張 齊, 王 晶, 譚姣姣, 張全斌, 秦浩然

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低硫酸化雜多糖水解單糖高效液相色譜指紋圖譜研究

張 齊1, 2, 3, 王 晶1, 2, 譚姣姣1, 2, 3, 張全斌1, 2, 秦浩然4

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 青島市實(shí)驗(yàn)高級(jí)中學(xué), 山東 青島 266071)

低硫酸化雜多糖(UF)是從海洋褐藻中分離的一種單糖組成復(fù)雜的硫酸化雜多糖, 在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)活性, 對(duì)帕金森病具有顯著作用。本研究采用水提-醇沉- DEAE-Sepharose Fast Flow交換層析柱制備UF, 經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解和1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone, PMP)衍生化, 通過對(duì)水解條件、衍生化試劑使用量、衍生時(shí)間的考察, 確定最佳衍生條件, 通過高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定UF的單糖組成, 并建立UF的指紋圖譜。在UF水解單糖的指紋圖譜中, 共標(biāo)示出8個(gè)特征共有峰, 經(jīng)鑒別主要色譜峰8個(gè), 分別是D-甘露糖、D-甘露糖醛酸、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖及L-巖藻糖, 其中巖藻糖含量最高, 其次是半乳糖。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好, 可作為UF檢查和鑒別的方法, 建立實(shí)驗(yàn)室UF質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn), 為臨床用UF質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

低硫酸化雜多糖; 巖藻多糖; 指紋圖譜; 柱前衍生化; 高效液相色譜

海帶是褐藻門海帶目(Laminariales)海帶科(Lami-na-riaceae)海帶屬()的一種大型海藻, 很早就被作為中藥入藥。褐藻中的多糖組分被證明具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[1-6]。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)數(shù)十種海藻多糖神經(jīng)保護(hù)作用篩選, 得到一種對(duì)帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)具有顯著作用的褐藻低硫酸化雜多糖(Sulfated Hetero-Polysaccharides, UF)。UF是一個(gè)單糖組成和化學(xué)成分復(fù)雜的低硫酸化雜多糖, 在PD細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)活性, 是一個(gè)有潛力的治療PD的海洋新藥。UF能夠有效對(duì)抗神經(jīng)毒素MPP+致MN9D細(xì)胞損傷, 降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷率; UF 給藥能夠改善MPTP小鼠的行為學(xué)異常, 可以顯著對(duì)抗MPTP引起的小鼠腹側(cè)中腦和紋狀體TH蛋白表達(dá)減少, 改變MPTP小鼠紋狀體DA及DA代謝產(chǎn)物含量; UF給藥能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá), 降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá), 對(duì)DA神經(jīng)元的凋亡有顯著的抑制作用; UF給藥能夠提高黑質(zhì)抗氧化酶的含量, 降低脂質(zhì)過氧化水平[7-8]。

由于多糖的單糖組成和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性, 多糖的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是限制其成藥的重要因素。傳統(tǒng)的多糖檢測(cè)方法如經(jīng)典的苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、凝膠過濾色譜法、光散射法等均存在一定的局限性,近年來隨著指紋圖譜技術(shù)的研究方法與研究思路相對(duì)成熟, 中藥指紋圖譜為進(jìn)一步開發(fā)和利用中藥資源提供了重要的科學(xué)依據(jù), 為多糖的質(zhì)量控制提供了多元的思路和方法[9-21]。因此, 本文對(duì)低硫酸化雜多糖UF的單糖組成指紋圖譜進(jìn)行研究, 旨在建立實(shí)驗(yàn)室UF的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn), 為UF的進(jìn)一步質(zhì)量控制方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀, SPD20A檢測(cè)器(日本島津); 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); 電熱恒溫水浴鍋(HH-ZK4, 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(CT14RDII, 上海天美科學(xué)儀器有限公司); MilliQ超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

原料海帶: 海帶科植物海帶(Aresch)的干燥全藻, 采自山東榮成, 新鮮海帶洗凈晾干, 剪成小塊, 貯藏備用, 符合《中國(guó)藥典》2015年版一部昆布項(xiàng)下規(guī)定。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5- pyrazalone, PMP, 化學(xué)純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA, 成都市科龍化工試劑廠); 乙腈(acetonitrile, 色譜純, 德國(guó)Merk公司); 三乙胺(triethylamine, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 乙酸銨(ammonium acetate, 南京化學(xué)試劑有限公司); 甲醇(methanol, 天津市嘉宇精細(xì)化工有限公司); 三氯甲烷(chloroform, 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司); 乙酸(acetic acid, 優(yōu)級(jí)純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)。

