信息學的模擬和預測之上，極大地減輕了科研工作者的篩選任務[50]，遺憾的是，疏水性β-胡蘿卜素合成酶類均定位在細胞膜上，理化性質和晶體結構理解不夠透徹[51]，用這種方法有較小的進展。這些理性設計盡管能夠適度地增加β-胡蘿卜素其他模塊中代謝流強度，但是忽略了非特異性的影響，比如中間代謝產物的毒性，隱藏的代謝途徑對主要路徑產生競爭，用于表達的載體對細胞產生不利影響，抑制目標產物的產量等，而組合調控能夠提供更多的機會來選擇樣本空間并繞過這些復雜的非線性相互作用，克服以上這些問題[52]，但組合調控需要高通量，經常對許多天然產物不適用。

2.1.4 能量供應的調節(jié)

β-胡蘿卜素生物合成能量供給過程分為ATP途徑、TCA循環(huán)途徑和PPP途徑。ATP和NADPH是萜類化合物合成的2個重要輔因子。生物體中，ATP通過ATP合成酶和電子轉移鏈生成，電子首先從糖酵解和TCA循環(huán)過程產生的NADH傳遞到泛醌氧化還原酶，形成電化學梯度[53]，最終傳遞給細胞色素氧化酶。合成NADPH主要有3種方式——TCA循環(huán)、PPP途徑和NADH到NADPH的轉換。TCA循環(huán)能夠產生ATP和NADH，PPP途徑能夠產生NADPH，TCA 循環(huán)比其他2種途徑對β-胡蘿卜素產量的提高發(fā)揮更大作用[18]。在3種途徑中電子傳遞需要各種氧化還原酶的參與，為了增加ATP 和NADPH的供應，需要利用調控元件來調節(jié)基因操縱子[18,54]。

Ajikumar等[21,55]通過多元模塊化途徑工程(Multivariate-modular pathway-engineering) 方法證明，MVA途徑每生產1 mol IPP，消耗1.5 mol 葡萄糖或3 mol甘油，產生4 mol NADH (葡萄糖) 或7 mol NADH (甘油)，導致細胞體內輔因子含量極度不平衡，而MEP途徑生產1 mol IPP 消耗1.196 mol葡萄糖或2 mol甘油，且不產生額外的NADH，達到氧化還原平衡。由此可見，在轉化葡萄糖或甘油到IPP時，MEP途徑更有效。

另一方面，TCA 循環(huán)產生1 mol ATP、2 mol NADH、3 mol FADH2相當于9 mol ATP，但僅生成1 mol NADPH。經驗證，TCA和PPP模塊的組合調控產生協(xié)同效應而組合調控TCA循環(huán)與ATP途徑不產生協(xié)同作用，這表明在提高類胡蘿卜素產量方面增加NADPH的供應比ATP更為重要[18]。

2.2 宿主菌的基因工程改造策略

生物反應過程中，要想達到最有效地提高β-胡蘿卜素產量的目的，宿主的生物系統(tǒng)也需要被優(yōu)化，如將細胞內碳流導向β-胡蘿卜素生物合成途徑。

RNAi (RNA interference) 的出現，使生物合成途徑上某些基因如β-胡蘿卜素酮化酶、羥化酶基因沉默，阻斷β-胡蘿卜素的進一步代謝，使之在細胞內積累[56-57]。由于β-胡蘿卜素具有抗氧化性，適應性進化已經成功地應用到中，通過周期性地加入過氧化氫使β-胡蘿卜素的產量有了3倍的提高，達到18 mg/g[56,58]。多元自動化基因組工程(Multiplex automated genome engineering，MAGE) 可以靶向單細胞染色體的許多位點，或者在DNA復制過程中通過將ssDNA導向復制叉的后隨鏈來穿過細胞群，這種修飾涵蓋了基因沉默、表達調控等[52]。隨后，可循跡的多元重組(Trackable multiplex recombineering，TRMR) 結合DNA合成、重組工程和分子條碼技術快速修飾大腸桿菌的所有基因[59]。

