王曉光+雷永良++葉碧峰++葉靈++劉敏

[摘要] 目的 了解本市嚴重急性呼吸道病毒病原譜的構成情況，以期能夠為臨床用藥提供病原學數(shù)據(jù)。 方法 采用基于DPO技術的多重RT-PCR方法同時檢測呼吸道感染13種病毒：人呼吸道合胞病毒（RSV），人鼻病毒（hRV），呼吸道腺病毒（AdV），人腸道病毒（hEV），人偏肺病毒（hMPV），人冠狀病毒（hCoV 229E/OC43），人博卡病毒（hBoV），甲、乙型流行性感冒病毒（Inf A and Inf B），副流感病毒（PIV 1/2/3），凝膠電泳鑒定結果。 結果 累計761份嚴重急性呼吸道感染患者標本中，共檢出病毒陽性標本214份，陽性率為28.12%。除PIV 2和hCoV 229E未檢出外，其他11種病原均有被檢出，檢出率為32.19%，前三位分別是RSV 55份、hRV 45份、Inf B 36份。共有27份病原混合感染標本，其中23份雙重感染，4份三重感染，混合感染前三位分別是 hRV 18份、RSV 13份和PIV 3 7份。 結論 麗水市嚴重急性呼吸道病毒感染的主要病原體是RSV，除流感病毒外hRV、hMPV、PIV 3、hEV亦為主要單一致病原，hRV、RSV較高的混合感染率提示hRV或RSV的多重感染可能是呼吸道的基礎感染。

[關鍵詞] 病毒；呼吸道感染；多重感染；基因；多重PCR

[中圖分類號] R56 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）04-0125-03

Investigation and analysis of multiple detection of severe acute respiratory tract infection virus in Lishui City

WANG Xiaoguang LEI Yongliang YE Bifeng YE Ling LIU Min

Lishui Disease Control and Prevention Center in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To understand the composition of pathogenic spectrum of severe acute respiratory virus（SARS） in our city， so as to provide etiological data for clinical drug use. Methods Multiple RT-PCR method based on DPO technique was used to detect 13 viruses of respiratory tract infection simultaneously： human respiratory syncytial virus（RSV）， human rhinovirus（hRV）， respiratory adenovirus（AdV）， human enterovirus（hEV）， human metapneumovirus（hMPV）， human coronavirus（hCoV 229E/OC43）， human bocavirus（hBoV）， influenza A and B virus（Inf A and Inf B）， and parainfluenza virus（PIV 1/2/3）. Gel electrophoresis was used to identify the results. Results A total of 214 SARS-positive samples were detected from 761 patient samples with severe acute respiratory infection， and the positive rate was 28.12%. In addition to PIV 2 and hCoV 229E which were not detected， the other 11 pathogens were detected， with the detection rate of 32.19%. The first three were RSV in 55 samples， hRV in 45 samples， and Inf B in 36 samples. There were a total of 27 pathogenic mixed infection samples， with double infection in 23 samples， and triple infection in 4 samples. The first three viruses of mixed infections were hRV in 18 samples， RSV in 13 samples and PIV 3 in 7 samples. Conclusion The main pathogens of severe acute respiratory virus infection in Lishui city are RSV. In addition to influenza virus， hRV， hMPV， PIV 3， and hEV are also the main single pathogens. The higher mixed infection rate of hRV and RSV suggests the multiple infections of hRV or RSV may be the basis of the respiratory tract infection.