單糖對(duì)照品: D-葡萄糖(D-Glucose), D-甘露糖(D-Mannose), L-鼠李糖(L-Rhamnose), D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid), D-半乳糖(D-Galactose), D-木糖(D-Xylose), L-巖藻糖(L-Fucose), 2-脫氧-D-核糖(D- Deoxyribose)(Sigma公司, 純度均99%以上); D-甘露糖醛酸鈉(單糖)(D-Mannuronic acid sodium salt, 青島博智匯力生物科技有限公司, 純度98%以上); 水為MiliQ純化水; 其他化學(xué)試劑除特殊標(biāo)明外均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備

干燥海藻加水提取, 料液比為1︰30, 在溫度100℃下攪拌提取2 h。提取液先用篩絹初篩, 濾去海帶渣, 濾液繼續(xù)用硅藻土過濾, 經(jīng)減壓濃縮, 濃縮液加氯化鈣除褐藻膠, 離心后上清液經(jīng)透析脫鹽后濃縮, 加入乙醇至濃度為75%, 攪拌、靜置過夜。收集到的沉淀再經(jīng)真空干燥即得褐藻多糖硫酸酯。將褐藻多糖硫酸酯溶于水, 采用過氧化氫和抗壞血酸氧化降解, 反應(yīng)液經(jīng)透析(截留分子質(zhì)量w=3.5 kDa)、減壓濃縮, 乙醇沉淀。利用DEAE-Sepharose Fast Flow交換柱層析進(jìn)行分級(jí), 收集0.5 mol/L氯化鈉洗脫組分, 經(jīng)透析(截留分子質(zhì)量w=3.5 kDa)、減壓濃縮、乙醇沉淀, 沉淀經(jīng)真空干燥得到低硫酸化雜多糖UF。

UF為棕黃色粉末, 經(jīng)半胱氨酸鹽酸鹽法測(cè)定樣品中巖藻糖含量約為11.99%, 經(jīng)咔唑比色法測(cè)定樣品中糖醛酸含量約為18.05%, 離子色譜法測(cè)定該樣品中硫酸根的含量約為11.13%, 經(jīng)GPC凝膠色譜法測(cè)定重均分子質(zhì)量約為7 kDa。

2.2 色譜條件

色譜柱: YMC-Pack ODS-AQ;

流動(dòng)相A: 0.4%三乙胺水溶液(含20 mmol/L 乙酸銨)︰乙腈=9︰1(pH=6.30);

流動(dòng)相B: 0.4%三乙胺水溶液(含20 mmol/L 乙酸銨)︰乙腈=4︰6(pH=6.30);

梯度洗脫比例: 0.01-9.00-30.00-35.00-45 min, 流動(dòng)相B: 10%-14%-64%-64%-10%;

流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30℃; 檢測(cè)波長(zhǎng): 254 nm; 進(jìn)樣體積: 20 μL。

在此條件下, 對(duì)照品混合液中所有單糖成分均可達(dá)到基線分離。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精確稱取上述8種對(duì)照品20 mg, 加入蒸餾水準(zhǔn)確定容至100 mL, 配成0.2 g/L 的混合溶液。精確取脫氧核糖20 mg, 加入蒸餾水準(zhǔn)確定容至100 mL,配成0.2 g/L的溶液。取200 μL對(duì)照品溶液于離心管中, 加入200 μL脫氧核糖溶液, 混合均勻后, 取出100 μL置于離心管中, 依次加入100 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液, 混勻, 70℃水浴中反應(yīng)45 min, 取出, 冷卻至室溫, 用100 μL 0.3 mol/L HCl中和, 加入500 μL三氯甲烷萃取, 7 000 r/min離心5 min, 棄去三氯甲烷層, 至少重復(fù)3次, 至三氯甲烷層無色, 取水層即得對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精確稱取UF樣品100 mg, 加入蒸餾水準(zhǔn)確定容至10 mL, 配成10 g/L的溶液。取1 mL溶液于安瓿瓶中, 加入1 mL 4 mol/L TFA溶液, 110℃水解4 h, 放置至室溫, 加入2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性, 即得到樣品水解液。取水解液按照“2.2”項(xiàng)下方法制備, 即得供試品溶液。

精密吸取與樣品等量的水, “2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理, 即得溶劑空白對(duì)照。

2.5 水解條件篩選

按“2.3”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn), 水解所用TFA濃度分別考察1、2、4及6 mol/L, 精密吸取所得供試品溶液各20 μL, 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析, 以所得HPLC圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標(biāo)。

2.6 PMP衍生條件篩選

2.6.1 PMP衍生時(shí)間篩選

按“2.3”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn), 衍生時(shí)間分別考察15、30、45、60及75 min, 精密吸取所得供試品溶液各20 μL, 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析, 以所得HPLC圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標(biāo)。

