王雅芝，王曉寧，張 艷，段燦燦，張建永

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

柴胡為傳統(tǒng)中藥，《中國藥典》2020年版規(guī)定其為傘形科植物柴胡(北柴胡)BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡(南柴胡)Bupleurumscorzonerifoliumwilld.的干燥根，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效[1]。研究發(fā)現(xiàn)，柴胡中主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油及多糖等化學(xué)成分[2-3]，其中，柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分群，是柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的主要指標(biāo)性成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，柴胡及柴胡皂苷類成分具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2-3,5]。目前現(xiàn)有含柴胡的成方制劑549個(gè)[6]，如小柴胡顆粒、柴胡舒肝丸、小柴胡泡騰片等[7]，這些成方制劑的主要給藥方式為口服，探索其成分在體內(nèi)的吸收情況，對(duì)于揭示柴胡皂苷類成分發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)很有必要。

腸道是口服藥物的主要吸收部位，有文獻(xiàn)報(bào)道柴胡皂苷在酸堿環(huán)境、腸道菌群代謝等條件下極易水解，造成其生物利用度較低[8-11]。由此推測，柴胡皂苷類成分發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分可能為原型化合物和腸道代謝產(chǎn)物。因此，本實(shí)驗(yàn)以柴胡總皂苷提取物為研究對(duì)象，運(yùn)用UPLC-MS/MS技術(shù)，通過比較大鼠腸吸收成分、腸代謝的入血成分和肝代謝的血中成分的化學(xué)成分特征譜，分析其體內(nèi)發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分，為深入研究柴胡的藥效物質(zhì)提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo QE Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀；Thermo UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；離體腸灌流裝置、數(shù)控恒溫循環(huán)水槽(上海奧爾科特生物科技有限公司)；超聲儀(昆山舒美超聲儀器有限公司)；高速離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；多管渦旋振蕩器(上海凈心實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；電子天平(波蘭 RADWAG 公司)；混合氧氣瓶(貴州望江氣體有限公司)。

1.2 藥材和試劑 柴胡藥材由山西振東道地藥材公司提供，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為傘形科植物柴胡(北柴胡)BupleurumchinenseDC.的干燥根，晾干后粉碎，保存于陰涼干燥處。

乙腈(色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司)；甲醇(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；甲酸(LC/MS，美國Fisher scientific公司)；水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠15只，雄性，體重(230±20)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證編號(hào)為SCXK(遼)2020-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證編號(hào)為SYXK(黔)2021-0004，自由飲食，光照12 h明暗交替，相對(duì)濕度45%～55%，室溫21～25 ℃。按照遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例，并經(jīng)過遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，審批編號(hào)為ZMU21-2206-007。

1.4 UPLC-MS/MS分析條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：50 ℃；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相A：水(含6.5 mM碳酸氫銨)；流動(dòng)相B：95%甲醇水(含6.5 mM碳酸氫銨)；梯度洗脫程序：(0～1 min，5% B；1～18 min，5%～100% B；18.1～22 min，100% B；22.1～25 min，5% B)。

1.4.2 質(zhì)譜條件 應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-QE-Orbitrap HRMS)，采用加熱電噴霧離子源(HESI)，在Negative模式下，采用一級(jí)全掃描+DDA二級(jí)子離子掃描。噴霧電壓：-3.0 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；輔助器加熱溫度：350 ℃；護(hù)套氣體流量：35 Arb；輔助氣體流量：8 Arb；S-透鏡射頻水平：50；分辨率：17500。

1.4.3 Tyrode液的配制 稱取氯化鈉(NaCl)8.0 g、氯化鉀(KCl)0.2 g、氯化鎂(MgCl2)0.1 g、碳酸氫鈉(NaHCO3)1.0 g、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.05 g加500 mL蒸餾水溶解，氯化鈣(CaCl2)0.2 g加500 mL蒸餾水溶解后混勻，再加入葡萄糖1.0 g即得。

