杜寧宇 蘆 娟 郭長青 盧勝春 趙瑞利 徐 菁 張 偉 馬薇薇 梁靖蓉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2014級碩士研究生，北京 100029)

針刀干預(yù)對帕金森病模型大鼠紋狀體內(nèi)去甲腎上腺素及5-羥色胺含量的影響

杜寧宇 蘆 娟1郭長青△盧勝春2趙瑞利3徐 菁3張 偉4馬薇薇 梁靖蓉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2014級碩士研究生，北京 100029)

目的 觀察帕金森病模型大鼠紋狀體內(nèi)去甲腎上腺素(NA)、5-羥色胺(5-HT)的含量以及針刀干預(yù)后的變化，探討針刀治療帕金森病的作用機(jī)制。方法 成年健康雄性SD大鼠76只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組60只，空白組16只。實(shí)驗(yàn)組60只采用右側(cè)紋狀體雙靶點(diǎn)注射6-羥多巴胺(6-OHDA)造模，造模結(jié)束后用阿樸嗎啡(APO)誘導(dǎo)法進(jìn)行模型評價，并通過行為學(xué)檢測，實(shí)驗(yàn)組共有48只大鼠造模成功，隨機(jī)分為模型組、藥物組和針刀組，每組16只?？瞻捉M和模型組正常抓取刺激，不進(jìn)行干預(yù)治療；藥物組予美多芭片懸濁液治療，每日1次，連續(xù)4周；針刀組進(jìn)行松解干預(yù)，每周2次，連續(xù)4周。治療結(jié)束1周后進(jìn)行行為學(xué)評價，通過蘇木精-伊紅(HE)染色圖片觀察大鼠紋狀體的病理學(xué)變化，通過高效液相色譜法觀察大鼠紋狀體NA、5-HT的含量。結(jié)果 行為學(xué)評價結(jié)果顯示，空白組大鼠未見旋轉(zhuǎn)，模型組大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)，干預(yù)后藥物組及針刀組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少(P<0.01)，且治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠紋狀體內(nèi)NA、5-HT含量減少(P<0.05)；與模型組比較，藥物組和針刀組大鼠紋狀體中NA、5-HT含量顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 針刀對帕金森病模型大鼠的治療作用可能與其松解頸部肌肉，改善局部血液循環(huán)，增加NA、5-HT的含量，從而減輕帕金森病的癥狀有關(guān)。

帕金森??；針刀；去甲腎上腺素；5-羥色胺

帕金森病(parkinson's disease,PD)又稱“震顫麻痹”，目前是僅次于阿爾茨海默病(alzheimer's disease，AD)的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)異常為主要特征，中老年人高發(fā)。因其病情會持續(xù)進(jìn)展，并發(fā)癥、致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是神經(jīng)系統(tǒng)的第二大難治病[1]。2個多世紀(jì)的研究發(fā)現(xiàn)其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)、紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的減少及神經(jīng)元胞漿內(nèi)大量的嗜酸性路易小體的累積[2]。目前，主要認(rèn)為神經(jīng)毒性、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激、基因變異、腦代謝失常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等與PD發(fā)病密切相關(guān)[3]?，F(xiàn)階段PD的治療手段有：藥物治療、手術(shù)治療、基因治療、康復(fù)訓(xùn)練、飲食治療等[4]。隨著微創(chuàng)療法在臨床的發(fā)展和普及，建立在傳統(tǒng)“九針”基礎(chǔ)上的創(chuàng)新針具針刀，近年來發(fā)展迅速[5]。臨床實(shí)踐表明通過針刀系統(tǒng)治療可顯著改善患者癥狀，提高其生活質(zhì)量[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠右側(cè)紋狀體雙靶點(diǎn)注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備PD模型，通過檢測并分析大鼠紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NA)、5-羥色胺(5-HT)的含量變化，探索針刀治療PD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級SD大鼠76只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2015-0001。動物分籠，在安靜、避強(qiáng)光且通風(fēng)的SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，濕度35%～37%，自然光線，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物及試劑 NA、5-HT、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、檸檬酸(CA)、乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTA)均為AR級，美國Sigma公司；辛烷基磺酸鈉(OSA)為HPLC級，美國Sigma公司；乙腈(ACN)為HPLC級，美國Fisher Scientific公司；高氯酸(HClO4)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)均為國產(chǎn)AR級，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器 16通道Coularray庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜儀及色譜工作站、5600A電化學(xué)檢測器、582二元泵體系、542自動進(jìn)樣器、5040型固態(tài)微孔電極(鉑電極、固態(tài)鈀電極)、6210碳石墨電極、CH150型柱溫箱、ACH-SPR柱后固定化酶反應(yīng)器、ACH-3色譜柱(3.2 mm×150 mm 3 μm、C184.6 mm×150 mm 5 μm)，均為美國ESA公司；MIKRO 22R離心機(jī)，德國Hettich公司；低溫冰箱，法國JOUAN公司；針筒式微孔濾膜過濾器：水系(0.22 μm)，天津騰達(dá)過濾器廠；大腦立體定位儀，美國Stoelting公司；漢章系列一次性針刀(規(guī)格0.4 mm×40 mm)，北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司。

