蘇亞春 王竹青 李 竹 劉 峰 許莉萍 闕友雄 戴明劍 陳允浩

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甘蔗過氧化物酶基因的克隆與功能鑒定

蘇亞春 王竹青 李 竹 劉 峰 許莉萍*闕友雄 戴明劍 陳允浩

福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室 / 國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心, 福建福州 350002

過氧化物酶(POD)廣泛存在于植物各種器官及其不同發(fā)育階段, 在植物生長發(fā)育及應(yīng)對逆境脅迫中起重要作用。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 從黑穗病菌侵染2 d的甘蔗抗黑穗病品種崖城05-179中分離到基因的cDNA (GenBank登錄號為KU593507)及基因組DNA (GenBank登錄號為KU593508)序列。其cDNA全長為1434 bp, ORF區(qū)為1047 bp, 編碼348個氨基酸, 而基因組DNA全長為1558 bp, 含2個外顯子和1個內(nèi)含子。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, ScPOD02與水稻OsPrx11 (GenBank登錄號為gi|55700889)屬于同一個進(jìn)化分支, 推測ScPOD02屬于酸性胞外分泌/細(xì)胞壁類型的I.1型過氧化物酶家族。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET 32a上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21, 經(jīng)異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)成功獲得了大小約60 kD的融合蛋白, 且該重組菌在聚乙二醇脅迫下的長勢較對照快, 表明其耐受干旱脅迫的能力更強(qiáng)。實(shí)時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析表明, 除ROC22和YZ03-103外,基因在甘蔗抗病品種(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)中受黑穗病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 但在中感(GT02-467和FN39)和感病(FN40)品種中的基因表達(dá)量基本維持不變或略有降低; 此外,積極應(yīng)答水楊酸、脫落酸、聚乙二醇及氯化鈉的脅迫。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在本氏煙葉片上瞬時表達(dá), 結(jié)果顯示出較深的DAB染色, 且過表達(dá)后本氏煙中的目標(biāo)基因()及過敏性反應(yīng)(HR)標(biāo)記基因(和)和乙烯合成依賴基因(和)均上調(diào)表達(dá)。以上研究結(jié)果顯示,具有參與甘蔗免疫應(yīng)答及抗旱和抗鹽害的潛在功能。

甘蔗:; 基因克隆; 生物和非生物脅迫; 基因表達(dá)量; 原核表達(dá)分析; 瞬時表達(dá)分析

甘蔗(spp.)是最主要的糖料作物, 蔗糖分別約占世界食糖和中國食糖總產(chǎn)的80%和92%[1-3]。由黑粉菌()引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生產(chǎn)上最重要的氣傳真菌性病害,造成蔗莖產(chǎn)量損失和蔗糖分降低[4-5]。各國普遍重視該病的防控, 主要通過疫區(qū)控制和抗病育種來實(shí)現(xiàn)[6]。該病在中國大陸蔗區(qū)廣泛流行, 主栽品種新臺糖22 (ROC22)黑穗病發(fā)病嚴(yán)重。培育抗黑穗病甘蔗品種是防治該病害最為經(jīng)濟(jì)、有效的措施[6-7]。研究報道, 病原菌一旦侵染植物, 會破壞植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu), 增加胞內(nèi)活性氧含量, 從而誘導(dǎo)寄主植物體內(nèi)一系列的生理生化代謝反應(yīng), 其中, 防御酶類的變化對病原菌侵入早期的生理防御起著重要的作用[8]。過氧化物酶(POD)是多基因家族編碼的酶類, 由于基因結(jié)構(gòu)和功能的差異, POD還可參與多種代謝途徑, 如生長素代謝過程、細(xì)胞壁的延伸與加厚、活性氧及活性氮的代謝、植物的各種抗逆過程(如機(jī)械損傷、抗旱、抗寒、抗鹽害)等, 具有多種重要的生理功能[9-11]。迄今, PODs在植物抗病性中的重要作用已在多個物種中得到驗證[11-14]。許莉萍等[12]分析了4個不同甘蔗抗/感基因型在伸長期感染黑穗病前后葉片中POD、轉(zhuǎn)化酶、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素的變化, 邢慧清等[13]檢測了60個抗/感絲黑穗病的高粱()基因型在苗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期的4個生理生化指標(biāo), 結(jié)果均發(fā)現(xiàn)POD可以作為潛在的抗性鑒定指標(biāo)。溫琪汾等[14]通過測定不同抗病性谷子()在不同生長期的POD活性, 發(fā)現(xiàn)抗病品種POD活性明顯高于感病品種, 表明POD可以作為一種抗性評價的遺傳標(biāo)記。

