賀梅娟 楊若瀕 楊晉翔 安 靜

(北京市豐臺區(qū)盧溝橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，北京 100165)

實 驗 研 究

益氣化瘀解毒法對慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠DNA甲基化酶3b基因的影響※

賀梅娟 楊若瀕 楊晉翔1安 靜1

(北京市豐臺區(qū)盧溝橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，北京 100165)

目的 觀察益氣化瘀解毒法對慢性萎縮性胃炎伴異型增生模型大鼠DNA甲基化酶3b(DNMT3b)基因的影響。方法 將60只SPF級健康雄性Wistar大鼠隨機分為造模組50只、空白組10只。造模成功后將造模組剩余的33只大鼠隨機分為模型組、維酶素組、消痞顆粒組，每組11只。模型組予0.9%氯化鈉注射液，維酶素組予維酶素懸濁液，消痞顆粒組予消痞顆粒中藥制備藥液，各組均每日灌胃1次，連續(xù)治療12周后檢測各組大鼠DNMT3b蛋白表達量。結(jié)果 維酶素組、模型組DNMT3b蛋白表達量較空白組均明顯升高(P<0.01)；消痞顆粒組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。維酶素組、消痞顆粒組DNMT3b蛋白表達量較模型組降低(P<0.01)；消痞顆粒組低于維酶素組(P<0.01)。結(jié)論 中醫(yī)益氣化瘀解毒法可以逆轉(zhuǎn)胃黏膜異型增生，其作用機制可能是通過下調(diào)DNMT3b而實現(xiàn)的。

益氣祛瘀；解毒；胃炎,萎縮性；增生；大鼠,Wistar；基因；動物實驗

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均居第3位[1]。異型增生、腸化生以及導(dǎo)致二者出現(xiàn)的慢性萎縮性胃炎是胃癌較為常見的早期病變?，F(xiàn)階段世界范圍內(nèi)對胃癌尚無有效治療手段，因此加強對胃癌的防御有重大意義，該方面的研究逐漸引起了許多專家與學(xué)者的關(guān)注。最新研究表明，胃癌成因較復(fù)雜，并不是由單一因素所引起，有研究表明，抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島的高甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致基因表達沉默，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2-3]，而抑癌基因CpG島高甲基化與DNA甲基化酶(DNMT)的高表達密切相關(guān)，DNMT3b是DNMT之一，其失活或突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。本研究通過建立慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠模型,觀察益氣化瘀解毒法對DNMT3b的影響,為臨床防治胃癌前病變,降低胃癌的發(fā)病率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 共選取SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量約100 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物 消痞顆粒(藥物組成：黨參、炙百合、烏藥、香櫞、丹參、三七粉、莪術(shù)、蒲公英、白花蛇舌草),由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室制成含生藥9 g/g的沖劑,使用時配制成濃度為0.36 g/mL的藥液;維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，國藥準字H13023904,批號20090506)，碾成粉末狀，配制成濃度為0.15 g/mL的懸濁液,濾去糖衣沉渣備用;N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG，日本東京化成工業(yè)株式會社，產(chǎn)品編號M0527)，用去離子水配制成1 g/L的母液,存放于4 ℃冰箱備用，使用時用SPF級動物飲用水稀釋為120 μg/mL的溶液,整個過程均需避光操作保存;雷尼替丁飼料,鹽酸雷尼替丁膠囊(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司,國藥準字H13022873，批號：100902256)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司制成含0.03%雷尼替丁的顆粒狀SPF級大鼠飼料;氨水由西隴化工有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：1503232，每日用SPF級動物飲用水配制成0.05%的溶液。

1.1.3 儀器 Allgre 21R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；MK3酶標儀(Thermo公司)；VE180小型高通量電泳槽(上海天能公司)；VE186轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能公司)；PowerPac HC高電流電源(美國伯樂公司)；酸堿度測試儀(德國Sartorius公司)；振蕩機(其林貝爾公司)；勻漿機(瑞士Fluka公司)。