為改善菌株的生產能力，能夠提前鑒定出需要刪除或擴增的基因是十分必要的。一種基于電腦的基于強化目標流量的通量掃描(Flux scanning based on enforced objective flux，FSEOF) 技術[60]，在代謝模塊中瀏覽所有的代謝流，以目標化合物流量的增加作為約束條件，當流量增加時篩選出該基因，這種計算方法成功地運用到提高β-胡蘿卜素產量上來，FSEOF作為一個全局的策略在全基因組復制過程中篩選目標基因。隨著科技的發(fā)展，鑒定需操作基因的計算方法逐漸增多，多目標進化算法(Multiobjective memetic algorithm，MOMA)[61]，通過代謝調節(jié)量的極小化來確定需敲除的基因；OptForce[62]，通過比較代謝流的改變來確定目的基因；然而，雙層次的優(yōu)化方法——OptKnock[63]，利用細胞生長速率和產物的產生速率相結合來確定敲除基因，最近又出現了OptFlux軟件[64]。未來，這些應用到挖掘目標基因的計算方法，將會在精確快速提高β-胡蘿卜素產量的研究中發(fā)揮重要作用。

目標產物的代謝工程常常依賴于質粒，但質粒系統(tǒng)易丟失且會額外引入抗體，因此染色體整合成為必要，λ-Red同源重組技術使無質粒系統(tǒng)的能夠生產β-胡蘿卜素。近來，出現一個新穎的策略——化學誘導染色體進化技術(Chemically inducible chromosomal evolution，CIChE)，即在將靶基因整合到染色體的過程中，減少每次只能整合一個基因的重復步驟。CIChE允許宿主通過增加目的化合物的濃度來獲得一個高基因拷貝數 (到40個拷貝) 的表達，并且刪除基因能保證所增加拷貝數的穩(wěn)定性[65-66]。

2.3 系統(tǒng)代謝工程提高β-胡蘿卜素產量的全局性調控

β-胡蘿卜素的合成涉及多種酶，多基因回路上所有化合物的表達應該被組合起來去優(yōu)化整個代謝流。BioBrick?范式能夠快速地組合出一個雜合的類胡蘿卜素合成途徑，且途徑上的每個酶擁有正確的轉換率，然而，BioBrick?組裝不是用高通量的方式構建大量的組合表達，這對于篩選類胡蘿卜素基因的最好組合沒有優(yōu)勢[58,67]。最近，幾種使用同源重組的組裝方法，例如序列和連接獨立的克隆(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)、Gibson DNA assembly和反復重組 (Reiterative recombination) 等已經應用到構建多基因回路上[65,68-69]，這些方法隨機組合途徑上的化合物，包括基因、啟動子、RBS 區(qū)等，構建出大量的基因組合用來高通量篩選。多元模塊工程(Multivariate modular metabolic engineering，MMME) 是將一個長而復雜的途徑模塊化為不同子集，每個子集包含轉換率相同的酶，調控各個子集比調控整個代謝路徑上的所有化合物更加方便高效[21]。中間代謝產物過多積累會對細胞產生毒性，有些是競爭路徑的底物，加速競爭路徑的相關反應，因此，中間代謝產物的擴散能夠緩解細胞壓力，例如，生物學家通過引入蛋白骨架在空間上調控MVA 途徑上的酶類來縮小對擴散作用的限制，使甲羥戊酸產量增加 77倍[70]。

發(fā)酵條件的優(yōu)化對于全局性調控發(fā)揮著不可比擬的作用，盡管利用系統(tǒng)代謝工程手段構建宿主菌來提高β-胡蘿卜素產量已有很大進步，但對發(fā)酵條件優(yōu)化研究還很少。在對生長培養(yǎng)基 (如復合培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基等) 進行優(yōu)化時，要想檢測不同環(huán)境下所有成分的組合是不現實的，Zhang等[26]使用響應曲面法(Response surface methodology，RSM) 篩選關鍵化合物的最優(yōu)濃度，使類胡蘿卜素產量相對于野生菌株有了幾倍的提高。研究發(fā)現，對于β-胡蘿卜素產量的提高，甘油作為碳源優(yōu)于葡萄糖、半乳糖、木糖等，并且1%的甘油和1%的葡萄糖對于增加類胡蘿卜素的產量優(yōu)于2%的甘油[35]。