1.4.4 柴胡總皂苷提取液的制備 參照文獻(xiàn)中柴胡總皂苷的制備方法[12]，稱取北柴胡藥材100 g，粉碎后加入8倍量80%乙醇浸泡1 h，回流提取3次，每次提取2 h，合并提取液，濾過，回收乙醇至無醇味，加水分散，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，真空干燥箱中60 ℃烘干，即得柴胡總皂苷提取物。

柴胡總皂苷Tyrode液的制備：精密稱取柴胡總皂苷提取物適量，加Tyrode液配得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 g/mL的藥液(按柴胡生藥量計(jì))，備用。

柴胡總皂苷灌胃液的制備：精密稱取柴胡總皂苷提取物適量，用0.1%羧甲基纖維素鈉水超聲溶解制得灌胃液，其質(zhì)量濃度為8 g/mL(按生藥量計(jì))，備用。

1.5 樣品的采集

1.5.1 血漿樣品的采集 取健康的9只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組(空白組，肝門靜脈取血組，腹主動(dòng)脈取血組)，每組3只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，禁食12 h，以200 mg/kg的劑量大鼠灌胃柴胡總皂苷灌胃液，期間自由飲水。在給藥0.5 h時(shí)，分別在肝門靜脈、腹主動(dòng)脈取血，置于含0.1%肝素鈉的EP管中，于4 ℃ 824×g轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清置于干凈的EP管中，并置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?；空白血漿樣品采集同上。

1.5.2 外翻腸囊法腸吸收液的采集 取健康的6只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為2組(空白組，實(shí)驗(yàn)組)，每組3只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射20%烏拉坦，麻醉后，將大鼠背部固定，沿腹中線和腹白線剪開皮膚與肌肉，分別取十二指腸、空腸和回腸各10 cm，用彎鑷將各腸段表面附著的脂肪和腸系膜小心剝離，用0 ℃ Tyrode液沖洗腸管至無腸內(nèi)容物流出為止，小心翻轉(zhuǎn)各段腸道，使腸黏膜面向外，漿膜層向內(nèi)，用37 ℃ Tyrode緩沖液沖洗腸內(nèi)表面，用硅膠軟管小心插入翻轉(zhuǎn)后的各腸管一頭，用線將腸段與硅膠軟管扎緊，同時(shí)將腸段另一端結(jié)扎緊，讓各腸段形成囊狀。向腸囊中加入2 mL空白Tyrode液，將腸管放入盛有30 mL 37 ℃恒溫Tyrode液的麥?zhǔn)显」苤衅胶? min，然后將Tyrode液換成含藥Tyrode液，期間向試管中持續(xù)通入氧及二氧化碳的混合氣體(95% O2和5% CO2)。分別在15 、30 、60 、90 、120 min時(shí)吸取出腸囊內(nèi)液體200 μL，同時(shí)迅速補(bǔ)加同溫度同體積的空白Tyrode緩沖液[13]。樣品放入干凈的1.5 mL EP管中，-20 ℃保存待用。

1.6 樣品處理方法

1.6.1 血漿樣品的處理 冰上操作，取血漿樣品50 μL于1.5 mL的EP管中，加入200 μL 4 ℃預(yù)冷的甲醇渦旋振蕩2 min，低溫靜置10 min。在4 ℃ 20 625×g轉(zhuǎn)速離心15 min，取200 μL上清液置于新的EP管中，氮?dú)獯蹈蓾饪s后，用100 μL 20 %甲醇水復(fù)溶，直至完全溶解后，振蕩離心取上清液，進(jìn)行UPLC-MS/MS體內(nèi)成分分析?？瞻籽獫{樣品處理方法同上。

1.6.2 腸吸收液樣品的處理 取不同時(shí)間點(diǎn)各腸段內(nèi)的腸吸收液于4 ℃ 13198×g離心20 min，取上清液于-20 ℃冰箱保存，備用。