1.1.4 試劑 BCA蛋白定量試劑盒(北京康為公司)；Protein ladder(北京博邁德生物)；PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；一抗DNMT3b為兔單克隆抗體(Abcam公司，貨號:ab16049)；二抗為辣根酶標記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Jackson公司，貨號:111-035-003)。

1.2 分組及造模 將60只大鼠隨機分為2組，空白組10只，造模組50只?？瞻捉M大鼠給予普通飼料進行喂養(yǎng)。造模組大鼠予分籠喂養(yǎng)，每日飲用濃度為0.05%的氨水，氨水溶液須每日更新1次；采用0.03%的雷尼替丁飼料進行喂養(yǎng)，同時每日予120 μg/mL的MNNG灌胃，每只5 mL/kg，一直持續(xù)到第32周。在實驗過程中于第20、24、26、28、30、32周末從造模組當中的大鼠中隨機抽取2只大鼠，在完成造模之后，將存活的33只(造模期間死亡5只)大鼠隨機分為3組：模型組、維酶素組、消痞顆粒組，每組11只，均以普通飼料進行喂養(yǎng)。模型組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予0.9%氯化鈉注射液3 mL/kg灌胃，維酶素組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予維酶素懸濁液2 mL/kg灌胃，消痞顆粒組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予消痞顆粒藥液3 mL/kg灌胃，灌胃每日1次，持續(xù)12周。在第44周末，本實驗所有大鼠以戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉注射，進行全胃摘除，在摘除完成之后，需快速將胃沿大彎處切開，并用低溫0.9%氯化鈉注射液對胃的內(nèi)容物進行清洗，將胃竇部黏膜封存，存儲在液氮當中，并保持其溫度≤-80 ℃。大鼠摘胃后均處死。

1.3 觀察指標及方法 將胃黏膜組織從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進行快速研磨，然后裝入預(yù)冷的EP管中，預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑(磷酸化蛋白需要同時加入磷酸酶抑制劑)。組織按照10%勻漿，即10 mg組織加入100 μL RIPA裂解液，充分裂解。冰上孵育20 min后，13 000 r/min，4 ℃，離心20 min。取上清，分裝-80 ℃保存。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。根據(jù)樣品數(shù)量，試劑A∶B=50∶1配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定；完全溶解蛋白標準品，取10 μL稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL；將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的標準品孔中，并用標準品稀釋液補足20 μL；將待測樣品滴加至樣品孔中，用標準品稀釋液補足20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min；測定A570 nm，繪制標準曲線圖并計算蛋白濃度。分別取60 μg總蛋白與上樣液混合，上樣前煮沸5 min，將蛋白加入點樣孔，電泳初始電壓90 V，溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣后提高電壓至120 V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍泳出分離膠的下緣。濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流，0.45 μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間150 min，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，PVDF膜取出標記膜的方向。將膜完全浸沒于5%牛血清三羥甲基氨基甲烷緩沖液(BSA-TBST)中，水平搖床孵育1 h。5%BSA-TBST稀釋一抗，1∶1 000，4 ℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗3次，每次10 min。5%BSA-TBST稀釋二抗，1∶10 000，室溫孵育45 min。TBST洗膜3次，每次10 min。加入顯影液，暗室顯色，掃描膠片，用Genpro32軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析，經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

各組DNMT3b蛋白表達量比較見表1、圖1。

組 別nDNMT3b蛋白表達量空白組100.169±0.013模型組110.246±0.014*維酶素組110.240±0.019*△消痞顆粒組110.164±0.010△#