3 系統(tǒng)代謝工程改造β-胡蘿卜素工程菌存在的主要問題及解決思路

正如前文提到的，許多代謝工程方法可以提高β-胡蘿卜素產量，但實驗操作中會遇到諸多問題，如：過量表達產類異戊二烯的基因，會影響細菌體內其他代謝路徑，致使菌體不能正常生長；β-胡蘿卜素合成過程有許多副產物如乳酸、醋酸；β-胡蘿卜素是胞內產物，產生后如何在菌體內大量儲存等。

針對上述各種問題，我們可以從以下方面著力改進：一是針對Dxs是類異戊二烯合成途徑限速酶的事實，對大腸桿菌自身進行RBS 優(yōu)化，以使MEP途徑上游代謝路徑限速酶過量表達，β-胡蘿卜素產量提高13倍 (工作尚未發(fā)表)。二是考慮到過表達關鍵基因可能會導致中間代謝產物大量積累產生細胞毒性，因此，可根據cat、m以及cat/m值，在異源菌株中找出特異性強且比活高的同工酶，將基因引入染色體基因組。三是針對細胞生長過程中伴隨碳源消耗產生大量的乙酸，阻礙細胞生長的問題，可以考慮給乙酰輔酶A合成酶基因 () 更換強啟動子，以使大量乙酸轉化為乙酰輔酶A，減少乙酸的同時加快TCA循環(huán)，為生物體代謝提供能量。四是對于胞內產物β-胡蘿卜素存儲問題，我們可以嘗試選擇一個更為合適的宿主，有文獻報道，解脂耶氏酵母是一種產油酵母，包含一個較大的脂質體，可以給脂溶性β-胡蘿卜素化合物提供較為充足的存儲空間[56,71]。

另一方面，對工程菌β-胡蘿卜素合成路徑的優(yōu)化還需要有更為可行的分析和評估方法，如完整的蛋白質組、代謝組等，以指導對工程菌的改造。在系統(tǒng)生物學迅猛發(fā)展的今天，生物信息學計算技術層出不窮，但目前還有很多尚未應用于β-胡蘿卜素工程菌的構建，如代謝的概率性調節(jié)(Probabilistic regulation of metabolism，PROM)，能夠直接地、自動地、定量地整合高通量數據到一個有限制條件的模型[72]，通過PROM，將來我們能為β-胡蘿卜素宿主菌構建一個完整的轉錄組調控和相應的代謝網絡模型，這種自動化推理方法更精確，更全面；迭代線性優(yōu)化法強化代謝(Enhancing metabolism with iterative linear optimization，EMILiO)，計算各個優(yōu)化的代謝流反應[73]，在優(yōu)化代謝流時，可以定量預測產生最高β-胡蘿卜素產量時的最優(yōu)流量范圍等。如此多的算法能夠更精確地預測細胞的生理功能，快速地確定需要操作的基因，大大減少工作量，在提高β-胡蘿卜素產量方面為我們提供了新思路。

4 展望

隨著經濟的發(fā)展、人們的健康意識增強和對功能性食品的需求不斷增加，β-胡蘿卜素以其抗氧化、抗癌變等特性受到消費者的青睞，其產量遠遠無法滿足市場需求，建立高效的生產方法對于促進β-胡蘿卜素的應用具有十分重要的意義。

