丁 怡， 盧新剛， 孫書焰， 戴 俊

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032 2.復旦大學附屬華東醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200040 3.上海市閔行區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)科，上海 201103 4.復旦大學附屬華東醫(yī)院藥劑科，上海 200040

·論 著·

Toonaciliatin A在體內外抑制胃癌MKN45細胞增殖并誘導細胞凋亡

丁 怡1， 盧新剛2， 孫書焰3， 戴 俊4*

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032 2.復旦大學附屬華東醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200040 3.上海市閔行區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)科，上海 201103 4.復旦大學附屬華東醫(yī)院藥劑科，上海 200040

目的： 探討中藥單體Toonaciliatin A體內外對人胃癌MKN45細胞增殖和凋亡的影響。方法： 體外培養(yǎng)MKN45細胞，采用不同質量濃度的Toonaciliatin A (15、30、60 μg/mL) 分別處理48 h，MTT法檢測細胞增殖活性；Annexin V-FITC/PI法染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。建立人胃癌MKN45細胞的BALB/c裸鼠移植瘤模型，采用不同劑量的Toonaciliatin A(10、20、40 mg/kg)給藥21 d，檢測移植瘤質量及裸鼠體質量；免疫組織化學法檢測各組移植瘤組織中caspase-3蛋白的表達水平。結果： Toonaciliatin A體外可有效抑制MKN45細胞增殖，并誘導MKN45細胞凋亡，藥物處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比，Toonaciliatin A給藥組移植瘤質量明顯降低(P<0.05)。Toonaciliatin A體內可誘導移植瘤組織中caspase-3蛋白表達增加(P<0.05)。結論： Toonaciliatin A體內外能有效抑制胃癌MKN45細胞增殖并誘導細胞凋亡。

胃腫瘤；抗腫瘤藥，植物；檸檬苦素類；異種移植模型抗腫瘤試驗；Toonaciliatin A

近年來，隨著腫瘤發(fā)病率的逐年提高，惡性腫瘤逐漸成為全球主要的致死因素[1]。胃癌是我國人群主要的惡性腫瘤之一[2-3]，其發(fā)病與地域、飲食習慣及人種等均有較大關聯(lián)[4]。胃癌的預后與其病理分期、部位、組織學類型、生物學行為以及治療措施有關。因此，臨床急需研發(fā)療效好且安全的抗腫瘤新藥。Toonaciliatin A是從思茅紅椿(ToonaciliataRoem.var.henryi)中提取的檸檬苦素類似物[5-6]。本研究觀察Toonaciliatin A對人胃癌MKN45細胞在體內外生長的抑制作用，分析其誘導腫瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖的可能機制，探討其用作胃癌抗腫瘤藥物的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和澳洲胎牛血清均購于美國Gibco公司。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]購自美國Sigma公司。1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液和二甲基亞砜(dimethylsulphoxide，DMSO)購于上海碧云天生物技術有限公司。Toonaciliatin A標準品(純度大于98%，批號為20120356)由上海詩丹德生物技術有限公司提供。在體外實驗中，將Toonaciliatin A標準品溶解于DMSO中，配制成所需要的給藥濃度，并保證DMSO在培養(yǎng)液中的體積占比不超過千分之一。在體內實驗中，將Toonaciliatin A標準品溶解于含5% DMSO的0.9%氯化鈉溶液中，并達到所需要的給藥濃度。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱為Heal Force公司產品。倒置顯微鏡(CK40)為日本Olympus公司產品。酶標儀(Star Fax-2100)購自美國Awareness公司。流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗動物 SPF級8周齡BALB/c裸鼠，體質量為(20±1) g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。所有裸鼠均由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心在SPF級實驗室飼養(yǎng)，光暗周期為12 h∶12 h，保證24 h通風換氣，并且用無菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)，溫度保持在20～26℃，濕度穩(wěn)定在40%～70%。

1.3 細胞來源及培養(yǎng)條件 MKN45細胞購于中國科學院上海細胞庫。用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MKN45細胞；每3 d更換培養(yǎng)液1次。

