李亞輝， 馬艷弘， 黃開紅， 張宏志， 劉 晨， 喬月芳

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

黑莓發(fā)酵酒澄清穩(wěn)定處理技術(shù)

李亞輝， 馬艷弘*， 黃開紅， 張宏志， 劉 晨， 喬月芳

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

研究了黑莓發(fā)酵酒的澄清和穩(wěn)定處理方法。首先以澄清度和色度為指標(biāo)，利用響應(yīng)面對黑莓酒澄清條件進(jìn)行了優(yōu)化，然后通過穩(wěn)定性檢驗和瓶儲試驗對其穩(wěn)定處理方法進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，最佳澄清條件為：皂土添加量1.0 mg/mL、澄清時間8 d、澄清溫度12℃，此條件下處理后黑莓酒的澄清度和色度分別為0.728和1.106；熱穩(wěn)定處理和阿拉伯膠穩(wěn)定處理只能使黑莓酒在短期內(nèi)保持良好澄清度；冷穩(wěn)定處理可以使黑莓酒處于穩(wěn)定狀態(tài)，長期保持較好的澄清度。此研究為黑莓酒提供了合理有效的澄清穩(wěn)定處理方法，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

黑莓；發(fā)酵酒；澄清；穩(wěn)定；響應(yīng)面

黑莓（Rubus spp.），俗稱覆盆子、木莓等，屬于薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬（Rubrs），實心莓亞屬（Eubatus），是多年生灌木小漿果。黑莓的商業(yè)化栽培19世紀(jì)初始于歐洲和北美，于1986年由中科院植物研究所首次引入中國[1-2]。目前我國黑莓種植面積約占世界種植面積的1/5，已成為亞洲最大的黑莓種植基地和世界知名產(chǎn)地，其中江蘇省種植面積約占我國種植面積的80%[1，3]。黑莓果實酸甜可口、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，尤其是花色苷含量十分豐富，具有較高的營養(yǎng)價值[4-6]，被譽(yù)為繼蘋果和柑桔之后的第3代水果、“黃金水果”和“生命之果”等。

新鮮黑莓不易儲存、保質(zhì)期短，因此對其進(jìn)行深加工是黑莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路。黑莓酒是以黑莓為原料的生物發(fā)酵制品，其最大限度地保留了黑莓果實中的營養(yǎng)成分和保健功能因子，長期飲用具有美容養(yǎng)顏、降血壓、降血脂、保護(hù)血管、減緩衰老等多種功效[7-12]。黑莓酒是一種新興果酒，其生產(chǎn)方法主要參照葡萄酒的釀造工藝。目前黑莓酒生產(chǎn)中還存在很多問題，其中渾濁沉淀是黑莓酒瓶儲中最常見、也是最嚴(yán)重的問題。渾濁沉淀是指經(jīng)過澄清處理后的澄清酒體重新變渾濁或產(chǎn)生沉淀，嚴(yán)重影響著果酒的品質(zhì)及商品形象[13]。澄清穩(wěn)定處理是果酒后處理中的重要步驟，也是解決果酒渾濁沉淀的主要方法。果酒澄清穩(wěn)定的方法主要有下膠、離心、過濾、冷處理、熱處理和添加穩(wěn)定劑等[14-15]。關(guān)于果酒渾濁沉淀處理的文獻(xiàn)雖有不少報道[16-18]，但基本是對澄清處理進(jìn)行研究，主要包括澄清劑的篩選和澄清方法等，而對其穩(wěn)定處理的研究還較少。按照澄清處理方法只能使果酒在短期內(nèi)獲得良好的澄清度，而不能使其長期保持這一澄清度。目前，關(guān)于黑莓酒釀造的文獻(xiàn)還較少，對其進(jìn)行澄清穩(wěn)定處理的方法更是未有報道。為了解決黑莓酒生產(chǎn)中渾濁沉淀這一難題，作者在前期試驗的基礎(chǔ)上，選用皂土作為澄清劑，以澄清度和色度作為指標(biāo)，首先對黑莓酒的澄清條件進(jìn)行優(yōu)化，然后通過不同方法對其進(jìn)行穩(wěn)定處理，以期找到一套合理有效的澄清穩(wěn)定組合處理方法，使其不僅在短時間內(nèi)具有良好的澄清度，而且處于穩(wěn)定狀態(tài)長期保持這一澄清度，為黑莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓酒（體積分?jǐn)?shù)12.2%）：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所釀制；皂土BGR、阿拉伯膠：上海杰兔工貿(mào)有限公司；硅藻土：長白山硅藻土有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV.1600PC型紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；FYL-YS-258控溫冰箱：北京福意聯(lián)電器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；ZNCL-GS數(shù)顯加熱磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 澄清處理