利用系統(tǒng)代謝工程手段構建β-胡蘿卜素高產菌株，在其合成路徑各模塊進行組合優(yōu)化時，遇到一些瓶頸問題，如，碳通量經常變得不平衡，這是影響整個代謝體系反應效率的根本，對于代謝工程或者一個細胞生長體系，整體平衡調控顯得尤為重要，因此，利用基因工程菌生產β-胡蘿卜素的研究重點應該圍繞如何有效平衡細胞工廠的碳流以及能量供應問題來開展；此外，由于β-胡蘿卜素合成基因均定位在細胞膜上，其理化性質及晶體結構研究較少，這樣會阻礙對相關基因的全局調控。未來推廣過程中，成本仍是制約工廠能否大規(guī)模生產的關鍵因素，應當充分考慮縮減原料成本，用工農業(yè)廢渣廢氣等代替葡萄糖或甘油，以耗費低、時間短、產量高的標準來生產β-胡蘿卜素；隨著生活水平不斷提高，環(huán)境保護已成為工業(yè)生產所追求的目標，工業(yè)上要求盡可能地減少對環(huán)境如水體、土壤等的污染，以提高生活質量，所以研究者應當以環(huán)境友好型菌株 (如枯草芽胞桿菌) 作為宿主菌進行基因操作，達到環(huán)境無公害，同時發(fā)酵廢液應該做合適的處理以求能夠循環(huán)利用。

未來系統(tǒng)代謝工程不僅依賴于新路徑的構建，更重要的是選擇合適的調控手段來改善這些路徑，如RBS區(qū)的改造、密碼子優(yōu)化、Red兩步重組、CRISPR/Cas9等，結合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等一系列數據及計算技術必能達到平衡調控，使β-胡蘿卜素的生產更加經濟、快速、實用，在食品、醫(yī)藥、保健等各方面發(fā)揮更佳的性能。

REFERENCES

[1] Jomova K, Valko M. Health protective effects of carotenoids and their interactions with other biological antioxidants. Eur J Med Chem, 2013, 70: 102–110.

[2] Failla ML, Huo T, Thakkar SK.screening of relative bioaccessibility of carotenoids from foods. Asia Pac J Clin Nutr, 2008, 17(S1): 200–203.

[3] Qian C, Decker EA, Xiao H, et al. Physical and chemical stability of β-carotene-enriched nanoemulsions: influence of pH, ionic strength, temperature, and emulsifier type. Food Chem, 2012, 132(3): 1221–1229.

[4] Lintig JV. Colors with functions: elucidating the biochemical and molecular basis of carotenoid metabolism. Annu Rev Nutr, 2010, 30: 35–56.

[5] Bhaskarachary K, Rao DSS, Deosthale YG, et al. Carotene content of some common and less familiar foods of plant origin. Food Chem, 1995, 54(2): 189–193.

[6] Kandlakunta B, Rajendran A, Thingnganing L. Carotene content of some common (cereals, pulses, vegetables, spices and condiments) and unconventional sources of plant origin. Food Chem, 2008, 106: 85-89.

[7] Takaichi S. Distributions, biosyntheses and functions of carotenoids in algae. Agro Food Ind Hi Tech, 2013, 24(1): 55–58.

[8] Borowitzka MA.: biology, production, and markets//Richmond A, Hu Q, Ed. Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology, 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, Ltd., 2013: 359–368.

[9] Gómez PI, Barriga A, Cifuentes AS, et al. Effect of salinity on the quantity and quality of carotenoids accumulated by(strain CONC-007) and(strain ATCC 30861) Chlorophyta. Biol Res, 2003, 36(2): 185–192.

[10] Mata-Gómez LC, Monta?ez JC, Méndez-Zavala A, et al. Biotechnological production of carotenoids by yeasts: an overview. Microb Cell Fact, 2014, 13: 12.

[11] Roukas T. The role of oxidative stress on carotene production byin submerged fermentation. Crit Rev Biotechnol, 2016, 36(3): 424–433.

[12] Hu XM, Ma XJ, Tang P, et al. Improved β-carotene production by oxidative stress ininduced by liquid paraffin. Biotechnol Lett, 2013, 35(4): 559–563.

