韓曉偉，馮紅，馮建明，嚴(yán)玉平，張丹，鄭開顏，鄭玉光

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.安國(guó)數(shù)字本草檢驗(yàn)中心有限公司，河北 安國(guó) 071200

干旱脅迫對(duì)柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及柴胡皂苷含量的影響

韓曉偉1，馮紅2，馮建明1，嚴(yán)玉平1，張丹1，鄭開顏1，鄭玉光1

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.安國(guó)數(shù)字本草檢驗(yàn)中心有限公司，河北 安國(guó) 071200

目的 研究干旱脅迫對(duì)柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及皂苷含量的影響，從蛋白水平揭示柴胡對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。方法 通過盆栽控水試驗(yàn)，設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個(gè)水平栽培柴胡。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)6個(gè)月和1年生柴胡根中4種柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和β-香樹素合成酶（β-AS）的活性，采用HPLC檢測(cè)不同土壤飽和含水量情況下樣品中柴胡皂苷a、d的含量。結(jié)果 柴胡苗在飽和含水量40%～50%時(shí)4種酶的活性最高，在飽和含水量60%～70%、70%～80%時(shí)次之，在飽和含水量20%～30%時(shí)最低，柴胡皂苷a、d含量變化與酶活性變化趨勢(shì)相似。結(jié)論 40%～50%土壤飽和含水量能顯著提高柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性，且柴胡皂苷含量與酶活性之間呈顯著正相關(guān)，說明在干旱脅迫下，柴胡通過調(diào)節(jié)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性來調(diào)節(jié)柴胡皂苷的合成，對(duì)干旱脅迫作出響應(yīng)。

干旱脅迫；柴胡；酶活性；柴胡皂苷

柴胡Bupleurum chinense DC.為傘形科柴胡屬植物，是《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的藥用柴胡主要來源之一[1]。柴胡所含的主要有效成分柴胡皂苷是一種齊墩果烷類型的三萜皂苷，主要為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。柴胡皂苷屬于次生代謝產(chǎn)物，是柴胡抵御脅迫的產(chǎn)物，也是主要的藥效成分[2-3]。柴胡皂苷合成的途徑主要由3部分組成[4]，首先合成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸（FPP），在此基礎(chǔ)上合成2,3-角鯊烯氧化物環(huán)化合成齊墩果烷型或達(dá)瑪烷型三萜骨架，最后是三萜類骨架在細(xì)胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等酶的修飾下形成皂苷[5-6]。在上述過程中，HMG-CoA還原酶（HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸（MVA），MVA在MVA激酶、磷酸MVA激酶和脫羧酶的作用下形成IPP，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）催化IPP和DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，法呢基焦磷酸合酶（FPS）催化FPP的形成，β香樹脂合成酶（β-AS）催化形成β-香樹素[7]，這些酶均為柴胡皂苷合成途徑中關(guān)鍵的限速酶。

干旱是影響植物生長(zhǎng)、生存和分布的重要環(huán)境因子之一。柴胡主要分布在我國(guó)干旱和半干旱地區(qū)，目前，隨著全球暖干化，干旱脅迫普遍存在，而且呈現(xiàn)出加劇的趨勢(shì)，因此，研究柴胡對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理就顯得尤為重要。黃璐琦等[8]研究逆境脅迫對(duì)藥材的作用后提出了道地藥材形成的逆境效應(yīng)理論，即藥用植物在適度的逆境下可以提高其藥效成分的積累。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)柴胡的研究主要集中在柴胡的藥理作用[9]、真?zhèn)舞b定[10-15]和栽培[16]等方面，而對(duì)柴胡干旱脅迫下的分子響應(yīng)機(jī)制研究較少，因此，本研究通過設(shè)置土壤的含水量人為模擬干旱條件，探討干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響，從而為進(jìn)一步研究干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷積累的影響奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

GL-20G-II型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；EPOCH酶標(biāo)儀購自美國(guó)伯騰儀器公司；Eppendorf移液槍；MGC-P型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；賽默飛OMS100烘箱；沃特世2695高效液相色譜系統(tǒng)。