1）澄清劑的配制：皂土溶液的制備參照王英等所述方法[19]：稱取10 g皂土，加入100 mL蒸餾水在50℃水浴中軟化，浸泡24 h，用磁力攪拌器攪拌成均勻漿體。

2）澄清處理：取一定量浸泡好的皂土在攪拌狀態(tài)下加入到500 mL黑莓酒中，使其混合均勻，在一定溫度下靜置一段時間，取上清液測定其澄清度和色度。

3）澄清度和色度測定：澄清度的測定參照徐春等所述方法[20]，以蒸餾水做參比，測定樣品在 680 nm處的透光率表示澄清度；色度的測定參照梁冬梅等所述方法[21]，將黑莓酒稀釋5倍，以蒸餾水為參比，測定樣品在420、520、620 nm處的吸光度值，以三者吸光度值之和表示色度。

1.3.2 單因素試驗 按照1.3.1所述澄清方法，分別研究了皂土用量、澄清時間和澄清溫度對黑莓酒澄清度和色度的影響，單因素試驗設(shè)計及處理條件見表1。

表1 單因素實驗設(shè)計Table 1 Experimental design for single factor

以上每個單因素試驗平行重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，以皂土用量、澄清時間和澄清溫度3個因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析，以-1，0，-1分別代表自變量的低、中、高三個水平，試驗因素及水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 穩(wěn)定處理

1）冷處理：將樣品降溫至-5℃，保持此溫度，靜置10 d，用硅藻土過濾；

2）熱處理：將樣品加熱至60℃處理30 min，用硅藻土過濾；

3）添加阿拉伯膠：按200 mg/L添加阿拉伯膠，并混勻，然后用硅藻土過濾。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗

1）穩(wěn)定性檢驗：參考文獻(xiàn)中所述澄清度穩(wěn)定性檢驗方法對經(jīng)澄清和穩(wěn)定處理的樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗[22-23]，主要對其銅、鐵、蛋白質(zhì)、色素和酒石酸穩(wěn)定性進(jìn)行了檢驗。

2）瓶儲檢驗：將樣品裝瓶、打塞、常溫下避光放置，分別在2、4、6、8、10、12個月后搖勻、取樣，測定其澄清度。每個樣品3個重復(fù)，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

皂土添加量對黑莓酒澄清度和色度的影響見圖1。隨著皂土添加量的增加澄清度逐漸升高，當(dāng)添加量大于1.0 mg/mL時澄清度變化較小；色度隨著皂土添加量的增加逐漸降低，大于0.6 mg/mL時色度下降較快。

澄清時間對黑莓酒澄清度和色度的影響見圖2。由圖2可知，隨著澄清時間的延長，澄清度逐漸升高，當(dāng)澄清時間大于8 d時澄清度變化較小；色度隨著澄清時間的延長逐漸降低，8 d內(nèi)色度下降較為明顯，大于8 d時色度變化較小。

圖1 皂土添加量對黑莓酒澄清度和色度的影響Fig.1 Effect of bentonite amount on clarity and chroma of blackberry wine

圖2 澄清時間對黑莓酒澄清度和色度的影響Fig.2 Effect of clarification time on clarity and chroma of blackberry wine

澄清溫度對黑莓酒澄清度和色度的影響見圖3。由圖3可知，隨著澄清溫度的升高澄清度逐漸降低，澄清溫度小于10℃時澄清度變化較??；色度隨著澄清溫度的升高而逐漸升高，大于20℃時色度變化較小。

圖3 澄清溫度對黑莓酒澄清度和色度的影響Fig.3 Effect of clarification temperature on clarity and chroma of blackberry wine

