吳計(jì)超，祝杰，聶東雷，潘思穎，黃群

1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000

鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的影響

吳計(jì)超1，祝杰1，聶東雷1，潘思穎1，黃群2

1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000

目的 觀察鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的影響，探討其抗肝癌的機(jī)制。方法 將50、25、12.5、6.25 μmol/L烏索酸、鉤藤堿分別與人肝癌細(xì)胞株HepG2共同培養(yǎng)24、48、72 h后，以1%DMSO為陰性對(duì)照組，CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖，吖啶橙熒光染色觀察50 μmol/L烏索酸、鉤藤堿和1%DMSO作用48 h后HepG2細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 烏索酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且其抑制率與作用時(shí)間、藥物濃度呈正相關(guān)，鉤藤堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用較弱。病理觀察結(jié)果顯示，鉤藤堿組大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、包漿致密、核染色邊集等凋亡早期改變，而烏索酸組大部分細(xì)胞出現(xiàn)核裂解、凋亡小體等凋亡晚期改變。結(jié)論 鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖有抑制作用，能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

烏索酸；鉤藤堿；HepG2細(xì)胞

流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中排名居前[1-2]。肝癌的高死亡率反映出其惡性程度高、預(yù)后較差的特點(diǎn)。所以，探索高效的肝癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑并研究其作用機(jī)制，對(duì)提高肝癌的療效具有較重要的意義。鉤藤以茜草科植物帶鉤莖枝入藥，原用于清熱平肝、降血壓等，迄今為止已從該屬分離鑒定出數(shù)百種化學(xué)成分，其中主要生物堿類(lèi)包括鉤藤堿，主要三萜類(lèi)包括烏索酸。鉤藤堿主要作用是降壓，烏索酸主要作用抑制腫瘤增殖[3-4]。許多研究表明，烏索酸可以通過(guò)Bax/Bcl-2途徑抑制多種惡性腫瘤增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，如胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病等[5-8]。也有研究表明，鉤藤堿可上調(diào)原癌基因Bax和下調(diào)原癌基因Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡[9]。本研究采用CCK-8法和吖啶橙熒光染色法檢測(cè)烏索酸和鉤藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，探討其抗肝癌的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞株

鉤藤堿、烏索酸，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為O0804AS、N0827AS。肝癌HepG2細(xì)胞株，中南大學(xué)細(xì)胞生物中心。

1.2 主要試劑及儀器

吖啶橙（AO）、DMSO（北京索萊寶科技有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司），CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所）。MK3型酶標(biāo)儀（Labsystem，芬蘭），CK-18倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）、CO2培養(yǎng)箱（SONY，日本），TDL-50B低速速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)（Airtech公司），ME203電子分析天平（Mettler Toledo），DMIL-LED倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培基中常規(guī)培養(yǎng)、傳代及凍存。

2.2 藥物制備

稱(chēng)取15 mg烏索酸溶于6 mL DMSO，取1 mL置于EP管中，加入84 μL DMSO稀釋混勻。稱(chēng)取15 mg鉤藤堿溶于6 mL DMSO，取1 mL置于EP管中，加入288 μL DMSO稀釋混勻。分別取各自混勻液200、100、50、25 μL置于8個(gè)EP管中，按次序加入0、100、150、175 μL DMSO稀釋混勻。2種成分終濃度分別為50、25、12.5、6.25 μmoL/L，且DMSO濃度＜1%。

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

待肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期取出，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，接種到3組96孔板內(nèi)，每孔100 μL，空白對(duì)照組（培養(yǎng)基、CCK-8、1%DMSO）只加100 μL培養(yǎng)基（無(wú)肝癌細(xì)胞），而后再放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。向每個(gè)培養(yǎng)板的8個(gè)實(shí)驗(yàn)組（含HepG2細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8、烏索酸及鉤藤堿）分別加入1 μL上述所配8個(gè)EP管不同濃度的烏索酸和鉤藤堿，向陰性對(duì)照組（含HepG2細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8、1%DMSO）加入1 μL DMSO。取3組培養(yǎng)板分別放回培養(yǎng)箱孵育24、48、72 h，再向培養(yǎng)板內(nèi)加入10 μL CCK-8試劑，再放回培養(yǎng)箱孵育4 h后取出，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度（A）值。鉤藤堿和烏索酸每個(gè)時(shí)段每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行對(duì)照孔，且每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞抑制率[（A陰性對(duì)照組－A實(shí)驗(yàn)組）÷（A陰性對(duì)照組－A空白對(duì)照組）×100%]。