植物HMGR、β-AS、FPS和IPPI酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號(hào)均為201512），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)110777-201510）、柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)110778-201510），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，氨水、甲醇為分析純。

6個(gè)月和1年生柴胡幼苗，河北省邯鄲市涉縣農(nóng)牧局提供，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為北柴胡Bupleurum chinese DC.。

2 方法

2.1 植物材料的處理

選取生長(zhǎng)良好整齊的柴胡苗，移栽到花盆中，花盆口徑29 cm、底徑19 cm、高20 cm、質(zhì)量295 g，每個(gè)花盆下有一塑料托盤。土壤為沙壤土、營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按1∶1∶1混合均勻。6個(gè)月和1年生柴胡幼苗分別于2015年12月和2016年5月移栽于盆中，每盆4穴，每穴2株。移栽后正常澆水，生長(zhǎng)1個(gè)月后，選取正常生長(zhǎng)、一致的幼苗作為供試材料。

采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個(gè)水平，采用稱重法進(jìn)行水分控制。控水期間每日17:00稱取盆重，補(bǔ)充失去的水分，使各處理保持設(shè)定的相對(duì)含水量。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，控水處理1個(gè)月后采集樣品測(cè)定各指標(biāo)。

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)4種酶活性

2.2.1 原理及方法 采用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中HMGR、IPPI、FPS和β-AS的酶活性。以FPS為例，用純化的植物FPS抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入植物FPS，再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的FPS抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色深淺與樣品中的植物FPS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物FPS活性。HMGR、IPPI和β-AS活性測(cè)定方法與FPS相同。

2.2.2 粗酶的提取 將柴胡種苗從土壤中取出，用水沖洗數(shù)遍去除泥沙，再用吸水紙吸干多余水分，并去除莖葉部分，用電子天平準(zhǔn)確稱量每棵柴胡種苗根部的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比1∶18加入0.01 mol/L PBS（pH 7.15），冰浴研磨成勻漿，放置冰箱浸提2 h，4℃、10 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清，重復(fù)上述步驟，離心后取上清。

2.2.3 酶活性測(cè)定 將試劑盒提供的原倍標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為60、30、15、7.5、3.75 IU/L。加樣：分別設(shè)空白孔（不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)孔準(zhǔn)確加樣50μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，再加待測(cè)樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。溫育（同上）。洗滌（同上）。顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。終止：每孔加終止液50μL（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔OD值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

2.3 HPLC測(cè)定柴胡皂苷a、d含量

皂苷含量測(cè)定條件參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，方法參照張宇等[4]步驟進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 干旱對(duì)柴胡皂苷a、d含量的影響

不同土壤飽和含水量處理的6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量見圖1。在干旱脅迫下，土壤飽和含水量為40%～50%時(shí)，6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量最高，土壤飽和含水量為60%～80%時(shí)次之，土壤飽和含水量為20%～30%時(shí)最低。說明適度干旱脅迫可以使柴胡皂苷a、d的積累量增加。

圖1 干旱脅迫對(duì)6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量的影響

3.2 干旱對(duì)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響

3.2.1 酶活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 6月齡和1年生柴胡苗的FPS、β-AS、HMGR和IPPI酶活性檢測(cè)具有不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均為0.99左右，說明后續(xù)結(jié)果可信。

表1 6月齡和1年生柴胡苗中4種酶活性檢測(cè)回歸方程

3.2.2 酶活性測(cè)定結(jié)果 6月齡柴胡苗β-AS的酶活性最高，達(dá)到20 000 IU/g左右；IPPI的酶活性較低，只有250 IU/g左右。在干旱處理?xiàng)l件下，40%～50%土壤飽和含水量使FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性達(dá)到最高，而土壤飽和含水量在70%～80%與60%～70%的情況下FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性相差不大，而當(dāng)土壤飽和含水量降到20%～30%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性明顯降低。結(jié)果見圖2。

1年生柴胡苗在干旱脅迫條件下，土壤飽和含水量40%～50%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較高，而土壤飽和含水量70%～80%與60%～70%的情況下酶活性相差不大，土壤飽和含水量20%～30%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較低。結(jié)果見圖3。