由圖1～3中澄清度和色度值的變化可看出：皂土添加量對黑莓酒澄清處理后澄清度和色度的影響均較大，澄清溫度對色度的影響較大。皂土是鋁的自然硅酸鹽，可固定水而明顯增加自身體積，在電解質(zhì)溶液中可吸附蛋白質(zhì)和色素而產(chǎn)生膠體的凝聚作用，因此皂土可用于果酒的澄清處理。單因素試驗結(jié)果說明了皂土主要除去了黑莓酒中過多的色素物質(zhì)，使酒體澄清度升高，同時也造成了色度的下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert分析軟件，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以皂土添加量（x1）、澄清時間（x2）和澄清溫度（x3）為自變量，以澄清度（Y1）和色度（Y2）為響應(yīng)值，對黑莓酒澄清穩(wěn)定處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology

利用Design-Expert軟件對表3中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得澄清度（Y1）和色度（Y2）的二次多項回歸模擬方程如下：

Y1=0.718+6.250×10-3x1+3.375×10-3x2+3.125×10-3x3+ 2.250×10-3x1x2+2.250×10-3x1x3-1.500×10-3x2x3-9.417× 10-3x12-6.667×10-3x22-6.667×10-4x32

Y2=1.120-0.031x1-0.015x2-7.875×10-3x3-4.250× 10-3x1x2-3.750×10-3x1x3+4.500×10-3x2x3-0.039x12-0.016x22-5.000×10-3x32

對回歸模型的方差分析見表4。由表4可知，皂土添加量對澄清度和色度均具有極顯著影響（p＜0.01），其二次項對兩者也具有極顯著影響（p＜0.01）；澄清時間對澄清度具有顯著影響（p＜0.05），對色度具有極顯著影響（p＜0.01），其二次項對兩者具有顯著影響（p＜0.05）；澄清溫度對澄清度和色度影響較小。這說明皂土添加量是澄清度的主要影響因素，其次是澄清時間，澄清溫度對其影響較??；皂土添加量和澄清時間是色度的主要影響因素，澄清溫度對其影響較小。響應(yīng)值澄清度所得模型顯著（p＜0.05），響應(yīng)值色度所得模型極顯著（p＜0.01），且兩模型失擬項在p=0.05水平上均不顯著（p＞0.05）；兩個模型的校正決定系數(shù)R2Adj分別為0.907 8和0.925 9，表明這兩個模型的擬合度較好，分別能夠解釋90.78%和92.59%響應(yīng)值的變化，說明這兩個模型能夠很好地預(yù)測澄清條件對澄清度和色度的影響。同時這兩個模型均具有較低的離散系數(shù)（變異系數(shù)，CV）值，分別為0.51%和0.87%，說明整個實驗具有較好的精確度和可靠性。

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 澄清度響應(yīng)面結(jié)果見圖4～6。可以看出，任何兩個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點，皂土量和澄清時間對澄清度的影響比較明顯，兩者交互作用對澄清度的影響也較明顯，澄清溫度對澄清度的影響較小。色度響應(yīng)面結(jié)果見圖7～8?？梢钥闯觯瑘D中交互因素的響應(yīng)面均存在最高點，皂土量對色度的影響較為明顯，澄清時間次之，澄清溫度對色度影響不明顯。

通過Design-Expert軟件分析優(yōu)化得到，獲得最大澄清度和最高色度時的澄清條件為皂土添加量1.0 mg/mL、澄清時間7.95 d、澄清溫度11.56℃，在此條件下黑莓酒澄清度和色度的預(yù)測值分別為0.719和1.118。為了驗證回歸方程的可行性，對所得最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化和驗證試驗。在皂土量、澄清時間和澄清溫度分別為1.0 mg/mL、8 d和12℃下進(jìn)行3次平行試驗，所得澄清度和色度值分別為0.728±0.009和1.106±0.011，與預(yù)測值的相對誤差分別為1.25%和1.07%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。表4 回歸模型方差分析

Table 4 Analysis of variance for the response surface model

注：**差異極顯著，p＜0.01；*差異顯著，p＜0.05。

圖4 皂土量和澄清時間對澄清度的影響Fig.4 Effect of bentonite amount and clarification time on clarity

圖5 皂土量和澄清溫度對澄清度的影響Fig.5 Effectofbentoniteamountand clarification temperature on clarity

圖6 澄清時間和澄清溫度對澄清度的影響Fig.6 Effect of clarification time and temperature on clarity

圖7 皂土量和澄清時間對色度的影響Fig.7 Effect of bentonite amount and clarification time on chroma

圖8 皂土量和澄清溫度對色度的影響Fig.8 Effectofbentoniteamountand clarification temperature on chroma