目前, 越來越多的植物基因及其結(jié)構(gòu)功能被挖掘。Tognolli等[9]從擬南芥()基因組中挖掘到了73個。Passardi等[15]在水稻()中發(fā)現(xiàn)了138個, 其家族基因數(shù)目約為擬南芥的2倍。甘蔗為異源多倍和非整倍體作物, 遺傳背景復(fù)雜, 全基因組測序工作也尚未完成, 使得挖掘和鑒定甘蔗基因存在困難。研究者早期利用聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳(2DE)等技術(shù)分離甘蔗POD同工酶[16-20]。迄今, NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布了16條甘蔗核酸序列, 其中KF184818、KF184889、KF184743、KF184852、KF184900和KF184837均來源于BAC文庫, 但它們的基因結(jié)構(gòu)、功能、定位等信息尚未清楚。Cesarino等[17]通過2DE和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù), 從甘蔗品種IACSP04-529不同發(fā)育期的蔗莖中鑒定到3個PODs蛋白SCCCCL3002E11.b、SCCCAD1001C08.g和SCBFRZ 2017C11.g, 進(jìn)化樹分析顯示其為單子葉特異基因, 而與雙子葉植物擬南芥的POD序列沒有明確的直接同源性; 此外, 他們還采用該技術(shù)從甘蔗懸浮細(xì)胞中鑒定到4個POD蛋白SCCCST3005E08.g、SCCCAD1001C08.g、SCMCSB1113A08.g和CCCCL 4012A01.g, 時空表達(dá)分析結(jié)果顯示SCMCSB1113 A08.g在蔗莖次生細(xì)胞壁的形成過程中發(fā)揮潛在作用[18]。胡小文等[19]利用同源克隆技術(shù)從割手密()中分離到2個氨基酸序列相似度為98.8%的III型等位基因(GenBank登錄號為KJ002565)和(GenBank登錄號為KJ002566), 其與高粱、玉米()、水稻等禾本科植物的親緣關(guān)系較近, 表明基因起源比較古老且保守。胡小文等[20]還成功克隆了甘蔗、斑茅()和割手密的基因DNA序列(GenBank登錄號為KJ001797、KJ001798、KJ001799), 這3個基因在功能位點(diǎn)區(qū)域高度保守, 僅有一個氨基酸位點(diǎn)存在差異, 其基因組DNA均包含4個外顯子, 與高粱、玉米和水稻同源基因的外顯子長度差異較小, 而內(nèi)含子長度差異較大。LaO等[21]采用cDNA-AFLP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)一個含有4-外顯子的基因在甘蔗抗病品種(M31/45)和感病品種(Ja60-5)中受黑穗病菌誘導(dǎo)差異表達(dá)。

目前, 關(guān)于甘蔗基因挖掘及其應(yīng)對逆境脅迫的分子機(jī)理研究還未曾報道。本研究從課題組前期甘蔗抗黑穗病品種崖城05-179和感黑穗病品種ROC22接種黑穗病菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挖掘到一條僅在抗病品種中差異表達(dá)的基因(Unigene ID: Sugarcane_Unigene_BMK.58108), 以黑穗病菌接種2 d的崖城05-179為試驗材料, 利用生物信息學(xué)預(yù)測編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域等, 并分析其在不同甘蔗基因型與黑穗病菌互作過程及不同非生物脅迫下的基因表達(dá)模式和原核表達(dá)、瞬時表達(dá)情況, 旨在分子水平上對基因在甘蔗抗逆分子機(jī)理方面有進(jìn)一步認(rèn)識, 從而為甘蔗抗逆育種積累理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