2 結(jié)果

2.1 柴胡總皂苷提取物的化學(xué)成分特征譜 如表1和圖1所示，在柴胡總皂苷提取物中共鑒定出52種柴胡皂苷類成分。主要的柴胡皂苷類成分的裂解規(guī)律分析如下。其中柴胡皂苷H或柴胡皂苷I根據(jù)其一級(jí)、二級(jí)碎片離子，在一級(jí)質(zhì)譜圖中均可見m/z 925.518 6，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 779.458 9，推測m/z 779.458 9為[M-H]-，再丟失一分子巖藻糖146 Da和一分子H2O 18 Da，推測其分別為柴胡皂苷H或柴胡皂苷I(tR=12.21或12.22)；柴胡皂苷F根據(jù)其一級(jí)、二級(jí)碎片離子，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可見m/z 927.531 2，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 781.484 3，推測m/z 781.484 3為[M-H]-，再丟失一分子巖藻糖146 Da和一分子H2O 18 Da，推測其為柴胡皂苷F(tR=12.41)；柴胡皂苷C根據(jù)其一級(jí)、二級(jí)碎片離子，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可見m/z 941.5098，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 779.4585，推測m/z 779.4585為[M-H]-，再丟失一分子巖藻糖146 Da和一分子H2O 18 Da，得到柴胡皂苷C(tR=13.84)；柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷B1根據(jù)其一級(jí)、二級(jí)碎片離子，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可見m/z 779.456 8，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 617.4005，推測m/z 617.400 5為[M-H]-，再丟失一分子巖藻糖146 Da和一分子H2O 18 Da，得到柴胡皂苷A(tR=14.06)、柴胡皂苷B2(tR=14.33)和柴胡皂苷B1(tR=15.43)；柴胡皂苷D根據(jù)其一級(jí)、二級(jí)碎片離子，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可見m/z 779.4567，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 617.4002，推測m/z 617.4002為[M-H]-，再丟失一分子巖藻糖146 Da和一分子H2O 18 Da，得到柴胡皂苷D(tR=14.60)。

2''-O-乙酰柴胡皂苷A、4''-O-乙酰柴胡皂苷A、6''-O-乙酰柴胡皂苷A、3''-O-乙酰柴胡皂苷A、2''-O-乙酰柴胡皂苷B2、2''-O-乙酰柴胡皂苷D、3''-O-乙酰柴胡皂苷D、6''-O-乙酰柴胡皂苷B2、4''-O-乙酰柴胡皂苷D、4''-O-乙酰柴胡皂苷B2、6''-O-乙酰柴胡皂苷D均呈現(xiàn)同樣的裂解規(guī)律，在一級(jí)質(zhì)譜圖中分別可見m/z 821.4689(2''-O-乙酰柴胡皂苷A、4''-O-乙酰柴胡皂苷A、6''-O-乙酰柴胡皂苷A、6''-O-乙酰柴胡皂苷B2、4''-O-乙酰柴胡皂苷D)、m/z 821.4690(3''-O-乙酰柴胡皂苷A)、m/z 821.4687(2''-O-乙酰柴胡皂苷B2、6''-O-乙酰柴胡皂苷D)、m/z 821.4688(2''-O-乙酰柴胡皂苷D)、m/z 821.4691(3''-O-乙酰柴胡皂苷D)、m/z 821.4692(4''-O-乙酰柴胡皂苷B2)，在二級(jí)質(zhì)譜圖可見m/z 779.4578(2''-O-乙酰柴胡皂苷A、4''-O-乙酰柴胡皂苷A、6''-O-乙酰柴胡皂苷A、3''-O-乙酰柴胡皂苷A、2''-O-乙酰柴胡皂苷B2、2''-O-乙酰柴胡皂苷D)、m/z 779.4588(3''-O-乙酰柴胡皂苷D、6''-O-乙酰柴胡皂苷B2、4''-O-乙酰柴胡皂苷D、4''-O-乙酰柴胡皂苷B2)、m/z 779.4573(6''-O-乙酰柴胡皂苷D)，它們均是丟失C2H2O 42 Da，再丟失C2H2O 42 Da、一分子的葡萄糖 162 Da得到617.4001，同時(shí)根據(jù)它們在色譜圖的出峰順序，推測其分別為柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷D不同部位乙?；蟮幕衔铮?''-O-乙酰柴胡皂苷A(tR=14.28)、4''-O-乙酰柴胡皂苷A(tR=14.34)、6''-O-乙酰柴胡皂苷A(tR=14.59)、3''-O-乙酰柴胡皂苷A(tR=14.60)、2''-O-乙酰柴胡皂苷B2(tR=14.70)、2''-O-乙酰柴胡皂苷D(tR=14.99)、3''-O-乙酰柴胡皂苷D(tR=15.20)、6''-O-乙酰柴胡皂苷B2(tR=15.61)、4''-O-乙酰柴胡皂苷D(tR=15.67)、4''-O-乙酰柴胡皂苷B2(tR=15.91)、6''-O-乙酰柴胡皂苷D(tR=16.10)，具體碎片離子(見表1)。