2.6.2 PMP衍生化試劑使用量的篩選

按“2.3”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn), 衍生化試劑使用量分別考察80、100、120、140及160 μL, 精密吸取所得供試品溶液各20 μL, 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析, 以所得HPLC圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標(biāo)。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取衍生化后的同一批供試品溶液(批號(hào)S1), 在“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次, 考察各主要共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。

2.7.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取衍生化后的同一批供試品溶液6份(批號(hào)S1—S6), 在“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè), 考察各主要共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。

2.7.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取衍生化后的同一批供試品溶液(批號(hào)S1), 分別于0、2、4、6、10、24 h在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣, 考察各主要共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。

2.8 樣品測(cè)定

按照“1.3.1”項(xiàng)下方法制備10批次UF樣品(批號(hào)S1—S10), 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備10批次樣品的供試品溶液, 按照“2.1”所述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 水解條件篩選

由圖1可知, 在TFA濃度低于4 mol/L時(shí), 隨著水解所用TFA濃度的增大, 主要共有特征峰的峰面積之和逐漸升高, 當(dāng)TFA濃度達(dá)到4 mol/L時(shí), 峰面積達(dá)到最大值, 隨后峰面積開始下降。因此確定水解所用TFA濃度為4 mol/L。

圖1 不同水解TFA濃度對(duì)UF指紋圖譜共有峰面積之和的影響

3.2 PMP衍生條件篩選

3.2.1 PMP衍生時(shí)間篩選

從圖2可知, 隨著衍生時(shí)間從15 min延長(zhǎng)至45 min, 主要共有特征峰的峰面積之和逐漸升高, 當(dāng)衍生時(shí)間達(dá)到45 min時(shí), 峰面積達(dá)到最大值, 隨后峰面積開始下降。因此確定衍生時(shí)間為45 min。

圖2 不同衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)UF指紋圖譜共有峰面積之和的影響

3.2.2 PMP衍生化試劑使用量的篩選

由圖3可知, 隨著衍生化試劑使用量的增加, 主要共有特征峰的峰面積之和呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律, 當(dāng)衍生化試劑的使用量達(dá)到100 μL時(shí), 峰面積達(dá)到最大值, 在該點(diǎn)以后峰面積開始下降。因此確定衍生化試劑的使用量為100 μL。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD< 1%, 相對(duì)峰面積RSD<5%, 表明儀器的精密度良好, 符合指紋圖譜的測(cè)定要求。

圖3 不同衍生化試劑使用量對(duì)UF指紋圖譜共有峰面積之和的影響

3.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD< 1%, 相對(duì)峰面積RSD<5%, 表明該方法的重復(fù)性良好, 符合指紋圖譜的測(cè)定要求。

3.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD< 1%, 相對(duì)峰面積RSD<5%, 表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好, 符合指紋圖譜的測(cè)定要求。

3.4 指紋圖譜的建立與分析

3.4.1 混合單糖對(duì)照品分析

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液, 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè), 得到色譜圖(圖4), 混合單糖對(duì)照品9個(gè)成分均能達(dá)到較好的分離效果。

3.4.2 共有峰的確定及參照峰的選擇

按照“2.3”項(xiàng)下方法制備10批樣品的供試品溶液, 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè), 譜圖結(jié)果顯示, 不同批次樣品均具有基本一致的特征峰, 共標(biāo)示出10個(gè)共有峰。利用對(duì)照品保留時(shí)間定位以及色譜峰紫外光譜分析, 鑒別出10個(gè)色譜峰, 通過保留時(shí)間確定供試品溶液中1號(hào)峰為甘露糖, 2號(hào)峰為甘露糖醛酸, 3號(hào)峰為鼠李糖, 4號(hào)峰為葡萄糖醛酸, 5號(hào)峰為葡萄糖, 6號(hào)峰為半乳糖, 7號(hào)峰為木糖, 8號(hào)峰為巖藻糖, 9號(hào)峰為脫氧核糖(內(nèi)標(biāo))(圖5)。以峰8巖藻糖為參照峰分別計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積, 結(jié)果見表1、表2。

圖4 9種單糖對(duì)照品的高效液相色譜圖

3.4.3 相似度分析

采用計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件2004 A版)比較10批UF供試品HPLC指紋圖譜全譜相似度結(jié)果見表3。