1.1.1 生物脅迫取樣 9個不同甘蔗基因型均來源于農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室。國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系植保崗位專家黃應(yīng)昆前期已采用甘蔗黑穗病菌混合孢子的懸浮液進(jìn)行蔗莖浸漬接種[22]并開展田間種植調(diào)查明確其抗黑穗病性表型, 其中抗病品種4個(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)、中感病品種3個(GT02-467、ROC22和FN39)、感病品種2個(YZ03-103和FN40)[23]。本試驗以采自農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室基地的甘蔗黑粉菌混合冬孢子作為接種源, 晾干后在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ「髌贩N表型相對一致的蔗莖, 參考Su等[24]的方法接種: 將蔗莖按雙芽切段, 流動清水浸泡1 d后, 置32℃培養(yǎng)箱中, 采用16 h光照和8 h黑暗催芽培養(yǎng)至芽長2 cm。然后, 以濃度為5×106個 mL–1(含0.01%吐溫-20, v/v)的黑穗病菌孢子懸浮液針刺接種蔗芽, 對照為接種無菌蒸餾水(含0.01%吐溫-20, v/v)替代孢子液所取得的。針刺處理后的材料在28℃下培養(yǎng)(16 h光照、8 h黑暗), 分別于接種后0、1、3和7 d切取蔗芽, 5個蔗芽為一個混樣, 以液氮固定后于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 非生物脅迫取樣 選取長勢一致的4個月葉齡的崖城05-179組培苗, 放入清水中培養(yǎng)煉苗10 d后, 對其葉面分組處理: 第1組分別在葉面噴施5 mmol L–1SA (含0.01%吐溫-20, v/v)、100 μmol L–1MeJA (含0.1%乙醇和0.05%吐溫-20, v/v)和100 μmol L–1ABA, 分別于0、3、6和12 h取樣; 第2組分別在含500 mmol L–1的H2O2, 20%的PEG-8000和250 mmol L–1的NaCl的水溶液中培養(yǎng), 然后分別于0、6、12和24 h取樣[24]。兩組試驗中均取整株組培苗, 迅速用液氮固定, 于–80℃保存?zhèn)溆?。每個處理分別設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 基因組DNA及RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

采用姚偉等[25]的CTAB法提取崖城05-179基因組DNA (含RNase A 100 μg mL–1), 另外借助TRIzol法(Invitrogen, 中國)提取樣品總RNA, 分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳初步判斷DNA及總RNA質(zhì)量, 利用紫外分光光度計(NanoVue plus, GE, USA)測定樣品濃度和純度, –80℃保存?zhèn)溆?。? μg總RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 中國大連)合成第1鏈cDNA, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 甘蔗基因克隆與序列分析

應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計克隆引物P2-cDNAF/R (表1), 以崖城05-179接種黑穗病菌2 d的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR體系(25.0 μL)含cDNA 1.0 μL、ExDNA酶(5 U μL–1) 0.125 μL、10×Ex緩沖液(Mg2+plus) 2.5 μL、dNTPs混合物(2.5 mmol L–1) 2.0 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各1.0 μL、ddH2O 17.375 μL。PCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 48℃退火30 s, 72℃延伸1 min 30 s, 35個循環(huán); 72℃再延伸10 min。的基因組DNA序列擴(kuò)增以25 ng的崖城05-179 DNA為模板, 擴(kuò)增引物及反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與cDNA克隆相同。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收純化后, 與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 將PCR檢測呈陽性的菌落送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序分析。

運(yùn)用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html)查找基因的開放閱讀框; 借助EXPASY工具中的Protparam (http://www.expasy. ch/tools/protparam.html)分析基因編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點(diǎn); 利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和Psort (http://psort.hgc.jp/form.html)軟件預(yù)測編碼蛋白的信號肽及亞細(xì)胞定位情況; 通過ClustalW對ScPOD02與水稻POD家族基因的氨基酸序列[15]多重比對, 利用MEGA 5.05 (NJ, 1000 BootStrap)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 本研究所用引物

1.4基因表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR (Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction)方法, 于ABI 7500 Real-time PCR System (美國)上檢測在生物和非生物脅迫下的基因表達(dá)情況。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計基因特異性定量引物P2-QF/R (表1), 內(nèi)標(biāo)甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,) (GenBank登錄號為CA254672)引物為GAPDH-Q/F (表1)。qRT-PCR反應(yīng)體系含F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, China) 10 μL、cDNA (10×稀釋液) 1.0 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各0.8 μL、ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序為50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 循環(huán)40次。每個樣品3次重復(fù), 以無菌水作對照, 采用2–ΔΔCT算法[26]計算基因相對表達(dá)量, 借助DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析, 應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。在黑穗病菌接種材料中, 為消除機(jī)械損傷的影響,基因的相對表達(dá)量為接菌材料的基因表達(dá)水平扣除相應(yīng)時 間點(diǎn)對照(接種無菌蒸餾水)的基因表達(dá)水平。