2.2 柴胡總皂苷的腸吸收代謝研究

2.2.1 離體外翻腸囊法的腸吸收成分 如圖2所示，與柴胡皂苷提取物成分譜圖比較，離體外翻腸囊法收集的腸吸收成分譜圖共有16種成分被檢出吸收。如表2所示，通過柴胡皂苷提取物(CHZG)的峰面積與腸吸收(CXS)的峰面積之比，柴胡皂苷次G、2''-O-乙酰柴胡皂苷D、柴胡皂苷B1、6''-O-乙酰柴胡皂苷D在柴胡皂苷提取物的峰面積與腸吸收的峰面積比值較大，說明這4種成分的腸吸收能力較弱；羥基柴胡皂苷F、羥基柴胡皂苷A、柴胡皂苷元A在柴胡皂苷提取物的峰面積與腸吸收的峰面積比值較小，說明這3種成分的腸吸收能力較強(qiáng)。

圖1 柴胡總皂苷提取物中柴胡皂苷類成分的LC-MS離子流質(zhì)譜

表1 柴胡總皂苷提取物中柴胡皂苷類成分的LC-MS特征譜的成分鑒定

成分1、2、3、4分別為羥基柴胡皂苷F、羥基柴胡皂苷D、Rotundioside N、乙酰羥基柴胡皂苷D；成分6、7、8、9分別為柴胡皂苷元A、柴胡皂苷H/I、柴胡皂苷F、丙二酰柴胡皂苷A；成分11、12、13、14分別為柴胡皂苷C、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡次皂苷G；成分15、16、17、18分別為柴胡皂苷E、2''-O-乙酰柴胡皂苷D、柴胡皂苷B1、6''-O-乙酰柴胡皂苷D。圖2 離體外翻腸囊法腸吸收成分的提取離子流質(zhì)譜

表2 腸吸收成分、肝門靜脈入血成分和腹主動(dòng)脈血中成分的峰面積比值

2.2.2 肝門靜脈取血的入血成分 通過比較肝門靜脈入血成分(MJM)譜圖與離體腸吸收成分譜圖，得到在腸道菌群中代謝后吸收入血成分和直接通過腸吸收入血成分之間的差異。如圖3所示，在肝門靜脈血中檢測到6種成分，分別為乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C，而乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷元C在離體腸吸收液中未檢測到，推測這3種成分可能是由原型成分柴胡皂苷E、柴胡皂苷A和柴胡皂苷C產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。通過比較肝門靜脈入血成分的峰面積與離體腸吸收成分的峰面積比值得知，柴胡皂苷元A在肝門靜脈入血成分的峰面積高于腸吸收的峰面積，柴胡皂苷A和柴胡皂苷B2在肝門靜脈入血成分的峰面積低于腸吸收的峰面積。其中肝門靜脈中柴胡皂苷元A的峰面積高于離體腸吸收峰面積，推測柴胡皂苷A可能在腸道菌群的作用下進(jìn)一步代謝產(chǎn)生柴胡皂苷元A。

成分5、6、10、12、13、19分別為乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C。圖3 肝門靜脈入血成分的提取離子流質(zhì)譜

2.3 柴胡總皂苷的肝代謝入血研究 通過比較肝門靜脈入血成分譜圖與腹主動(dòng)脈血中成分(FDM)譜圖，兩者的成分基本一致。如表2所示，進(jìn)一步比對(duì)肝門靜脈入血成分與腹主動(dòng)脈血中成分的峰面積比值可知，乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C在肝門靜脈入血成分的峰面積低于腹主動(dòng)脈血中成分的峰面積，柴胡皂苷元A、柴胡皂苷A在肝門靜脈入血成分的峰面積高于腹主動(dòng)脈血中成分的峰面積。其中乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C在腹主動(dòng)脈中的峰面積增加，說明這4種成分在肝臟代謝時(shí)由其他成分生成(見圖4)。