1.4 MTT法檢測體外細胞活性 將混勻的MKN45細胞懸液接種于96孔板上，每組設6個復孔。待細胞生長至合適融合度時，加入Toonaciliatin A并使藥物最終質量濃度分別為15、30、60 μg/mL，培養(yǎng)48 h。分別于加藥處理12、24、48 h時，每孔加入5 μL(5 mg/mL)的MTT溶液，反應4 h后棄去培養(yǎng)液，并加入150 μL DMSO，振蕩溶解，酶標儀雙波長法測量光密度(D)值，波長設定為570、630 nm。細胞存活率(%)=實驗組D值/空白組D值×100%。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測體外細胞凋亡 將混勻的MKN45細胞懸液接種于24孔板上，每組設3個復孔。待細胞長至合適融合度時，加入Toonaciliatin A并使其最終質量濃度分別為15、30、60 μg/mL，培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化細胞，用含血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打成細胞懸液。按照AnnexinⅤ-FITC/PI檢測試劑盒說明書操作，最后上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.6 MKN45細胞移植瘤模型的建立及給藥 選對數(shù)生長期的人胃癌MKN45細胞，制備成細胞懸液。將密度為5×106/mL的細胞懸液(200 μL)注射于BALB/c裸鼠右側腹腔皮下，建立裸鼠移植瘤模型。待腫瘤生長到體積約100 mm3后，隨機分組，設溶媒對照組和不同劑量(10、20、40 mg/kg)的Toonaciliatin A組(n=6)。Toonaciliatin A組采用腹腔注射的方法給予上述3個劑量的Toonaciliatin A治療，溶媒對照組則給予同等劑量的含5% DMSO的0.9%氯化鈉溶液。共給藥21 d，記錄裸鼠開始和最終的體質量。給藥21 d后，頸椎脫離法犧牲裸鼠，取出移植瘤，電子天平稱取瘤體質量，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤體質量/陰性對照組平均瘤體質量)×100%。

1.7 免疫組織化學法檢測caspase-3表達水平 將末次給藥的MKN45細胞裸鼠移植瘤樣本取出，10%甲醛固定液固定，石蠟包埋，層厚5 μm切片。加入caspase-3一抗(Abcam, 體積稀釋比例為1∶500)反應過夜，再加入對應二抗，光學顯微鏡下觀察caspase-3的免疫染色結果。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用中效直線回歸法計算細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。多組間數(shù)據(jù)分析采用方差分析法。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 Toonaciliatin A體外對胃癌細胞增殖的抑制效率 MTT法檢測結果(圖1)顯示：不同質量濃度的Toonaciliatin A作用不同時間后，胃癌MKN45細胞增殖活性均被明顯抑制，且該抑制作用呈時間和濃度依賴性(P<0.05)。Toonaciliatin A對MKN45細胞株的IC50為(32.56±6.25) μg/mL。

2.2 Toonaciliatin A體外誘導胃癌細胞凋亡 結果(圖2)顯示：對照組MKN45細胞的凋亡率在10%以下，細胞生長良好；而15、30、60 μg/mL Toonaciliatin A處理48 h后，MKN45細胞凋亡率分別為14.49%、32.70%、54.47%。與溶媒對照組相比，低、中、高3個劑量的Toonaciliatin A組細胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 MTT法檢測Toonaciliation A作用后胃癌MKN45細胞存活率

圖2 流式細胞儀檢測Toonaciliation A作用后胃癌MKN45細胞凋亡率

2.3 Toonaciliatin A給藥抑制裸鼠體內移植瘤的生長 結果(表1)顯示：隨著Toonaciliatin A給藥劑量的升高，裸鼠體內抑瘤率也逐漸增高。與溶媒對照組相比，低、中、高3個劑量的Toonaciliatin A組移植瘤體質量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，4組荷瘤裸鼠在給藥21 d內均無中毒和死亡現(xiàn)象發(fā)生，各組裸鼠體質量在Toonaciliatin A治療前后與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

表1 Toonaciliatin A給藥對裸鼠體內MKN45移植瘤生長的影響

*P< 0.05，**P<0.01與溶媒對照組相比

2.4 Toonaciliatin A給藥后裸鼠體內移植瘤組織中caspase-3水平上調 免疫組織化學法檢測結果顯示，10、20、40 mg/kg Toonaciliatin A給藥治療后，裸鼠體內移植瘤組織中caspase-3蛋白表達水平均明顯升高(圖3)。結果證實，Toonaciliatin A可通過誘導細胞凋亡來抑制裸鼠體內胃癌MKN45細胞移植瘤的生長。