1.5基因原核表達(dá)分析與平板脅迫驗證

以含有目標(biāo)基因的陽性質(zhì)粒pMD19-T- ScPOD02為模板, 利用引物GP2-F/R (表1)擴(kuò)增獲得帶有d III和H Ι酶切位點(diǎn)的基因ORF片段。然后, 對膠回收片段及原核表達(dá)質(zhì)粒pET 32a進(jìn)行雙酶切及T4連接酶連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET 32a-ScPOD02。將菌液PCR及測序正確的重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于含有80 μg mL–1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上, 經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜, 隨后挑取單克隆點(diǎn)進(jìn)行菌液PCR檢測及質(zhì)粒單、雙酶切鑒定。取驗證正確的陽性重組菌株BL21 pET 32a-ScPOD02以及空白菌株BL21和空載BL21 pET 32a菌液, 分別加入到20 mL LB液體培養(yǎng)基中, 于37℃下200轉(zhuǎn) min–1振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6后, 加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1.0 mmol L–1, 在28℃下200轉(zhuǎn)min–1進(jìn)行蛋白誘導(dǎo), 分別于0、0.5、1、2和3 h取樣。將上述樣品在4℃下8000轉(zhuǎn) min–1離心10 min收集菌體, 去除上清液后, 加入30 μL 2×蛋白上樣緩沖液, 混勻后于100℃水浴5 min進(jìn)行裂解, 各取10 μL上清液于12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢測, 最后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和成像分析[27]。

當(dāng)BL21 pET 32a和BL21 pET 32a-ScPOD02菌液分別經(jīng)37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時, 加入IPTG至終濃度為1.0 mmol L–1, 經(jīng)28℃誘導(dǎo)12 h后, 將菌液稀釋到OD600為0.6, 然后將其分別稀釋1×10–3與1×10–4倍。各取10 μL上述稀釋液, 分別點(diǎn)至含有0、15%、30%和45% PEG-8000的LB平板上(含80 μg mL–1氨芐青霉素), 37℃培養(yǎng)過夜后, 收集平板脅迫照片[27]。

1.6過表達(dá)載體構(gòu)建與瞬時表達(dá)分析

以含有目標(biāo)基因的陽性質(zhì)粒pMD19-T- ScPOD02為模板, 利用引物TP2-F/R (表1)擴(kuò)增獲得帶有I和I酶切位點(diǎn)的基因ORF片段。然后, 對膠回收片段及過表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA 1301進(jìn)行雙酶切及T4連接酶連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-ScPOD02。將菌液PCR及測序正確的重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于含有卡那霉素(50 μg mL–1)和利福平(35 μg mL–1)的LB固體培養(yǎng)基上, 經(jīng)28℃培養(yǎng)過夜, 隨后挑取單克隆點(diǎn)進(jìn)行菌液PCR檢測及質(zhì)粒單、雙酶切鑒定。將驗證正確的陽性重組菌株EHA105 pCAMBIA 1301-ScPOD02以及空載EHA105 pCAMBIA 1301菌液分別加入含50 μg mL–1卡那霉素和35 μg mL–1利福平的LB液體培養(yǎng)基中, 于28℃振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集菌體后, 用含有200 μmol L–1乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600為0.8, 然后將農(nóng)桿菌菌液針刺注射到6~8片葉齡的本氏煙葉片上。參考Su等[28]的方法分析DAB染色及本氏煙相關(guān)免疫標(biāo)記基因(表1)的表達(dá)情況。所有處理均3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗基因克隆與序列分析