2.4 HepG2細(xì)胞吖啶橙熒光染色

取AO 20 mg，溶于5 mL PBS中混勻，取125 μL加入4875 μL中稀釋成100 μg/mLAO溶液待用。將濃度約為1×105個(gè)/mL的HepG2肝癌細(xì)胞株接種到6孔板內(nèi)，每孔2 mL。待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后，分別向其中加入50 μmoL/L鉤藤堿、50 μmoL/L烏索酸和20 μL DMSO。作用48 h后，吸出培養(yǎng)液，加入2 mL PBS和80 μLAO溶液。作用5 min后取出，熒光顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 烏索酸和鉤藤堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

陰性對(duì)照組HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，隨時(shí)間延長(zhǎng)A值逐漸升高，經(jīng)50 μmol/L烏索酸作用后，隨時(shí)間延長(zhǎng)A值逐漸下降（P＜0.05）。經(jīng)25 μmol/L和50 μmol/L烏索酸作用24、48、72 h后及25 μmol/L和50 μmol/L鉤藤堿作用48、72 h后，各給藥組A值與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)A值計(jì)算各組抑制率，顯示烏索酸對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用明顯，且其抑制率與作用時(shí)間、藥物濃度呈正相關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 烏索酸對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 烏索酸對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

24 h 48 h 72 hF值A(chǔ)值 抑制率/% A值 抑制率/% A值 抑制率/%空白對(duì)照組 5 0.442±0.016 0 0.448±0.014 0 0.434±0.015 0陰性對(duì)照組 5 1.124±0.034 0 1.412±0.037 0 1.524±0.051 0 125.67烏索酸組 6.25 5 1.122±0.033 0.29 1.402±0.037 0 1.396±0.044 11.74 90.02 12.5 5 1.118±0.035 0.88 1.385±0.037 1.04 1.103±0.038 38.62 93.49 25 5 0.971±0.032 22.43 1.083±0.028 34.14 1.062±0.038 42.39 16.53 50 5 0.883±0.030 35.34 0.841±0.025 59.23 0.706±0.027 70.05 56.35 F值 57.46 299.25 36.91組別濃度/（μmol/L） n

表2 鉤藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 鉤藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s）

24 h 48 h 72 h組別濃度/（μmol/L） n F值A(chǔ)值 抑制率/% A值 抑制率/% A值 抑制率/%空白對(duì)照組 5 0.435±0.015 0 0.450±0.022 0 0.440±0.010 0陰性對(duì)照組 5 1.132±0.037 0 1.424±0.048 0 1.513±0.049 0 99.09鉤藤堿組 6.25 5 1.126±0.041 0.86 1.417±0.046 0.71 1.505±0.046 0.74 101.60 12.5 5 1.125±0.030 1.00 1.405±0.041 1.92 1.461±0.042 4.82 108.59 25 5 1.126±0.030 0.85 1.372±0.037 5.26 1.406±0.039 9.93 109.83 50 5 1.124±0.030 1.15 1.345±0.035 7.99 1.351±0.036 15.03 88.64 F值 0.04 3.34 12.74

4.2 病理觀察結(jié)果

陰性對(duì)照組HepG2肝癌細(xì)胞AO染色后，鏡下觀察顯示，細(xì)胞核圓且邊界清晰呈深染，細(xì)胞質(zhì)呈均勻彌散綠色熒光；50 μmol/L烏索酸和鉤藤堿作用48 h HepG2肝癌細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞邊緣皺縮，體積變小，有些細(xì)胞核開(kāi)始模糊甚至消失，并出現(xiàn)細(xì)胞分布不均及成團(tuán)分布現(xiàn)象。此改變與細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)凝集、包漿芽突并脫落、形成含核碎片的膜包被凋亡小體等凋亡形態(tài)改變相符；鉤藤堿組大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、包漿致密、核染色邊集等凋亡早期改變，而烏索酸組大部分細(xì)胞出現(xiàn)核裂解、凋亡小體等凋亡晚期改變。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝癌HepG2細(xì)胞病理形態(tài)（AO熒光染色，×400）