[13] Wang HB, Luo J, Huang XY, et al. Oxidative stress response ofinduced by H2O2during β-carotene biosynthesis. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(3): 555–561.

[14] Lee JW, Na D, Park JM, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals. Nat Chem Biol, 2012, 8(6): 536–546.

[15] Cho C, Choi SY, Luo ZW, et al. Recent advances in microbial production of fuels and chemicals using tools and strategies of systems metabolic engineering. Biotechnol Adv, 2015, 33(7): 1455–1466.

[16] Toya Y, Shimizu H. Flux analysis and metabolomics for systematic metabolic engineering of microorganisms. Biotechnol Adv, 2013, 31(6): 818–826.

[17] Yang JM, Guo LZ. Biosynthesis of β-carotene in engineeredusing the MEP and MVA pathways. Microb Cell Fact, 2014, 13: 160.

[18] Zhao J, Li QY, Tao S, et al. Engineering central metabolic modules offor improving β-carotene production. Metab Eng, 2013, 17: 42–50.

[19] Nam HK, Choi JG, Lee JH, et al. Increase in the production of-carotene in recombinantcultured in a chemically defined medium supplemented with amino acids. Biotechnol Lett, 2013, 35(2): 265–271.

[20] Li YF, Lin ZQ, Huang C, et al. Metabolic engineering ofusing CRISPR-Cas9 meditated genome editing. Metab Eng, 2015, 31: 13–21.

[21] Yadav VG, De Mey M, Lim CG, et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: towards a systematic practice. Metab Eng, 2012, 14(3): 233–241.

[22] Yuan LZ, Rouvière PE, LaRossa RA, et al. Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in. Metab Eng, 2006, 8(1): 79–90.

[23] Das A, Yoon SH, Lee SH, et al. An update on microbial carotenoid production: application of recent metabolic engineering tools. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77: 505.

[24] Farmer WR, Liao JC. Improving lycopene production inby engineering metabolic control. Nat Biotechnol, 2000, 18(5): 533–537.

[25] Zhou Y, Nambou K, Wei LJ, et al. Lycopene production in recombinant strains ofis improved by knockout of the central carbon metabolism gene coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase. Biotechnol Lett, 2013, 35(12): 2137–2145.

[26] Zhang CQ, Chen XX, Zou RY, et al. Combining genotype improvement and statistical media optimization for isoprenoid production in. PLoS ONE, 2013, 8(10): e75164.

[27] Farmer WR, Liao JC. Precursor balancing for metabolic engineering of lycopene production in. Biotechnol Prog, 2001, 17(1): 57–61.

[28] Vickers CE, Sabri S. Isoprene//Schrader J, Bohlmann J, Eds. Affiliations Biotechnology of Isoprenoids. Switzerland: Springer, 2015: 289–317.

[29] Sun T, Miao LT, Li QY, et al. Production of lycopene by metabolically-engineered. Biotechnol Lett, 2014, 36(7): 1515–1522.

[30] Albermann C. High versus low level expression of the lycopene biosynthesis genes fromin. Biotechnol Lett, 2011, 33(2): 313–319.

[31] Suh W. High isoprenoid fluxas a host for carotenoids production//Cheng Q, Ed. Microbial Metabolic Engineering. New York: Springer, 2012, 834: 49–62.

[32] Alper H, Fischer C, Nevoigt E, et al. Tuning genetic control through promoter engineering. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(36): 12678–12683.

[33] Zhao J, Liu Y, Li QY, et al. Modulation of isoprenoid gene expression with multiple regulatory parts for improved β-carotene production. Chin J Biotech, 2013, 29(1): 41–55 (in Chinese). 趙婧, 劉怡, 李清艷, 等. 多個調控元件調控萜類合成途徑基因表達提高β-胡蘿卜素的生產. 生物工程學報, 2013, 29(1): 41–55.