克隆到甘蔗基因的cDNA (GenBank登錄號為KU593507)全長為1434 bp, ORF區(qū)為1047 bp, 編碼348個氨基酸(圖1-A)。該基因的基因組DNA (GenBank登錄號為KU593508)全長1558 bp, 含有2個外顯子和1個內(nèi)含子, 內(nèi)含子長度為124 bp, 其邊界符合“GT-AG”的內(nèi)含子法則(圖1-B)。蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明,推導(dǎo)的編碼蛋白分子質(zhì)量為38.12 kD, 理論等電點(diǎn)為6.67。SignalP和Psort軟件預(yù)測結(jié)果顯示, ScPOD02含有信號肽, 其剪切位點(diǎn)處于第28和第29位氨基酸處, 定位于細(xì)胞外(含細(xì)胞壁)的概率最大(66.7%)。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示, ScPOD02具有完整的POD保守結(jié)構(gòu)域。Blast分析表明, ScPOD02與高粱POD (GenBank登錄號為XP_002457709.1)的氨基酸序列同源性高達(dá)93%。將基因推導(dǎo)的編碼蛋白與部分水稻PODs家族基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建顯示, ScPOD02與水稻OsPrx11 (GenBank登錄號為gi|55700889)在進(jìn)化上屬于同一個進(jìn)化分支(圖2)。綜上,可能為酸性胞外分泌/細(xì)胞壁類型的I.1型過氧化物酶家族成員。

2.2 甘蔗黑穗病菌脅迫下的基因表達(dá)

受黑穗病菌侵染后, 甘蔗抗病品種LC05-136中基因的表達(dá)量在脅迫初期(1 d)即達(dá)到峰值, 約為對照的1.15倍, 3 d和7 d后基因表達(dá)量下降且低于對照水平; 而YZ03-258、YZ01-1413和YT96-86中基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢, 在3 d或7 d時達(dá)到峰值, 分別為對照的1.28、1.47和1.59倍。在甘蔗中感和感病品種中,基因的表達(dá)模式在ROC22和YZ03-103中分別與在LC05-136和YZ03-258/YZ01- 1413/ YT96-86中的表達(dá)模式相同, 而其余3個材料中基因表達(dá)量基本維持不變(FN40)或出現(xiàn)小幅下降(GT02-467和FN39)?？傮w而言, 除ROC22和YZ03-103外,基因在甘蔗抗病品種中受黑穗病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 而在中感和感病品種中的基因表達(dá)量基本維持不變或略有降低。

A:方框代表起始密碼子, 橢圓代表終止密碼子; B: 方框表示外顯子, 橫線表示內(nèi)含子; 內(nèi)含子的初始堿基為GT, 結(jié)束堿基為AG; 數(shù)字代表相應(yīng)的序列長度。

A: initiation and termination codons are highlighted in box and oval, respectively; B: box and line represent extron and intron, respectively. The starting and ending bases of the intron were GT and AG, respectively. The numbers stand for the length of the corresponding sequence.

通過ClustalW進(jìn)行序列推導(dǎo)蛋白的多重比對后, 利用MEGA 5.05進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。GenBank登錄號如圖。

The phylogenetic tree of PODs was constructed by MEGA 5.05 after making a multiple alignment of coding protein sequences with ClustalW. GenBank accession numbers were shown in the tree.

甘蔗抗黑穗病品種: YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136; 甘蔗中感黑穗病品種: GT02-467、ROC22和FN39; 甘蔗感黑穗病品種: YZ03-103和FN40。數(shù)據(jù)以的表達(dá)量為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。為消除機(jī)械損傷的影響,基因的相對表達(dá)量為接菌材料的基因表達(dá)水平扣除相應(yīng)時間點(diǎn)對照(接種無菌蒸餾水)的基因表達(dá)水平。所有的時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (= 3)。柱上不同的字母代表顯著性的差異(-value ≤ 0.05)。

Sugarcane smut-resistant cultivars were YZ03-258, YZ01-1413, YT96-86, and LC05-136. Sugarcane smut-middle-susceptible cultivars were GT02-467, ROC22, and FN39. Sugarcane smut-susceptible cultivars were YZ03-103 and FN40. Data was normalized to theexpression level.To eliminate the influence of mechanical damage, the relative expression of thegene under smut pathogen stress was calculated by the expression level of the inoculated sample minus the level of the mock at each corresponding time point. All data points were the means the average value ± SE (= 3). Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different (-value ≤ 0.05).