5 討論

研究表明，鉤藤中很多成分都對(duì)腫瘤有一定抑制作用，其各自的調(diào)節(jié)分子機(jī)制也不甚相同。趙明宏等[10]研究了鉤藤中鉤藤酸E對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用，表明鉤藤酸E可調(diào)節(jié)Bax/Bcl-xL比值引起細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。在大多數(shù)對(duì)烏索酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中，都顯示烏索酸通過(guò)Bax/Bcl-2途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11-13]；此外，也有一部分研究顯示烏索酸能降低胃癌細(xì)胞Mcl-1基因表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化療藥物的敏感性[14-16]。有學(xué)者研究了鉤藤堿對(duì)腫瘤的作用，發(fā)現(xiàn)鉤藤總堿在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性方面作用較強(qiáng)[17]。周于祿等[18]通過(guò)人耐藥肺腺癌A549/DDP細(xì)胞研究了異鉤藤堿的逆轉(zhuǎn)耐藥性作用，結(jié)果表明，逆轉(zhuǎn)強(qiáng)弱與給藥劑量有關(guān)，其可能機(jī)制是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物的濃度并減少藥物外排來(lái)發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用。戴國(guó)華等[9]研究顯示，鉤藤堿能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，并且也可以抑制原癌基因c-Fos、c-Myc的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法研究了鉤藤中主要成分烏索酸和鉤藤堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，烏索酸和鉤藤堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，其作用效果不同。本實(shí)驗(yàn)還采用AO熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明，烏索酸和鉤藤堿均能誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡，但鉤藤堿誘導(dǎo)的大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡早期形態(tài)學(xué)改變，而烏索酸誘導(dǎo)的大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡晚期形態(tài)學(xué)改變。2種成分作用效果的差異可能源于其對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞作用機(jī)制的不同。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)已顯示的烏索酸和鉤藤堿均能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，推測(cè)兩者在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡方面，可能均通過(guò)Bax/Bcl-2途徑發(fā)揮作用，但本實(shí)驗(yàn)所知其作用效果存在差異，所以兩者對(duì)肝癌細(xì)胞的作用可能存在不同的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究表明鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對(duì)體外人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖均有一定的抑制作用，其可能的機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，兩者作用的效果存在差異，可能源于不同的作用機(jī)制。至于烏索酸和鉤藤堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的深入分子機(jī)制，以及鉤藤對(duì)活體肝癌的作用效果，有待后續(xù)研究，以便進(jìn)一步詮釋鉤藤對(duì)肝癌的抑制作用及機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。

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Effects of Ursolic Acid and Rhynchophylline in Uncariae Ramulus Cum Uncis on Human Hepatoma HepG2 Cells

WU Ji-chao1,ZHU-Jie1,NIE Dong-lei1,PAN Si-ying1,HUANG Qun2
(1.Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China;2.Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China)

Objective To investigate the effects of ursolic acid and rhynchophylline in Uncariae Ramulus Cum Uncis on human hepatoma HepG2 cells;To discuss its antihepatoma mechanism.Methods Culture the human hepatoma HepG2 cells with 50,25,12.5,6.25 μmol/L ursolic acid,rhynchophylline for 24,48,72 hours respectively. 1%DMSO was set as negative control group.CCK-8 based cytotoxicity assay was used to detect the growth of HepG2.Acridine orange fluorescent staining was used to observe human hepatoma HepG2 cells cultured with 50 μmol/L ursolic acid,rhynchophylline and 1%DMSO for 48 hours were observed.Results Ursolic acid significantly acted as a disincentive to the growth of HepG2 cells,which was in positive correlation with time and concentration.Inhibited effect by rhynchophylline on HepG2 cell proliferation was weaker than ursolic acid.Pathological observation showed that most of the cells in rhynchophylline group showed cell shrinkage,dense pulp coating and nuclear staining edge set,and most of the cells in the ursolic acid group showed apoptosis late changes,such as nuclear cleavage and apoptotic bodies.Conclusion Ursolic acid and rhynchophyllinein Uncariae Ramulus Cum Uncis can inhibit the proliferation of HepG2 cells and can induce apoptosis.

ursolic acid;rhynchophylline;HepG2 cells

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.015

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0063-04

2016-06-09）

（

2016-07-16；編輯：華強(qiáng)）

廣西高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究開(kāi)放課題（2014年）

黃群，E-mail：huangqundao@163.com