2.3 穩(wěn)定處理結(jié)果

按照2.2.2中優(yōu)化條件對黑莓酒進(jìn)行澄清處理后（對照），再分別對其進(jìn)行冷穩(wěn)定處理、熱穩(wěn)定處理和添加阿拉伯膠穩(wěn)定處理，穩(wěn)定處理后澄清度和色度的變化見圖9。由圖9（a）可知，冷穩(wěn)定處理后澄清度有明顯的升高，熱穩(wěn)定處理和添加阿拉伯膠穩(wěn)定處理后澄清度無明顯變化；由圖9（b）可知，冷處理后色度有所降低，熱處理和阿拉伯膠處理后色度沒有發(fā)生明顯變化。熱處理可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，在冷卻后使蛋白質(zhì)絮凝發(fā)生沉淀，同時溫度升高使酒中保護(hù)性膠體粒子變大，加強(qiáng)其保護(hù)作用，從而使酒體達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；冷處理可以促進(jìn)酒中酒石結(jié)晶的沉淀，同時使酒中以膠體狀態(tài)存在的色素發(fā)生沉淀，從而使酒體達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；阿拉伯膠可形成保護(hù)性膠體，阻止非穩(wěn)定性膠體的凝結(jié)和絮沉，防止酒的膠體性渾濁和沉淀，從而使酒達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。以上結(jié)果表明，熱處理和添加阿拉伯膠處理對酒原有的澄清度和色度影響不大，這和它們對酒穩(wěn)定的機(jī)理相符。冷處理對酒澄清度和色度都有一定的影響，說明低溫促進(jìn)了黑莓酒中色素物質(zhì)的進(jìn)一步沉淀，從而增加了其澄清度、降低了其色度。

圖9 不同穩(wěn)定處理后澄清度和色度的變化Fig.9 Changes of clarity and chroma after different stabilization treatment

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.1 穩(wěn)定性檢驗 按照2.2.2中優(yōu)化條件對黑莓酒進(jìn)行澄清處理后，再分別對其進(jìn)行不同的穩(wěn)定處理，然后對不同處理后的樣品進(jìn)行澄清度穩(wěn)定性檢驗，結(jié)果見表5。其中，對照為原酒無經(jīng)過澄清穩(wěn)定處理；澄清處理為按照優(yōu)化條件只進(jìn)行了澄清處理；冷處理、熱處理、阿拉伯膠處理，為按照優(yōu)化條件進(jìn)行了澄清處理后，又分別進(jìn)行了冷、熱和添加阿拉伯膠穩(wěn)定處理。結(jié)果表明，沒有經(jīng)過澄清和穩(wěn)定處理的黑莓酒具有潛在的蛋白質(zhì)破敗和色素沉淀，無潛在的銅破敗、鐵破敗和酒石沉淀，同時也說明黑莓酒的澄清穩(wěn)定處理主要是除去酒中過量的蛋白質(zhì)和色素；澄清處理所示結(jié)果說明，利用2.2.2中優(yōu)化的澄清條件對黑莓酒進(jìn)行處理，可大大減少其潛在的蛋白質(zhì)破敗和色素沉淀，但不能完全除去，同時也說明只通過皂土進(jìn)行下膠處理不能使酒達(dá)到完全的穩(wěn)定狀態(tài)；冷處理、熱處理和阿拉伯膠處理結(jié)果說明，利用優(yōu)化條件對黑莓酒進(jìn)行澄清處理后再進(jìn)行冷處理和添加阿拉伯膠處理可除去其潛在的蛋白質(zhì)破敗和色素沉淀，進(jìn)行熱處理可除去其潛在的蛋白質(zhì)破敗但不能完全除去其潛在的色素沉淀，這些結(jié)果和各穩(wěn)定處理方法的機(jī)理一致。

表5 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Table 5 Results of stability test