4 討論

現(xiàn)有的單糖分析方法一般為先對(duì)樣品進(jìn)行水解處理, 然后進(jìn)行PMP衍生化。水解使用的TFA濃度與樣品水解程度直接相關(guān), 當(dāng)TFA濃度較低時(shí), 樣品水解不夠完全; 當(dāng)TFA濃度高于4 mol/L時(shí), 共有峰面積之和反而下降, 可能是因?yàn)門FA具有強(qiáng)氧化性, 過高濃度會(huì)導(dǎo)致樣品發(fā)生氧化, 導(dǎo)致樣品被破壞, 單糖含量降低。TFA濃度過高或者過低都無法準(zhǔn)確地對(duì)樣品中的單糖含量進(jìn)行定量分析。因此, 本實(shí)驗(yàn)初步確定降解低硫酸化雜多糖使用TFA的濃度為4 mol/L。

圖5 10批硫酸雜聚糖水解物的高效液相色譜圖

表1 10批硫酸雜聚糖水解物指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批硫酸雜聚糖水解物指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

表3 10批UF樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果

在衍生化的過程中, 衍生化試劑PMP使用量、衍生反應(yīng)時(shí)間都會(huì)對(duì)衍生反應(yīng)的程度產(chǎn)生影響。當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間達(dá)到45 min時(shí), 共有峰面積達(dá)到最大值, 即可反應(yīng)完全。當(dāng)衍生化試劑的使用量高于100 μL時(shí), 隨著PMP使用量的繼續(xù)增加, 峰面積反而下降。說明反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)及PMP用量的增大并不能有利于衍生反應(yīng)的充分進(jìn)行, 可能是由于導(dǎo)致了一些不明副產(chǎn)物的生成, 導(dǎo)致共有峰面積下降。因此初步確定衍生反應(yīng)時(shí)間為45 min, 衍生化試劑PMP的使用量為100 μL。

利用該水解、衍生條件進(jìn)行酸水解-PMP柱前衍生HPLC法對(duì)低硫酸化雜多糖UF的單糖組成進(jìn)行分析, 共鑒別出UF含有的8個(gè)特征峰。從單糖組成上可以看出, UF樣品中巖藻糖和半乳糖的比例最大, 其次是甘露糖醛酸、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、木糖, 其色譜峰的峰面積相對(duì)較低。10批UF供試品均相似度>0.95, 表明PMP柱前衍生HPLC指紋圖譜在對(duì)UF樣品分析中具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性, 可作為UF質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要參考依據(jù)之一。本文研究結(jié)果為建立實(shí)驗(yàn)室UF質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供新思路, 同時(shí)也為海洋多糖類的開發(fā)和質(zhì)量控制提供一定的理論參考。

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HPLC fingerprints of monosaccharides from sulfated hetero-polysaccharides by precolumn derivatization

ZHANG Qi1, 2, 3, WANG Jing1, 2, TAN Jiao-jiao1, 2, 3, ZHANG Quan-bin1, 2, QIN Hao-ran4

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Qingdao Experimental High School, Qingdao 266071, China)

Sulfated heteropolysaccharide (UF) is a novel marine polysaccharide extracted from, with a complex chemical composition and structure. UF showed a significant neuroprotective activity both in cell and animal studies. UF was extracted with hot distilled water and further fractionated by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography. The optimal hydrolysis and PMP derivatization conditions were investigated. UF was hydrolyzed into monosaccharides by trifluoroacetic acid and derivated with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone and analyzed by HPLC to study the monosaccharide components and fingerprint of UF. Nine peaks were detected in the fingerprint, of which 8 were identified as D-mannose, D-Mannuronic acid, L-rhamnose, D-glucuronic acid, D-glucose, D-galactose, D-xylose, and L-fucose. Fucose content was the highest, followed by galactose content. The result shows that the method is convenient, sensitive, and rapid such that it can be applied for the quality control of UF.

Sulfated heteropolysaccharides; fucoidan; fingerprint; precolumn; HPLC

(本文編輯: 康亦兼)

[Fujian Science and Technology project of Shandong Province, No.2016GSF115031; Strategic biological resources network service project of Chinese Academy of Sciences, NO.ZSTH-0025; National Natural Science Foundation of China, No.41406144; Youth Innovation Promotion Association of the Chinese Academy of Sciences, NO.2016190]

Jun. 27, 2017

張齊(1993-), 女, 山東濟(jì)寧人, 碩士研究生, 主要從事海藻化學(xué)與海洋藥物研究, 電話: 0532-82898708, E-mail: zhangqi515@ mails.ucas.ac.cn; 張全斌,通信作者, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 電話: 0532- 82898708, E-mail: qbzhang@qdio.ac.cn

R284

A

1000-3096(2017)12-0096-08

10.11759/hykx20170627001

2017-06-27;

2017-09-22

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016GSF115031); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源網(wǎng)絡(luò)服務(wù)計(jì)劃項(xiàng)目(ZSTH-0025); 國(guó)家自然科學(xué)基金(41406144); 中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)(2016190)