[Key words] Virus； Respiratory infection； Multiple infection； Gene； Multiple PCR

臨床上急性呼吸道感染較為多見，不僅出現(xiàn)發(fā)熱與呼吸系統(tǒng)疾病的癥狀和體征，而且可導致或伴隨產生全身及其他組織系統(tǒng)疾病等多種臨床表現(xiàn)，其病原學相對較復雜，其中80%以上是病毒性的，目前已知至少有8科200種不同亞型的病毒可以通過呼吸道侵害人體[1-3]。常見的可侵害呼吸道造成臨床感染的病毒有人呼吸道合胞病毒（RSV），人鼻病毒（hRV），呼吸道腺病毒（AdV），人腸道病毒（hEV），人偏肺病毒（hMPV），人冠狀病毒（hCoV 229E/OC43），人博卡病毒（hBoV），甲、乙型流行性感冒病毒（Inf A and Inf B），副流感病毒（PIV 1/2/3）等[2-7]。為了解本市嚴重急性呼吸道病毒病原譜的構成情況，本文采用可以有效降低非特異擴增產物生成和引物二聚體產生的雙啟動寡核苷酸引物技術（dual priming oligonucleotide，DPO）的高通量多重RT-PCR方法[8，9]檢測上述13種呼吸道病毒，以期能夠為臨床用藥提供病原學數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2012年1月～2015年12月麗水市中心醫(yī)院兒科病房、呼吸內科和ICU符合中國CDC《住院嚴重急性呼吸道感染病例哨點監(jiān)測方案（2011年版）》[10]感染病例定義患者的上呼吸道標本：起病急，體溫≥38℃，咳嗽或者伴有咽部疼痛，呼吸困難（呼吸頻率≥25次/min）。5歲（含）以下的嬰幼兒具備至少下述3項臨床表現(xiàn)也視為嚴重急性呼吸道感染病例：（1）起病急；（2）咳嗽或者呼吸困難；（3）同時有以下體征或癥狀中的1項：氣促、拒食、嘔吐、抽搐、昏迷/嗜睡、喘鳴/胸壁凹陷。

1.2 標本采集與前處理

每日篩查出符合病例定義的患者，在出現(xiàn)急性呼吸道感染癥狀后24 h內采集患者的鼻咽拭子（使用含聚丙烯纖維的拭子，不能使用棉拭子），盡量在藥物使用前采集標本。采好樣的鼻咽拭子折斷尾部隨即放入含有病毒保存液的采樣試管內，旋緊螺旋管蓋，放入4℃暫時冷藏保存。哨點醫(yī)院標本及時冷鏈送至網(wǎng)絡實驗室進行檢測，實驗室收到后立即處理，將標本置于振蕩器上充分振蕩后擰開蓋子反復擠壓拭子，放置于4℃自然沉淀后取2 mL上清液備用[10]。

1.3 多重RT-PCR檢測

抽提病毒基因組核酸使用MagNA Prue Total Nucleic Acid Kit（Roche，REF：11 858 874 001）；高通量多重RT-PCR采用DiaPlexCTM RV13 Detection Kit（Solgent，REF：SMD50-K100）檢測呼吸道感染13種病毒：RSV、hRV、AdV、hEV、hMPV、hCoV 229E/OC43、hBoV、Inf A、Inf B、PIV 1/2/3；3%瓊脂糖（OXOID）凝膠電泳鑒定結果。核酸抽提、PCR反應體系、反應參數(shù)及具體操作參照試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學處理

將相關數(shù)據(jù)錄入Excel 2010和SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析和評價。

2 結果

2.1 核酸凝膠電泳結果

累計收到哨點醫(yī)院2012年1月～2015年12月761份嚴重急性呼吸道感染患者呼吸道標本（編號：33110541～33111217、S15193001～S15193084），標本核酸擴增產物、PCR質控凝膠電泳判定后獲得理想的預期目的病原特異性基因擴增片段，而陰性對照未見非特異性擴增條帶（封三圖9）。

2.2 病原檢測結果

761份患者標本中經多重PCR共檢出陽性標本214份，陽性率為28.12%（214/761）。除PIV 2和hCoV 229E未檢出外，其他11種總計245個病原均被檢出，檢出率為32.19%（245/761），前三位分別是RSV 55份、hRV 45份、Inf B 36份，是最主要的優(yōu)勢病原，其次為Inf A、hMPV、PIV 3（表1）。

同時檢出有2種以上病原混合感染標本27份，混感率為7.62%，其中23份雙重感染，檢出率為6.04%（46/761）；4份三重感染，檢出率為1.58%（12/761），混合感染前三位分別是 hRV（18份）、RSV（13份）和PIV 3（7份）（表1）。