1.4 造模與分組 成年健康雄性SD大鼠76只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組60只，空白組16只。造模前禁食12 h，采用右側(cè)紋狀體雙靶點(diǎn)注射法。以10%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射(4 mL/kg)麻醉大鼠，待麻醉完全后用剃毛機(jī)剔除顱頂部鼠毛，將動物頭部固定在大腦立體定位儀上，使其頭部保持顱平位，示指稍用力向下按壓大鼠頭部而未從耳桿中脫落為固定牢固。頭部備皮碘伏消毒后，用手術(shù)刀片在右耳前做長1.5 cm的切口，處理切口面至暴露出前囟，確定前囟坐標(biāo)。按照《大鼠腦立體定向圖譜》[8]定位右側(cè)紋狀體2個注射點(diǎn)坐標(biāo):第1點(diǎn)為前囟前0.7 mm，矢狀線右側(cè)3.0 mm，硬膜下4.5 mm；第2點(diǎn)為前囟后0.2 mm，中線右側(cè)2.6 mm，硬膜下6.0 mm[9]，以小號牙科球形鉆頭按上述坐標(biāo)鉆孔，當(dāng)出現(xiàn)突破感時立即停止，用10 μL微量注射器刺破骨膜，以0.5 μL/min速度分別向每點(diǎn)注射6-OHDA 15 μg(溶于3 μL含0.2%維生素C的0.9%氯化鈉注射液中)，注畢留針10 min，然后以1 mm/min的速度緩慢退針，用明膠海綿填塞鉆孔，縫合[10]。為防感染，造模結(jié)束后腹腔注射青霉素鈉8萬單位。注意術(shù)后保暖,室溫25～28 ℃，在其蘇醒前應(yīng)密切觀察動物全身情況，清醒后單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后有2只死亡，其余均存活良好，未出現(xiàn)明確的手術(shù)并發(fā)癥。

實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第6周腹腔注射0.01%阿樸嗎啡(APO)0.5 mg/kg，于5 min后開始觀察并記錄1 h內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)的啟動時間、持續(xù)時間、啟動后的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。首見短暫木僵、首尾相接，一般于注射后5～20 min內(nèi)出現(xiàn)以左側(cè)后肢為支點(diǎn)原地向左轉(zhuǎn)動，先慢后快等行為學(xué)表現(xiàn)。部分大鼠伴有震顫、嗅探、覓食、步態(tài)不穩(wěn)、少動等異常行為。向健側(cè)旋轉(zhuǎn)平均轉(zhuǎn)速>7 轉(zhuǎn)/min視為造模成功。通過行為學(xué)檢測和模型評價，實(shí)驗(yàn)組共有48只大鼠造模成功。

1.5 干預(yù)方法 將實(shí)驗(yàn)組造模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組、藥物組和針刀組，每組16只，空白組16只，共64只。藥物組：美多芭片(即多巴絲肼片)按照50 mg/kg劑量，用研缽研碎后溶于0.9%氯化鈉注射液中，配制成懸濁液，為大鼠藥物，每日1次，連續(xù)給藥4周。針刀組：以龍膽紫定位寰椎、樞椎橫突點(diǎn)，常規(guī)備皮、消毒，選用HZ系列一次性針刀，規(guī)格0.4 mm×40 mm(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司)，進(jìn)針時刀口線與大鼠身體縱軸平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，針刺至枕骨骨面和寰椎、樞椎橫突處，當(dāng)?shù)度薪佑|骨面時，縱行疏剝2次，出針并按壓片刻止血。每周2次，連續(xù)治療4周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 中腦黑質(zhì)HE染色 治療結(jié)束后每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行灌注取腦。先用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，待充分麻醉后打開胸腔，充分暴露心臟。先將右心耳用止血鉗固定，再剪開一小口，將灌注針插入，向心臟快速灌入100 mL 0.9%氯化鈉注射液，待右心耳流出無色液體后改用4%多聚甲醛固定液灌注，直至大鼠四肢僵硬，軀體反弓，鼠尾挺直，爪甲變白等。灌注成功后快速冰上取腦，置于4%多聚甲醛固定液待測。標(biāo)本經(jīng)固定后，石蠟包埋，切片(5 μm)，脫蠟，染色。常規(guī)脫水，中性樹脂封片。