以上結(jié)果說明柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性在適度干旱條件下較高，水分過多或過少都會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生不良的影響。

3.3 柴胡皂苷含量與酶活性的相關(guān)性

采用SPSS19.0軟件分析不同處理下柴胡皂苷含量與HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性的相關(guān)性，結(jié)果見表2、表3。6月齡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a、d含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01）；1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），與柴胡皂苷d的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。6月齡和1年生柴胡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性之間均呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），說明作為柴胡皂苷合成途徑的關(guān)鍵酶，每種酶的表達(dá)都與其下游酶活性相關(guān)，4種酶統(tǒng)一協(xié)調(diào)柴胡皂苷的合成過程。

圖2 干旱脅迫對(duì)6月齡柴胡苗HMGR、IPPI、FPS、β-AS酶活性的影響

圖3 干旱脅迫對(duì)1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS、β-AS酶活性的影響

表2 6月齡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與皂苷含量相關(guān)性分析

表3 1年生苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與皂苷含量相關(guān)性分析

4 討論

張宇等[4]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能使HMGR、IPPI、FPS和β-AS的基因表達(dá)量上升，而基因表達(dá)的產(chǎn)物就是酶類，但基因表達(dá)升高并不一定代表酶活性的升高，酶活性能更直接地反映干旱脅迫與柴胡皂苷之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，6月齡柴胡苗的酶活性雖然較1年生柴胡苗的酶活性低很多，但在干旱處理下其變化趨勢(shì)是一致的。6月齡柴胡苗的HMGR酶活性約為1200 IU/g，而1年生柴胡苗的HMGR酶活性達(dá)到5000 IU/g，而且，無論是6月齡苗還是1年生苗其β-AS酶活性均明顯高于另外3種酶，1年生苗的β-AS酶活性達(dá)到80 000 IU/g，較其他3種酶活性高出1個(gè)數(shù)量級(jí)。這說明隨著外界溫度的升高，柴胡皂苷的合成也在加速，另外，β-AS作為最靠近終產(chǎn)物的酶類，其活性在某種程度上代表了柴胡皂苷合成的多少。

6月齡和1年生柴胡苗對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)趨勢(shì)是一致的，在土壤飽和含水量為40%～50%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性最高，土壤飽和含水量60%～70%與土壤飽和含水量70%～80%時(shí)的4種酶活性大致相當(dāng)，土壤飽和含水量40%～50%應(yīng)該是酶活性的最適水分。但是，干旱脅迫對(duì)于酶活性的增加是有限的，當(dāng)土壤飽和含水量降至20%～30%時(shí)，酶活性迅速降低。在干旱脅迫下，柴胡皂苷含量的變化趨勢(shì)與酶活性一致，說明柴胡皂苷含量的提高需要一定的干旱期。

另外，β-AS作為最靠近皂苷生成的酶，在干旱脅迫下其活性上調(diào)最明顯，4種酶的活性呈顯著正相關(guān)，說明上游酶類影響著下游酶類的表達(dá)，呈現(xiàn)逐級(jí)遞增的趨勢(shì)，積累到一定程度，就會(huì)表現(xiàn)為柴胡皂苷含量的增加。相關(guān)性分析也表明，4種酶的表達(dá)與柴胡皂苷的含量呈極顯著的正相關(guān)。由此可知，適度的干旱脅迫能夠促進(jìn)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而影響柴胡皂苷的積累。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：280.

[2]張爭(zhēng),楊云,魏建和,等.環(huán)境因子導(dǎo)致的植物防御反應(yīng)與藥用次生代謝物的合成和積累[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(9)：919-924.

[3]RAMAKRISHNA A,RAVISHANKAR G A.Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants[J].Plant Signal Behav,2011,6(11)：1720-1731.

[4]張宇,周自云,夏鵬國(guó),等.干旱脅迫對(duì)柴胡中皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)及皂苷含量的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(4)：643-647.

[5]ASHOUR ML,WINK M. Genus Bupleurum：a reviewofits phytochemistry,pharmacology and modes of action[J].J Pharm Pharmacol,2011,63(3)：305-321.