圖3 Toonaciliatin A給藥后裸鼠體內移植瘤組織caspase-3蛋白表達水平的變化

3 討 論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是多種生物因素導致的細胞過度增殖和(或)細胞凋亡被抑制的結果[7]。細胞凋亡被認為是抗癌藥物研究和開發(fā)的最有效靶點之一，因此，通過藥物或其他手段誘導細胞凋亡來治療癌癥是目前腫瘤學研究的重點[8]。在抗癌新藥研發(fā)的進程中，植物化學物質已成為最豐富的新藥來源[9]。植物提供了廣泛且多樣性的用于腫瘤治療的化學結構[10]。人們正在不斷探索從植物天然物質中發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物，而現(xiàn)代技術促進了天然來源的新化合物的篩選進程，并使單體篩選成為一種有效方法[11]。

細胞凋亡是藥物抑制細胞增殖的主要途徑之一。Caspase-3作為細胞凋亡中最關鍵的一種酶，其活化將引起細胞發(fā)生不可逆性凋亡，是細胞凋亡的執(zhí)行者[11]。本實驗中，Toonaciliatin A可以有效提高動物體內移植瘤組織中caspase-3的表達水平，提示Toonaciliatin A可通過上調caspase-3的表達，誘導細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究初步證實Toonaciliatin A在體內外具有抑制胃癌MKN45細胞增殖的作用。然而，藥物的體內給藥是否能達到其在體外發(fā)揮作用的活性劑量，這是藥物是否具備臨床應用前景的關鍵。因此，Toonaciliatin A的藥代動力學數(shù)據(jù)是今后研究的方向之一。

綜上所述，Tonaciliatin A可以在體外抑制人胃癌MKN45細胞增殖，且誘導MKN45細胞凋亡；同時，體內實驗結果證實，Toonaciliatin A可以有效抑制人胃癌細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，而且該抑瘤效應的分子機制可能與上調caspase-3表達及誘導人胃癌細胞凋亡相關。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)21 d的Toonaciliatin A給藥并未對裸鼠的體質量產生影響，且裸鼠無中毒和死亡等情況發(fā)生。因此，本研究為臨床應用Toonaciliatin A治療胃癌及其他惡性腫瘤提供了一定的實驗依據(jù)。

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[本文編輯] 葉 婷， 張藝鳴

Toonaciliatin A inhibits proliferation and induces apoptosis of gastric cancer MKN45 cellsinvitroandinvivo

DING Yi1, LU Xin-gang2, SUN Shu-yan3, DAI Jun4*

1.Department of Pharmacy, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Traditional Chinese Medicine, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China 3.Department of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Minhang District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201103, China 4.Department of Pharmacy, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

Objective： To investigate the effects of traditional Chinese medicine monomer Toonaciliatin A on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line MKN45invitroandinvivo.Methods： MKN45 cells were culturedinvitroand treated with Toonaciliatin A (15, 30, and 60 μg/mL) for 48 h.Then the cell viability was measured by MTT assay.The apoptosis were determined by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI assay.The BALB/c nude mouse xenograft model of MKN45 cells was established and administrated with Toonaciliatin A (10, 20, and 40 mg/kg) for 21 days, then the weights of xenograft tumors and mouse were calculated, and the expression of caspase-3 protein in tumor tissues was detected by immunohistochemical method.Results： As compared with the control group, Toonaciliatin A inhibited effectively the proliferation of MKN45 cells, and induced apoptosis of MKN45 cellsinvitro(P<0.05).In the nude mouse xenograft model of MKN45 cells, the tumor weight of Toonaciliatin A treatment group was significantly decreased as compared with that of the control group (P<0.05).Toonaciliatin A induced the expression of caspase-3 proteininvivo(P<0.05).Conclusions： Toonaciliatin A is an effective anti-tumor Chinese medicine monomer.

stomach neoplasms; antineoplastic, phytogenic; limonins; xenograft model antitumor assays; Toonaciliatin A

2016-08-13 [接受日期] 2016-11-21

上海市科學技術委員會課題(13401907000).Supported by Foundation of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (13401907000).

丁 怡，藥師.E-mail: 715053877@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-62483180-80511, E-mail: xiaoxiaojack323@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160913

R 735.2; R979.19

A