1.6.2 各組大鼠紋狀體NA、5-HT含量檢測 將每組剩余的8只大鼠紋狀體進(jìn)行勻漿。用10%的水合氯醛腹腔麻醉，待其麻醉充分后，迅速斷頭處死，開顱取出腦組織，低溫條件下分離出右側(cè)紋狀體，稱質(zhì)量后置于-70 ℃液氮中待測。將樣品制成100 g/L組織勻漿，離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，取上清液。流動相：NaH2PO490 mmol/L，CA 50 mmol/L，OSA 1.7 mmol/L，EDTA 0.05 μmol/L。上述溶液以0.2 μm水系膜過濾，濾過液中加入乙腈(10%)。流速：0.6 mL/min，電勢，工作電極1：-150 mV、工作電極2：450 mV、工作電極3：500 mV、工作電極4：550 mV，柱溫：25℃。自動進(jìn)樣器每次進(jìn)樣10 μL，以峰面積計(jì)算濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組中腦黑質(zhì)HE染色光鏡結(jié)果 空白組：神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核呈圓形或錐形，神經(jīng)纖維排列較為整齊、致密。模型組：神經(jīng)元細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核仁不明顯，神經(jīng)纖維排列較紊亂、疏松。藥物組：與模型組比較神經(jīng)元腫脹減輕，體積變小，細(xì)胞間隙變窄，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，神經(jīng)纖維排列較模型組整齊。針刀組：形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，細(xì)胞腫脹減輕，神經(jīng)纖維排列較整齊。見圖1。

圖1 各組中腦黑質(zhì)HE染色光鏡結(jié)果(HE，×200)

2.2 各組治療前后大鼠旋轉(zhuǎn)行為測定結(jié)果比較 見表1。

由表1可見，空白組大鼠未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為；模型組出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，且治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，治療后藥物組、針刀組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少(P<0.01)，且藥物組及針刀組與本組治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后針刀組與藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組治療前后大鼠旋轉(zhuǎn)行為測定結(jié)果比較 轉(zhuǎn)

與本組治療前比較， *P<0.01；與模型組治療后比較，△P<0.01

2.3 各組大鼠紋狀體內(nèi)NA、5-HT含量比較 見表2。

組 別nNA5-HT空白組8170.19±27.54△51.07±10.80△模型組8103.69±28.90*28.65±15.41*藥物組8144.24±35.82*△43.44±8.20△針刀組8134.17±19.97△44.96±8.39△

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠紋狀體中NA、5-HT的含量明顯下降(P<0.05)，說明PD造模成功后大鼠紋狀體內(nèi)NA含量低于正常水平。與空白組比較，藥物組大鼠紋狀體中NA的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，針刀組大鼠紋狀體中NA的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥物組、針刀組紋狀體中5-HT的含量與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，藥物組、針刀組的NA、5-HT含量顯著升高(P<0.05),說明經(jīng)針刀治療后NA、5-HT含量接近正常水平，但藥物組與針刀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

PD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，受損部位常為黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)，多因神經(jīng)功能受損導(dǎo)致單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與乙酰膽堿平衡失調(diào)而引發(fā)疾病。其病理改變主要是黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少伴有基底節(jié)神經(jīng)核團(tuán)的功能改變[11]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)PD患者伴有腦部血流量減少,基底節(jié)黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)尤為明顯，血流量減少與臨床癥狀波動有密切關(guān)系[12]。有研究表示，頸部的軟組織病變可能直接或間接影響頸上交感神經(jīng),引起枕后區(qū)域供血障礙，致使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成原料不足，從而引起一系列的PD癥狀[13]。目前，國際神經(jīng)科學(xué)界一致認(rèn)為PD治療的理想目標(biāo)是控制疾病癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，延緩病程進(jìn)展及減少藥物的不良反應(yīng)和并發(fā)癥[14]。近年來針刀治療PD在臨床中取得了可靠且無毒副作用的療效，充分體現(xiàn)了針刀治療PD的特點(diǎn)及優(yōu)勢，具有重要的研究意義。本實(shí)驗(yàn)選取大鼠枕骨骨面和頸椎(C)1、C2橫突處作為治療點(diǎn)，通過針刀松解頸部肌肉，檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，以期為控制PD癥狀提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用腦內(nèi)右側(cè)紋狀體定向注射6-OHDA建立PD大鼠模型，以6-OHDA作為神經(jīng)毒性物質(zhì)，進(jìn)入腦內(nèi)被紋狀體多巴胺能神經(jīng)元攝取后，在單胺氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化成自由基造成神經(jīng)元不可逆損傷并死亡[15]。相較于用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)所建立的PD小鼠模型，該模型通過藥物損毀紋狀體，導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞死亡，引發(fā)黑質(zhì)-紋狀體通路功能減退，出現(xiàn)的行為學(xué)改變比較穩(wěn)定，不易出現(xiàn)神經(jīng)元功能自行恢復(fù)。且實(shí)驗(yàn)對象價格便宜容易獲取，個體較小鼠方便針刀定位治療及取腦研究[16]。