[34] Xie WP, Lü XM, Ye LD, et al. Construction of lycopene-overproducingby combining directed evolution and metabolic engineering. Metab Eng, 2015, 30: 69–78.

[35] Yoon SH, Lee SH, Das A, et al. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene in. J Biotechnol, 2009, 140(3/4): 218–226.

[36] Martin VJJ, Pitera DJ, Withers ST, et al. Engineering a mevalonate pathway infor production of terpenoids. Nat Biotechnol, 2003, 21(7): 796–802.

[37] Vadali RV, Fu YC, Bennett GN, et al. Enhanced lycopene productivity by manipulation of carbon flow to isopentenyl diphosphate in. Biotechnol Prog, 2005, 21(5): 1558–1561.

[38] Pitera DJ, Paddon CJ, Newman JD, et al.Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production in. Metab Eng, 2007, 9(2): 193–207.

[39] Verwaal R, Wang J, Meijnen JP, et al. High-level production of beta-carotene inby successive transformation with carotenogenic genes from. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(13): 4342–4350.

[40] Yan GL, Wen KR, Duan CQ. Enhancement of β-carotene production by over-expression of HMG-CoA reductase coupled with addition of ergosterol biosynthesis inhibitors in recombinant. Curr Microbiol, 2012, 64(2): 159–163.

[41] Xie WP, Liu M, Lv XM, et al. Construction of a controllable β-carotene biosynthetic pathway by decentralized assembly strategy in. Biotechnol Bioeng, 2014, 111(1): 125–133.

[42] Xie WP, Ye LD, Lv XM, et al. Sequential control of biosynthetic pathways for balanced utilization of metabolic intermediates in. Metab Eng, 2015, 28: 8–18.

[43] Liao P, Hemmerlin A, Bach TJ, et al. The potential of the mevalonate pathway for enhanced isoprenoid production. Biotechnol Adv, 2016, 34(5): 697–713.

[44] Kato S, Takaichi S, Ishikawa T, et al. Identification and functional analysis of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene () and phytoene synthase gene () for carotenoid biosynthesis in. BMC Plant Biol, 2016, 16: 4.

[45] Yoon SH, Kim JE, Lee SH, et al. Engineering the lycopene synthetic pathway inby comparison of the carotenoid genes ofand. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(1): 131–139.

[46] Dai GP, Sun T, Miao LT, et al. Modulating expression of key genes within β-carotene synthetic pathway in recombinantwith RBS library to improve β-carotene production. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1193–1203 (in Chinese). 戴冠蘋, 孫濤, 苗良田, 等. RBS文庫調控重組大腸桿菌β-胡蘿卜素合成途徑關鍵基因提高β-胡蘿卜素合成能力. 生物工程學報, 2014, 30(8): 1193–1203.

[47] Jeschek M, Gerngross D, Panke S. Rationally reduced libraries for combinatorial pathway optimization minimizing experimental effort. Nat Commun, 2016, 7: 11163.

[48] Zanghellini A.computational enzyme design. Curr Opin Biotechnol, 2014, 29: 132–138.

[49] Damborsky J, Brezovsky J. Computational tools for designing and engineering enzymes. Curr Opin Chem Biol, 2014, 19: 8–16.

[50] Keasling JD. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metab Eng, 2012, 14(3): 189–195.

[51] Schaub P, Yu QJ, Gemmecker S, et al. On the structure and function of the phytoene desaturase CRTI from, a membrane-peripheraland FAD-dependent oxidase/isomerase. PLoS ONE, 2012, 7(6): e39550.

[52] Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature, 2009, 460(7257): 894–898.

[53] Keseler IM, Collado-Vides J, Santos-Zavaleta A, et al. EcoCyc: a comprehensive database ofbiology. Nucleic Acids Res, 2011, 39(S1): D583–D590.

[54] Ma T, Deng ZX, Liu TG. Microbial production strategies and applications of lycopene and other terpenoids. World J Microbiol Biotechnol, 2016, 32(1): 15.