2.3基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)

圖4所示,基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式呈多樣化。其轉(zhuǎn)錄本在SA和ABA脅迫初期(3 h)即達(dá)到峰值, 分別為對照的6.17倍和5.60倍, 處理6~12 h后,基因表達(dá)量均恢復(fù)到對照水平。在PEG處理下,基因的表達(dá)水平總體顯著高于對照, 且在12 h達(dá)到峰值, 為對照的6.75倍。在NaCl脅迫下,在各時間點(diǎn)間的表達(dá)量差異顯著, 基因表達(dá)模式為“下降—上升—下降”的趨勢, 其轉(zhuǎn)錄本在12 h時為對照的1.91倍。在MeJA和H2O2脅迫下, 相比于對照, 隨著脅迫時間的延長,基因的表達(dá)量略有下降或基本保持不變。因此,基因能夠積極應(yīng)答SA、ABA、PEG和NaCl脅迫。

數(shù)據(jù)以的表達(dá)量為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。所有的數(shù)據(jù)均為扣除對照后的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 3)。柱上不同的字母代表顯著性的差異(-value ≤0.05)。SA: 水楊酸; MeJA: 茉莉酸甲酯; ABA: 脫落酸; PEG: 聚乙二醇(模擬干旱); H2O2: 過氧化氫; NaCl: 氯化鈉。

Data was normalized to theexpression level.All data points (with the deduction of their mocks) were the means the average value ± SE (= 3). Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different (-value ≤0.05). SA: salicylic acid; MeJA: methyl jasmonate; ABA: abscisic acid; PEG: polyethylene glycol (simulate drought treatment); H2O2: hydrogen peroxide; NaCl: sodium chloride.

(A) M1: DNA marker 100 bp; M2: DNA marker 15000+2000 bp; 1: BL21 pET 32a/H I的單酶切產(chǎn)物; 2:ORF PCR產(chǎn)物; 3: BL21 pET 32a-ScPOD02/R I的單酶切產(chǎn)物; 4: BL21 pET 32a-ScPOD01/R I+dIII的雙酶切產(chǎn)物。箭頭表示目的基因。(B) M3: 蛋白marker; 1~5: BL21 pET 32a-ScPOD02分別誘導(dǎo)3、2、1、0.5和0 h; 6:BL21 pET 32a誘導(dǎo)3 h; 7: 未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21 pET 32a; 8:BL21誘導(dǎo)3 h; 9: 未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21。箭頭表示目標(biāo)蛋白ScPOD02。

(A)M1: DNA marker 100 bp; M2: DNA marker 15000+2000 bp; 1: BL21 pET 32a/H I; 2:ORF PCR product; 3: BL21 pET 32a-ScPOD02/R I; 4: BL21 pET 32a-ScPOD02/R I+dIII; The arrow indicates the targeted fragment of. (B) M3: Protein marker; 1–5:BL21 pET 32a-ScPOD02induction for 3, 2, 1, 0.5, and 0 h, respectively; 6:BL21 pET 32a induction for 3 h; 7:BL21 pET 32a without induction; 8:BL21 induction for 3 h;9:BL21 without induction. The arrow indicates the inducted protein of ScPOD02.

BL21 pET 32a和BL21 pET 32a-ScPOD02菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后稀釋至OD600為0.6, 然后分別稀釋1×10–3倍與1×10–4倍。各取10 μL 1×10–3(LB平板紅線左邊區(qū)域)和1×10–4(LB平板紅線右邊區(qū)域)菌液點(diǎn)至含0、15%、30%和45% PEG的LB平板培養(yǎng)基上。

After induction by IPTG, the cultures of BL21 pET 32a and BL21 pET 32a-ScPOD02 were adjusted to OD600=0.6. Then 10 μL cultures from 1×10–3(left side of red line on LB plate) and 1×10–4(right side of red line on LB plate) dilutions were spotted onto LB plates with 0, 15%, 30%, and 45% PEG, respectively

2.4基因的原核表達(dá)分析與平板脅迫驗證

酶切驗證結(jié)果(圖5-A)表明, 本試驗成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET 32a-ScPOD02。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21后, 觀察不同時間點(diǎn)目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。SDS-PAGE分析顯示, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0.5 h后, 重組菌BL21 pET 32a-ScPOD02在約60 kD處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶, 且融合蛋白累積量隨著IPTG誘導(dǎo)時間的延長(0.5~3.0 h)而增多(圖5-B)。鑒于在甘蔗中積極響應(yīng)PEG脅迫(圖4), 我們通過原核平板脅迫進(jìn)一步觀察比較BL21 pET 32a和BL21 pET 32a-ScPOD02在外源脅迫下的菌落長勢。結(jié)果(圖6)顯示, 重組菌BL21 pET 32a-ScPOD02在添加PEG的LB平板培養(yǎng)基上的菌落長勢相比于對照稍多, 表明ScPOD02蛋白可以提高PEG脅迫(模擬干旱)條件下重組菌細(xì)胞的生長。