由于腦內(nèi)黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)的單胺類神經(jīng)元減少是引起PD臨床癥狀的主要因素，而NA、5-HT在紋狀體中的含量又相對較高，因而我們采用高效液相色譜法觀察紋狀體內(nèi)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)NA、5-HT的含量變化，以評估不同治療手段干預(yù)后對PD模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。NA是作為哺乳動物的神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮生物活性，不僅是交感神經(jīng)末梢的遞質(zhì)，而且還是重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。NA對中樞神經(jīng)元的作用較為復(fù)雜，既有抑制作用，也有興奮作用。研究證明，黑質(zhì)-紋狀體通路變性可導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生改變，包括5-HT能神經(jīng)元的缺失、5-HT遞質(zhì)水平的下降和5-HT受體表達(dá)的變化等[17]。本實(shí)驗(yàn)通過黑質(zhì)HE染色切片觀察到模型組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核仁不明顯，神經(jīng)纖維排列較紊亂、疏松，經(jīng)過針刀治療后神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，細(xì)胞腫脹減輕，神經(jīng)纖維排列較整齊。通過高效液相色譜法檢測到，模型組大鼠紋狀體內(nèi)NA、5-HT含量較空白組減少(P<0.05)，藥物組、針刀組大鼠紋狀體中NA、5-HT含量較模型組顯著增高(P<0.05)。說明針刀能夠緩解PD癥狀，可能與松解頸部肌肉，減輕其對頸上交感神經(jīng)的刺激、卡壓，使頸部攣縮的血管舒張，改善局部供血，增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成原料，促進(jìn)紋狀體中NA、5-HT釋放有關(guān)。美多芭是目前治療PD的主要藥物之一，該藥物能有效改善PD患者的運(yùn)動障礙癥狀[18]。針刀對模型大鼠的治療作用與一線治療藥物美多芭的療效雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療效果相近且穩(wěn)定，同時又避免了藥物副作用的產(chǎn)生，適合在臨床推廣。本次實(shí)驗(yàn)還未涉及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)代謝指標(biāo)的具體起效時間、起效通路以及相關(guān)蛋白、基因以及頸部肌組織局部血液流變學(xué)等指標(biāo)，還有很大的研究空間，故仍值得我們繼續(xù)研究，以期為臨床針刀治療PD提供更加明確的起效機(jī)制和理論依據(jù)。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of Needle-knife intervention on striatum norepinephrine and 5-hydroxytryptamine in Parkinson's disease rats

DUNingyu*,LUJuan,GUOChangqing,etal.

*2014-GradeMasterofAcupunctureandMassageCollege,BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029

Objective To observe the normal contents of striatum norepinephrine (NA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) and its changes after needle-knife intervention, to explore the mechanism of needle-knife on the treatment of Parkinson's disease. Methods 76 adult healthy male SD rats were randomly divided into the experimental group (n=60) and the blank group (n=16). The models of Parkinson's disease in experimental group were induced by double target injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into right apomorphine (APO) and behavior test, finally 48 rats with successful modeling were randomly divided into model group, medicine group and needle - knife group, 16 rats in each group.The blank group and model group received normal garb stimulation with no intervention.The medicine group received medopar tablet suspension once daily, continuously treatment for 4 weeks.The needle - knife group received relax intervention, 2 times per week for 4 weeks. The behavioral evaluation was performed 1 week after the end of treatment, the pathological changes of rats' striatum were observed by hematoxylin - eosin (HE) staining, the contents of striatum NA and 5-HT were observed by high performance liquid chromatography. Results The behavioral evaluation showed that there was no rotation in blank group, the rotation appeared in the model group, the revolutions after intervention in medicine group and needle - knife group were significantly decreased (P<0.05), and there were significant differences between before and after treatment (P<0.01). As compared with the blank group, the striatum NA and 5-HT in model group were obviously decreased (P<0.05); As compared with the model group, the striatum NA and 5-HT in medicine and needle - knife group were significantly increased (P<0.05). Conclusion Needle - knife intervention has therapeutic effects on Parkinson's model rats, which may be related with its effects of relaxing neck muscles, improving local blood circulation and increasing NA and 5-HT, thus alleviating the symptoms of Parkinson's disease.

Parkinson's disease; Needle -knife; Norepinephrine; 5-HT

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.025

杜寧宇(1990—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：針刀理論與臨床研究。

R-332;R245-33;R745.705

A

1002-2619(2017)03-0415-05

2017-01-19)

△ 通訊作者:北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2014級博士研究生，北京 100029

2 江西省德興市勝春醫(yī)院，江西 德興 334200

3 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2015級碩士研究生，北京 100029

4 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2015級博士研究生，北京 100029