[55] Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KEJ, et al. Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in. Science, 2010, 330(6000): 70–74.

[56] Sandmann G. Carotenoids of biotechnological importance//Schrader J, Bohlmann J, Eds. Biotechnology of Isoprenoids. Berlin Heidelberg: Springer, 2015, 148:449-467.

[57] Varela JC, Pereira H, Vila M, et al. Production of carotenoids by microalgae: achievements and challenges. Photosynth Res, 2015, 125(3): 423–436.

[58] Wang CL, Kim JH, Kim SW. Synthetic biology and metabolic engineering for marine carotenoids: new opportunities and future prospects. Mar Drugs, 2014, 12(9): 4810–4832.

[59] Warner JR, Reeder PJ, Karimpour-Fard A, et al. Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2010, 28(8): 856–862.

[60] Choi HS, Lee SY, Kim TY, et al.identification of gene amplification targets for improvement of lycopene production. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(10): 3097–3105.

[61] Segrè D, Vitkup D, Church GM. Analysis of optimality in natural and perturbed metabolic networks. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(23): 15112–15117.

[62] Ranganathan S, Suthers PF, Maranas CD. OptForce: an optimization procedure for identifying all genetic manipulations leading to targeted overproductions. PLoS Comuput Biol, 2010, 6(4): e1000744.

[63] Burgard AP, Pharkya P, Maranas CD. OptKnock: a bilevel programming framework for identifying gene knockout strategies for microbial strain optimization. Biotechnol Bioeng, 2003, 84(6): 647–657.

[64] Gaspar P, Carvalho AL, Vinga S, et al. From physiology to systems metabolic engineering for the production of biochemicals by lactic acid bacteria. Biotechnol Adv, 2013, 31(6): 764–788.

[65] Li MZ, Elledge SJ. Harnessing homologous recombinationto generate recombinant DNASLIC. Nat Methods, 2007, 4(3): 251–256.

[66] Chen YY, Shen HJ, Cui YY, et al. Chromosomal evolution offor the efficient production of lycopene. BMC Biotechnol, 2013, 13: 6.

[67] Vick JE, Johnson ET, Choudhary S, et al. Optimized compatible set of BioBrick? vectors for metabolic pathway engineering. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(6): 1275–1286.

[68] Gibson DG, Young L, Chuang RY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009, 6(5): 343–345.

[69] Wingler LM, Cornish VW. Reiterative recombination for theassembly of libraries of multigene pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(37): 15135–15140.

[70] Dueber JE, Wu GC, Malmirchegini GR, et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat Biotechnol, 2009, 27(8): 753–759.

[71] Ye VM, Bhatia SK. Pathway engineering strategies for production of beneficial carotenoids in microbial hosts. Biotechnol Lett, 2012, 34(8): 1405–1414.

[72] Chandrasekaran S, Price ND. Probabilistic integrative modeling of genome-scale metabolic and regulatory networks inand. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(41): 17845–17850.

[73] Yang L, Cluett WR, Mahadevan R. EMILiO: a fast algorithm for genome-scale strain design. Metab Eng, 2011, 13(3): 272–281.

(本文責編 郝麗芳)

Progress in metabolic engineering of β-carotene synthesis

Yanyan Wang1, Jianmin Xing2, and Hongge Chen1

1,,450002,,2,,,100190,

β-carotene is an important natural plant pigment and has various physiological functions in organisms. With the proposition of systematic biology and progress in carotenoids biosynthesis since the 1960s, metabolic engineering has played a significant role in enhancing carotenoid production. In this review, we present β-carotene’s traditional production methods and metabolic engineering strategies for constructing β-carotene-producing strains. Meanwhile, main problems and corresponding solutions to improve β-carotene yield of engineered strains were further analyzed, for further efficient microbial production of β-carotene.

β-carotene, precursor, synthesis pathways, systems metabolic engineering

September 23, 2016; Accepted: December 23, 2016

Hongge Chen. Tel: +86-371-63555790; E-mail: honggeyz@163.com