2.5基因的瞬時表達(dá)

將攜帶有目標(biāo)基因的過表達(dá)載體pCAMBIA 1301ScPOD02 (圖7-A)轉(zhuǎn)化EHA105菌株, 借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染本氏煙葉片中后, 48 h時被侵染葉片的DAB染色結(jié)果較對照顏色略深(圖7-B), 表明其葉片中H2O2含量增多, 葉片內(nèi)出現(xiàn)過氧化現(xiàn)象。定量檢測發(fā)現(xiàn), 過表達(dá)基因24 h后, 本氏煙葉片中的目標(biāo)基因(圖8-A)及過敏性反應(yīng)(HR)相關(guān)基因、和ET合成依賴基因、(圖8-B)均出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)。

(A) M1: DNA marker 15000+2000 bp; M2: DNA marker 100 bp; 1: pCAMBIA 1301/I的單酶切產(chǎn)物; 2:ORF PCR產(chǎn)物: 3: pCAMBIA 1301-/I的單酶切產(chǎn)物; 4: pCAMBIA 1301-/I+I的雙酶切產(chǎn)物。箭頭表示目的基因。(B)農(nóng)桿菌侵染本氏煙葉片48 h后的DAB染色情況。

(A) M1: DNA marker 15000+2000 bp; M2, DNA marker 100 bp; 1: pCAMBIA 1301/I; 2,ORF PCR product; 3: pCAMBIA 1301-/I; 4: pCAMBIA 1301-/I+I. The arrow indicates the targeted fragment of. (B) DAB staining inleaves at 48 h afterstrain infiltration.

本氏煙免疫相關(guān)記基因包括過敏反應(yīng)相關(guān)基因、和, 水楊酸相關(guān)基因, 茉莉酸相關(guān)基因、和, 乙烯合成依賴相關(guān)基因和。以作為內(nèi)參。以攜帶空載體pCAMBIA 1301的農(nóng)桿菌為對照。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 3)。柱上不同的字母代表顯著性的差異(-value ≤0.05)。Mock: 35S::00。

The immunity related marker genes in theincluding the hypersensitive response marker genes,, and, the salicylic acid related gene, the jasmonate associated genes, and, the ethylene synthesis depended genesand.was used to normalize the transcript levels. Mock:strain carrying pCAMBIA 1301. All data points are means the average value ± SE (= 3). Bars superscribed by different lowercase letters are significantly different (-value ≤0.05). Mock: 35S::00.

3 討論

POD作為植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一, 在1955年被首次報道[11]。植物是多基因家族組成的酶類, 包含多種同工酶, 基因結(jié)構(gòu)和功能多樣, 廣泛參與植物體內(nèi)多種代謝活動[15]。Passardi等[15]將水稻的138個過氧化物酶基因分成8類(Ι~VIII),其中某些又分成幾個亞類, 比如Ι類中包括Ι.1~Ι.5亞類; IV類中包括IV.1~IV.4亞類; V類中包括V.1亞類。如今, 隨著測序費(fèi)用的大幅度下降, 極大地推進(jìn)了基因組和轉(zhuǎn)錄組測序工作, 越來越多的基因被克隆或篩選出來[9-10]。甘蔗倍性復(fù)雜導(dǎo)致其至今仍然歸入無參考基因組的物種, 因此, 甘蔗基因分離尤其是基因結(jié)構(gòu)及功能的研究進(jìn)展相對緩慢[29-30]。本研究根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果, 以崖城05-179為研究材料, 克隆得到1條甘蔗I.1型過氧化物酶家族成員基因, 序列分析發(fā)現(xiàn),基因組含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。然而胡小文等[20]研究顯示甘蔗、斑茅和割手密中3個III型(GenBank登錄號為KJ001797、KJ001798、KJ001799)的基因組DNA均包含4個外顯子。Tognolli等[9]綜合擬南芥中基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 提出四外顯子、三內(nèi)含子的典型基因組結(jié)構(gòu), 但并不是所有的單子葉植物基因都具有該基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 這可能與該基因的功能多樣性有關(guān)。