3 討論

以呼吸道感染為主要臨床癥狀的急性傳染病通常多發(fā)生在氣候突變的冬春季節(jié)，在免疫力較為低下的人群中如嬰幼兒、老年人、氣管插管患者其發(fā)病率往往存在周期性升高的現(xiàn)象。目前針對呼吸道感染病例的病原譜構成特征研究發(fā)現(xiàn)除流行性感冒病毒外，RSV、AdV、hRV等其他傳染性較強的病原體經常會在群體生活、集中居住的人群中廣泛傳播，造成小范圍內的暴發(fā)和流行，是國內免疫力低下人群發(fā)病和住院就醫(yī)的重要原因之一[11-13]。因此了解本地區(qū)急性呼吸道病毒病原譜構成及病原特征，預期能夠提供呼吸道病毒流行病學的研究線索；準確快速的實驗室病原檢測可早期協(xié)助診斷、識別特定感染，具有重要的臨床價值。

RSV是嬰幼兒急性下呼吸道感染的最常見病原，5歲以內因急性呼吸道感染住院的患兒中有20%與RSV感染有關，同時也會在大齡兒童及成人中導致輕微或嚴重的呼吸道疾病[3]。麗水市嚴重急性呼吸道病毒感染的主要病原體是RSV，與以往報道的在浙江沿海[14]、溫州[15]、湖州[16]、永康[17]等地引起呼吸道感染的病原體以RSV為首的檢測結果相符，RSV感染是我市冬春季嬰幼兒住院的主要原因之一。但是甲、乙型流感病毒仍然是檢出最多的病原，而RSV與流感的流行特征相似，每年集中在冬春季節(jié)出現(xiàn)并且流行高峰單一。本研究臨床樣本一年四季均衡采集，提示流感病毒和RSV是導致我市每年冬春季急性呼吸道感染住院病例增加的主要病原體。此外hRV、hMPV、PIV 3、hEV亦為主要單一致病原，與我省其他地區(qū)[14-17]報道的病原譜構成有所不同，可能與某些病毒具有間隔性的流行特征、在特定范圍內有些病毒出現(xiàn)短暫性的局部爆發(fā)等原因導致呼吸道感染病原譜系的多樣性有著直接的關系。

相對于以往單獨檢測病原體，我們采用基于DPO技術的多重RT-PCR方法檢測呼吸道感染13種常見病毒，使得容易產生非特異擴增產物和引物二聚體以及多重引物間相互干擾等問題得以解決[8，9]。我市嚴重急性呼吸道感染患者多重感染為7.62%，宋斌等[14]用直接免疫熒光法檢測7種病毒的多重感染率為3.4%，葉楚楚[18]、趙勤英[16]、石偉先[19]、于德山[20]等用其他多重方法檢測12種常見病毒的多重感染率分別為4.68%、13.64%、17.08%和29.35%，因此采用不同的檢測方法可直接導致多重感染率出現(xiàn)差異，DPO引物多重檢測方法能更全面、準確、有效地反映出呼吸道感染癥候群體中病原譜系的原始分布情況，發(fā)現(xiàn)各類病原體感染的主要占比和排序，真實有效地檢出多重感染。多重感染在人體內可能形成較為復雜的致病機制，有隱性攜帶者感染多種其他病毒發(fā)病也可能發(fā)展為一種常態(tài)，所采用的檢測方法差異最終可能導致廣泛低估多重感染率[3]。麗水市hRV、RSV較高的多重感染率提示hRV或RSV的多重感染可能是呼吸道的基礎感染，而并非是其致病原因，因此在臨床上需要綜合考慮復合感染的可能性，需要明確界定真正導致感染的病毒種類。

依托此技術我們已經建立起以實驗室分子鑒定為基礎的急性呼吸道病毒感染多重快速檢測技術平臺，具有同時檢出多種呼吸道病毒的優(yōu)勢，既可用于臨床實驗室常規(guī)呼吸道感染的檢測，也可用于重大呼吸道病毒暴發(fā)時的檢測。不同的病毒感染可能表現(xiàn)出相似的臨床體征，而不同的抗病毒藥物有著獨自的抗病毒譜，在臨床治療選擇抗病毒藥物時需針對特定病毒選擇特異性藥物，因此實驗室準確快速地檢出混感病毒并界定致病的病毒種類具有重要的臨床參考價值，對開展特異性病原治療、減少盲目的抗生素使用、減少住院時間以及降低醫(yī)療費用等有重要意義。

[參考文獻]

[1] Mahony JB.Detection of respiratory viruses by molecular methods[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：716-747.