與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01；與維酶素組比較，#P<0.01

1為空白組；2為模型組；3為維酶素組；4為消痞顆粒組

由表1、圖1可見，維酶素組、模型組DNMT3b蛋白表達量較空白組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；消痞顆粒組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。維酶素組、消痞顆粒組DNMT3b蛋白表達量較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；消痞顆粒組低于維酶素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因異常的累積過程，其中抑癌基因CpG島高甲基化是重要致病因素之一,在其發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5-6]。DNA甲基化是由DNMT催化完成的，DNMT是參與DNA甲基化修飾的重要功能蛋白，其作用是在S-腺苷酰-L-甲硫氨酸提供甲基的條件下，催化DNA分子胞嘧啶5號碳原子結(jié)合上甲基團，形成5-甲基胞嘧啶,生成甲基化DNA[7]。一般認為哺乳動物的DNMT有4種，DNMT1在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化，DNMT3則催化CpG從頭甲基化，DNMT3包括2個從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a、DNMT3b和1個調(diào)節(jié)蛋白DNMT3L；另有一種為DNMT2，主要為tRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶，具有微弱的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性[7]。大量研究表明，DNMT3b高表達與乳腺癌、肝癌、白血病等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-10]。在最近幾年關(guān)于胃癌的成因研究當中，抑癌基因的甲基化研究一直較為火熱，最新的研究進展表明，在不同的基因啟動區(qū)中，DNMT3b異常表達與甲基化之間都存在著較大的聯(lián)系[11-12]。

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)學(xué)痞滿、痞證范疇，本虛標實貫穿于本病的始終，本虛為脾胃氣虛和(或)陰虛，標實為瘀血邪毒。邪毒有廣義和狹義的概念，廣義邪毒是指痰濕、濕熱、熱毒、食積、氣滯等，狹義邪毒僅指熱毒。以益氣化瘀解毒法組方而成的消痞顆粒，方中黨參補中益氣，生津和胃，為君藥；百合養(yǎng)陰潤肺，止咳祛痰，清心安神，為臣藥；烏藥宣暢氣機，溫散寒邪，行氣止痛；香櫞理氣寬中，和胃化濕；丹參活血，血脈流暢，通則不痛，為治胃病的良藥；三七化瘀止血，活血定痛；莪術(shù)行氣破血，消積止痛；蒲公英清熱解毒，消癰散結(jié)；白花蛇舌草清熱利濕，解毒抗癌?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參具有增強機體免疫功能，提高巨噬細胞吞噬功能的作用[13]；丹參可促進胃黏膜的修復(fù)再生，從而使異型增生減輕或消失[14]；三七具有改善微循環(huán)、消炎及預(yù)防腫瘤等作用[15-16]；莪術(shù)可誘發(fā)或促進機體對腫瘤的免疫排斥反應(yīng)[17]；白花蛇舌草能夠調(diào)節(jié)免疫，增強腎上腺皮質(zhì)功能，從而起到抑制炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的作用，因此具有明顯的抗菌消炎、抗腫瘤作用[18]。

本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠DNMT3b蛋白相對于空白組明顯升高，充分說明DNMT3b的高表達明顯存在于異型增生胃黏膜組織當中。本研究結(jié)果還顯示以益氣化瘀解毒法組方的消痞顆?？上抡{(diào)DNMT3b的表達，這種作用與模型組和維酶素組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明消痞顆粒可有效下調(diào)DNMT3b蛋白的表達。綜上所述，以益氣化瘀解毒法組方的消痞顆粒逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎伴胃黏膜異型增生可能的作用機制為下調(diào)DNMT3b的表達。

[1] 陳萬青,張思維,曾紅梅,等.中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤,2014,23(1):1-10.

[2] 羅欣,謝文練,韓金利,等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3b基因在膀胱癌的表達及意義[J].中華實驗外科雜志,2008,25(9):1220.

[3] Esteller M. Relevance of DNA methylation in the management of cancer[J].Lancet Oncol,2003,4(6):351-358.

[4] Yu Y,Khan J,Khanna C,et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators[J].Nat Med,2004,10(2):175-181.

[5] Choi IS,Tsung-Teh WU.Epigenetic alterations in gastric carcinogenesis[J].Cell Res, 2005,15(4):247-254.