[6]LIN T Y,CHIOU C Y,CHIOU S J.Putative genes involved in saikosaponin biosynthesis in Bupleurum species[J].Int J Mol Sci, 2013,14(6)：12806-12826.

[7]董樂萌.北柴胡柴胡皂苷合成相關(guān)基因的分子克隆與組織表達(dá)分析[M].北京：北京林業(yè)大學(xué),2008.

[8]黃璐琦,郭蘭萍.環(huán)境脅迫下次生代謝產(chǎn)物的積累及道地藥材的形成[J].中國(guó)中藥雜志,2007,32(4)：277-280.

[9]LAW B Y,MO J F,WONG V K.Autophagic effects ofChaihu(dried roots ofBupleurum ChinenseDC orBupleurum scorzoneraefolium WILD)[J].Chin Med,2014,9：21.

[10]NEVES S S,WATSON M F.Phylogenetic relationships in Bupleurum (apiaceae)based on nuclear ribosomal DNA its sequence data[J]. Ann Bot,2004,93(4)：379-398.

[11]周琳,遲瑩,張麗華,等.柴胡與4種偽品的DNA指紋研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2013,14(1)：46-49.

[12]遲瑩,周琳,張麗華,等.柴胡及其常見偽品的DNA指紋鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(15)：143-146.

[13]于俊林,趙莎,任明波,等.基于ITS2條形碼鑒定柴胡與大葉柴胡[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(12)：2160-2163.

[14]袁伯川,馬永生,楊瑞,等.北柴胡與銀州柴胡的ITS條形碼鑒定研究[J].生物技術(shù)通訊,2016,27(1)：101-105.

[15]韓曉偉,嚴(yán)玉平,吳蘭芳,等.柴胡及其偽品的DNA條形碼鑒定研究[J].中草藥,2016,47(9)：1583-1588.

[16]翟樹林,李元富,李華斌,等.北柴胡人工栽培技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,44(3)：151-152.

Effects of Drought Stress on Activity of Key Enzyme in Saikosaponin Biosynthesis Passway and Saponins Content in Bupleurum chinense

HAN Xiao-wei1,FENG Hong2,FENG Jian-ming1, YAN Yu-ping1,ZHANG Dan1,ZHENG Kai-yan1,ZHENG Yu-guang1
(1.Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200,China;2.Anguo Digital Materia Medica Testing Center Co.,LTD.,Anguo 071200,China)

Objective To research the effects of drought stress on activity of key enzyme in saikosaponin biosynthesis and saponins content in Bupleurum chinense;To reveal response of Bupleurum chinense to drought stress from protein level.Methods Bupleurum chinense was cultivated in potted water control experiment with 70%–80%,60%–70%, 40%–50%and 20%–30%saturated soil water contents.The enzyme activities of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase(HMGR),isoprenyl-based coke(IPPI),farnesyl pyrophosphate synthase(FPS)and β-carotenoid synthase(β-AS) of six months and one year old Bupleurum chinense were measured.The contents of saikosaponins a and d in samples of different soil water contents were determined by HPLC.Results When the saturated moisture was 40%–50%,the enzymatic activities of HMGR,IPPI,FPS and β-AS were the highest,followed by saturated moisture 60%–70%、70%–80%and 20%–30%.The trend of saikosaponin was similar to that of the activity of key enzyme.Conclusion 40%–50%soil saturated water content can significantly increase the activity of the key enzymes in the saikosaponin synthesis pathway.The saponin content and enzyme activity show a significant positive correlation,indicating that under drought stress,Bupleurum chinense regulates the synthesis of saikosaponin by regulating the key enzyme activity of saikosaponin synthesis pathway to respond drought stress.

drought stress;Bupleurum chinense;activity of enzyme;saikosaponin

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.017

R284.1

：A

：1005-5304(2017)05-0071-05

2016-10-20）

（

2017-01-04；編輯：陳靜）

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2015073）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2015081）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系中藥材創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（7000120081）；河北中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（7002016012019）

鄭玉光，E-mail：zyg314@163.com