2.4.2 瓶儲檢驗 對2.3.1中對照和樣品進(jìn)行瓶儲試驗，以進(jìn)一步檢驗其穩(wěn)定性，結(jié)果見圖10?？芍獰o經(jīng)過澄清和穩(wěn)定處理的黑莓酒（對照）在瓶儲期間澄清度呈下降趨勢，瓶儲2個月后澄清度開始明顯下降；只經(jīng)過澄清處理的黑莓酒（澄清處理）在瓶儲4個月內(nèi)澄清度較為穩(wěn)定，4個月后澄清度開始明顯下降；澄清處理后分別進(jìn)行熱處理（熱處理）和阿拉伯膠處理（阿拉伯膠）的黑莓酒，在瓶儲8個月內(nèi)澄清度較為穩(wěn)定，8個月后澄清度開始明顯下降；澄清處理后進(jìn)行冷處理（冷處理）的黑莓酒，在瓶儲期間（12個月）澄清度較為穩(wěn)定。這些結(jié)果表明：澄清處理可使黑莓酒獲得良好澄清度，但不能使其長期保持澄清度；澄清處理后進(jìn)行熱穩(wěn)定處理和阿拉伯膠穩(wěn)定處理可延長其澄清度保持時間，也不能使其長期保持良好的澄清度；澄清處理后進(jìn)行冷穩(wěn)定處理可使黑莓酒處于穩(wěn)定狀態(tài)，長期保持較好的澄清度。同時說明，皂土下膠處理只能除去黑莓酒中部分潛在的色素和蛋白質(zhì)沉淀，只有結(jié)合冷穩(wěn)定處理才能使其長期處于澄清穩(wěn)定狀態(tài)。另外，樣品“阿拉伯膠”瓶儲試驗結(jié)果與穩(wěn)定性檢驗結(jié)果不一致，這可能是因為阿拉伯膠在酒中形成保護(hù)性膠體，阻止非穩(wěn)定性膠體的凝結(jié)，在短時間內(nèi)使酒處于穩(wěn)定狀態(tài)，但長時間瓶儲后，由于阻止酒中渾濁沉淀的自然形成，使酒體呈乳狀、顏色變混暗造成的[22]。

圖10 瓶儲中黑莓酒澄清度的變化Fig.10 Changes of clarity of blackberry wine during storage in bottle

3 結(jié)語

作者以澄清度和色度為指標(biāo)，利用響應(yīng)面對黑莓酒澄清條件進(jìn)行了優(yōu)化。最佳澄清條件為皂土添加量1.0 mg/mL、澄清時間8 d、澄清溫度12℃，在此條件下處理后，黑莓酒的澄清度和色度分別為0.728和1.106。澄清處理后采用不同方法對黑莓酒進(jìn)行穩(wěn)定處理，經(jīng)穩(wěn)定性檢驗和瓶儲試驗得：澄清處理只能使黑莓酒在短期內(nèi)保持較好澄清度，澄清處理后再進(jìn)行冷穩(wěn)定處理可使黑莓酒處于穩(wěn)定狀態(tài)，長期保持較好澄清度。

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Technology Study of Clarification and Stabilization of Blackberry Wine

LI Yahui， MA Yanhong*， HUANG Kaihong， ZHANG Hongzhi， LIU Chen， QIAO Yuefang
（Institute of Farm Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

This study focused on the technology for clarification and stabilization of blackberry wine.Firstly，the method for clarification of blackberry wine was optimized using response surface methodology，with clarity and chroma as assessment indicators.Then stabilization method was screened by stability test and storage performance in bottle.Results showed that the optimum condition for clarification of blackberry wine was bentonite amount of 1.0 mg/mL，clarification time of 8d and clarification temperature of 12℃.Under such condition，the final clarity and chroma of blackberry wine was 0.728 and 1.106 respectively.Blackberry wine showed high clarity in a short term after heat treatment and acacia addition，while it being stable kept high clarity in a long term after cold treatment.This study provides an effective way for clarification and stabilization of blackberry wine，and a theoretical basis and technical support for the industrial production of blackberry wine.

blackberry（Rubus spp.），wine，clarification，stabilization，response surface

S 567.2

A

1673—1689（2017）03—0302—08

2016-09-20

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目（GCSXC[2016]334）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目（CS（15）1026）。

李亞輝（1985—），男，河南郟縣人，工學(xué)博士，助理研究員，主要從事食品發(fā)酵與生物技術(shù)研究。E-mail：liqianhao217@126.com

*通信作者：馬艷弘（1972—），女，山西呂梁人，工學(xué)博士，副研究員，主要從事果蔬加工方面的研究。E-mail：ma_yhhyy@126.com

李亞輝，馬艷弘，黃開紅，等.黑莓發(fā)酵酒澄清穩(wěn)定處理技術(shù)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：302-309.