[6] Tamura G.Promoter methylation status of tumor suppressor and tumor-related genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia[J].Histol Histopathol,2004,19(1):221-228.

[7] Cheng X,Blumenthal RM.Mammalian DNA Methyltransferases: A Structural Perspective[J].Structure，2008，16(3):341-350.

[8] 王勇,王曉東,陳文捷，等.散發(fā)性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表達與ERα基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達的關(guān)系[J].天津醫(yī)藥,2015,43(5):500-504.

[9] 李英華，劉學(xué)東，郭秀芬，等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在慢性髓系白血病患者的表達及臨床意義[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2015,23(6):1547-1550.

[10] 馮悅靜，魏小玲，尤愛國，等.肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2014,49(3):323-326.

[11] Ding WJ,Fang JY,Chen XY,et al.The expression and clinical significance of DNA methyltransferase proteins in human gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2008,53(8):2083-2089.

[12] 葉振,劉文天.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在胃癌和癌前病變中的表達及意義[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010，31(5):351-354.

[13] 焦紅軍.黨參的藥理作用及其臨床應(yīng)用[J].臨床醫(yī)學(xué),2005,25(4):92.

[14] 吳時勝.丹參對萎縮性胃炎伴異型增生的逆轉(zhuǎn)治療研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2002,13(12):751-752.

[15] 張會存,史瑞,李健,等.黃芪、三七對萎縮性胃炎大鼠胃黏膜HSP70及其轉(zhuǎn)錄因子GAF表達的影響[J].世界華人消化雜志,2013,21(7):559-566.

[16] 馬玲玲,周正華.周正華運用蒲公英治療消化系統(tǒng)疾病臨證經(jīng)驗[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(6):510-511.

[17] 鐘鋒,顧健,張亮亮,等.莪術(shù)藥理作用的現(xiàn)代研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志,2010,19(13):67-68.

[18] 趙林林.白花蛇舌草化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J].河南中醫(yī),2012,32(10):1372-1374.

(本文編輯：李珊珊)

Effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNMT3b gene in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia

HEMeijuan*,YANGRuobin,YANGJinxiang,etal.

*DepartmentofTraditionalChineseMedicine,LugouqiaoCommunityHealthServiceCenterofFengtaiDistrictinBeijingCity,Beijing100165

Objective To observe the clinical effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNA methylationase 3b (DNMT3b) in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia. Methods 60 SPF healthy male Wistar rats were randomly divided into modeling group (n=50) and blank group (n=10). After successful modeling, the remaining rats (n=33) in modeling group were randomly divided into model group, vitacoenzyme group, Xiaopi granule group, 11 rats in each group. The model group was treated by 0.9% sodium chloride injection, the vitacoenzyme group was treated by vitacoenzyme suspensions and the Xiaopi granule group was treated by Xiaotuqi granule liquid. The rats in each group were intragastric administration one time per day for 12 weeks, and then the protein expression of DNMT3b was measured. Results The protein expressions of DNMT3b in vitacoenzyme and model group were significantly higher than that in blank group (P<0.01), and there was no significant difference between the Xiaopi granule group and the blank group (P>0.05). The protein expression of DNMT3b in vitacoenzyme group and Xiaopi granule group was obvious decreased as compared with that in model group (P<0.01), which in Xiaopi granule group was lower than that in vitacoenzyme group (P<0.01). Conclusion Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy can reverse the dysplasia of gastric mucosa, its mechanism may be achieved by down-regulation of DNMT3b.

Qi-tonifying and blood stasis-removing; Detoxification；Gastritis; Atrophic; Dysplasia; Rat; Wistar; Gene; Animal experiment

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.024

※ 項目來源：國家自然科學(xué)基金項目(編號：81173232)

賀梅娟(1980—)，女，主治醫(yī)師，博士。研究方向：脾胃病中醫(yī)藥防治。

R573.32；R9-33

A

1002-2619(2017)03-0411-04

2016-07-25)

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院消化科，北京 100029