[2] Brittain-Long R，Nord S，Olofsson S，et al.Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections[J].J Clin Virol，2008，41（1）：53-56.

[3] 張國翠.多重PCR方法研究兒童呼吸道感染病毒譜系特征[D].重慶醫(yī)科大學，2011.

[4] Kesson AM.Respiratory virus infections[J]. Paediatric Respiratory Reviews，2007，8（3）：240-248.

[5] Kim SR，Ki CS，Lee NY.Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay[J].J Virol Methods，2009，156（1-2）：111-116.

[6] Wang W，Ren P，Sheng J，et al.Simultaneous detection of respiratory viruses in children with acute respiratory infection using two different multiplex reverse transcription-PCR assays[J].J Virol Methods，2009，162（1-2）：40-45.

[7] Lassauniere R，Kresfelder T，Venter M.A novel multiplex real-time RT-PCR assay with FRET hybridization probes for the detection and quantitation of 13 respiratory viruses[J].J Virol Methods，2010，165（2）：254-260.

[8] Yoo SJ，Kuak EY，Shin BM.Detection of 12 respiratory viruses with two-set multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual priming oligonucleotide system[J].Korean J Lab Med，2007，27（6）：420-427.

[9] Kao CC，Liu MF，Lin CF，et al.Antimicrobial susceptibility and multiplex PCR screening of AmpC genes from isolates of enterobacter cloacae，citrobacter freundii，and serratia marcescens[J].J Microbiol Immunol Infect，2010，43（3）：180-187.

[10] 中國中央人民政府.關于印發(fā)《住院嚴重急性呼吸道感染病例哨點監(jiān)測方案（2011年版）》的通知[EB/OL] [2011-02-11].http：//www.gov.cn/zwgk/2011-02/11/content_1801649.htm.

[11] Rodríguez-Martínez CE，Rodríguez DA，Nino G.Respiratory syncytial virus， adenoviruses， and mixed acute lower respiratory infections in children in a developing country[J].J Med Virol，2015，87（5）：774-781.

[12] Li H，Wei Q，Tan A，et al.Epidemiological analysis of respiratory viral etiology for influenza-like illness during 2010 in Zhuhai，China[J].Virol J，2013，10（5）：143.

[13] 王坤，李宏，張淑艷，等.急性呼吸道感染病毒性病原種類及主要特征[J].災害醫(yī)學與救援（電子版），2016，5（2）：120-123.

[14] 宋斌，朱立軍，黃其俊.浙江沿海地區(qū)急性下呼吸道感染患兒的病毒病原檢測分析[J]. 放射免疫學雜志，2012，25（2）：211-212.

[15] 周曉聰，徐強，董琳，等.兒童呼吸道病毒感染譜臨床分析[J].浙江醫(yī)學，2006，28（4）：293-294.

[16] 趙勤英，徐德順，金文君.110例兒童急性呼吸道感染病毒病原學調查[J].浙江預防醫(yī)學，2011，23（6）：76-78.

[17] 鄭國陽，陳冰蓉.永康市1個月～12歲下呼吸道感染患兒的病毒病原現(xiàn)狀及不同年齡、季節(jié)、病種的病毒檢出情況比較[J].中國地方病防治雜志，2016，31（2）：137-140.

[18] 葉楚楚，朱渭萍，王遠萍，等.上海市浦東新區(qū)363例老年流感樣病例及嚴重呼吸道感染病例病毒病原譜特征分析[J].上海預防醫(yī)學，2016，28（11）：772-776.

[19] 石偉先，彭曉旻，韓莉莉，等.北京地區(qū)兒童急性上呼吸道感染病毒病原學調查[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008， 18（7）：1263-1265.

[20] 于德山，李紅育，姜中毅，等.蘭州地區(qū)嚴重急性呼吸道感染住院病例病原譜研究[J].中國病毒病雜志，2012，2（1）：42-46.

（收稿日期：2016-11-12）