成分5、6、10、12、13、19分別為乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C。圖4 腹主動(dòng)脈血中成分的提取離子流質(zhì)譜

2.4 柴胡皂苷類關(guān)鍵成分腸道內(nèi)的代謝 柴胡皂苷類成分在腸道內(nèi)代謝情況(見圖5)。

圖5 柴胡皂苷類關(guān)鍵成分腸道內(nèi)的代謝

3 討論

本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)，采用大鼠離體外翻腸囊法、肝門靜脈取血、腹主動(dòng)脈取血的方法，分別對(duì)外翻腸囊吸收成分、柴胡總皂苷提取物給藥后15 min，0.5、1、2、4 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肝門靜脈血和腹主動(dòng)脈血進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥0.5 h的樣品中的出峰數(shù)量最多。因此，本研究選擇灌胃柴胡總皂苷提取液后0.5 h采血，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[14]。

本研究采用離體外翻腸囊法，在大鼠腸吸收中檢測到16種柴胡總皂苷類成分，在肝門靜脈和腹主動(dòng)脈中各檢測到6種柴胡總皂苷類成分。其中羥基柴胡皂苷F、羥基柴胡皂苷D、Rotundioside N、乙酰羥基柴胡皂苷D、柴胡皂苷H、柴胡皂苷F、丙二酰柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、柴胡次皂苷G、柴胡皂苷E、2''-O-乙酰柴胡皂苷D、柴胡皂苷B1、6''-O-乙酰柴胡皂苷D 這13種成分是離體外翻腸囊法中特有的腸吸收成分，表明它們可以直接被腸道吸收；乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷元C僅在肝門靜脈和腹主動(dòng)脈中檢測到，在離體外翻腸囊法腸吸收中未檢測到，推測這3種成分不能直接被腸道吸收，而是由其原型藥物腸道后吸收。有研究證實(shí)黃芪皂苷類成分的主要代謝途徑是脫糖基、脫乙酰基和脫氫[15]，根據(jù)柴胡皂苷結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，推測乙酰柴胡皂苷E是由柴胡皂苷E代謝產(chǎn)生，但具體代謝過程鮮有報(bào)道。此外，有研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D在厭氧環(huán)境大鼠腸道內(nèi)容物中孵化可代謝產(chǎn)生柴胡皂苷元G和柴胡次皂苷G[16-17]。因此本研究推測柴胡皂苷元G可能部分由柴胡皂苷D代謝產(chǎn)生，見圖5(2)；也有研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷C在大鼠胃酸的條件下可轉(zhuǎn)化成柴胡皂苷H和柴胡皂苷I，柴胡皂苷H可再繼續(xù)轉(zhuǎn)化，最終轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷元C[18]，因此本研究推測柴胡皂苷元C是由柴胡皂苷C代謝產(chǎn)生，見圖5(3)。因此，乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷元C可能是由柴胡皂苷E、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C代謝產(chǎn)生。通過比較肝門靜脈取血和腹主動(dòng)脈取血結(jié)果，乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元G和柴胡皂苷元C在腹主動(dòng)脈中的峰面積均高于肝門靜脈中的峰面積，本研究推測它們在肝代謝時(shí)可能由柴胡皂苷E、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C生成，從而增加腹主動(dòng)脈中的峰面積，與上述分析結(jié)果一致。

綜上所述，通過比較3個(gè)代謝特征譜發(fā)現(xiàn)，離體外翻腸囊法可以簡單快速的分析直接被腸道吸收的成分，但由于沒有腸道菌群、胃腸道酶等影響，部分發(fā)揮藥效的代謝產(chǎn)物尚不明確。因此，研究柴胡皂苷類成分發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分需要同時(shí)建立其3種研究方法，結(jié)果表明乙酰柴胡皂苷E、柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷元C可能是柴胡皂苷類成分體內(nèi)發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分。