前人研究顯示, 真核細(xì)胞中家族基因的亞細(xì)胞定位的不同與其功能有關(guān)[31]。Ren等[31]通過對10個重組PRX在本氏煙表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析表明, 8個PRX (PRX2、3、4、7、20、21、22和23)定位在液泡中, 另外2個PRX (PRX6和PRX24)定位在細(xì)胞外圍, 即這些細(xì)胞被分別定位在細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁上, 說明該類基因?qū)儆诩?xì)胞壁類型的PRX。本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示, ScPOD02定位于細(xì)胞外(含細(xì)胞壁)的概率最大, 暗示ScPOD02可能為胞外分泌/細(xì)胞壁類型的POD家族成員, 這與Ren等[31]從楊樹所克隆的和基因的定位結(jié)果相似, 表明其可能行使相似的功能, 參與細(xì)胞壁的新陳代謝, 如木質(zhì)素聚合反應(yīng)等。

在植物的免疫防御機(jī)制中起重要作用, 其表達(dá)受細(xì)菌、真菌、病毒和類病毒的誘導(dǎo)[32-33]。Esh等[34]的研究顯示, 受黑穗病菌侵染能夠?qū)е赂收狍w內(nèi)POD酶活性變化。許莉萍等[12]研究發(fā)現(xiàn), 黑穗病菌侵染后抗、感甘蔗品種的POD酶活性均升高, 但感病品種酶活性增加程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗病品種, 這表明POD酶活性與品種抗性有一定的關(guān)聯(lián), 但是這一現(xiàn)象是否在更多不同遺傳背景的其他甘蔗基因型上也能重演, 目前還尚未可知。溫琪汾等[14]通過對4個抗病品種、3個感病品種谷子不同生長期的POD活性測定也發(fā)現(xiàn), 不同種質(zhì)資源的黑穗病抗性存在明顯差異, 抗病品種POD活性明顯高于感病品種, 表明POD有望作為一種遺傳標(biāo)記, 并具有開發(fā)為功能標(biāo)記的潛力。Zhang等[35]對玉米中篩選出的18個基因研究發(fā)現(xiàn), 其表達(dá)量在感病品種中下調(diào)表達(dá), 在抗病品種中則相反。LaO等[21]對甘蔗中具有4-外顯子典型基因組結(jié)構(gòu)的基因及其同系物研究, 發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在接種后的感黑穗病品種中僅在24 h出現(xiàn)輕微下調(diào), 而在抗病品種中72 h則出現(xiàn)強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá)。這種病原菌誘導(dǎo)特性與甘蔗基因的表達(dá)特性是一致的, 即接種黑穗病菌后,基因的表達(dá)量在甘蔗抗病品種中受黑穗病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 而在中感和感病品種中的基因表達(dá)量基本維持不變或略有降低, 暗示可能在甘蔗防御黑穗病菌的侵染中發(fā)揮潛在作用。

病菌的侵染會導(dǎo)致植物細(xì)胞過氧化加劇, 引起植物免疫應(yīng)答反應(yīng), 其中過氧化物含量升高、膜脂過氧化等現(xiàn)象是細(xì)胞應(yīng)答外源侵染的主要表現(xiàn)[33]。本試驗表明, 帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染本氏煙后, 葉片H2O2含量增加, DAB染色加深(圖7-B), 且HR相關(guān)基因、及ET合成依賴基因、均出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)(圖8-B), 提示可能參與甘蔗HR與免疫應(yīng)答。

前人研究表明,基因不僅能夠被植物生長激素, 如SA、ABA、茉莉酸(JA), 乙烯(ET)調(diào)節(jié), 也能夠被多種非生物逆境(鹽堿、干旱、低溫等)調(diào)節(jié), 說明基因在植物生長過程中發(fā)揮重要作用[36]。SA是植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的主要誘導(dǎo)因子, 同時也是病原菌侵染后植物活化一系列植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號傳導(dǎo)途徑中的重要組分[36]。本研究中, SA脅迫初期(3 h)誘導(dǎo)基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖4), 表明可能參與SAR。Wang等[37]研究番茄基因在不同外源激素脅迫下的表達(dá)情況顯示, 受SA、JA和ABA脅迫后,基因表達(dá)量同樣增加。ABA是調(diào)控植物適應(yīng)逆境脅迫的重要植物激素之一[38], 極端溫度、干旱、鹽害等脅迫能增加植物體內(nèi)ABA的含量從而進(jìn)一步誘發(fā)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)[39]。本研究中, 攜帶的重組原核表達(dá)菌株在含PEG添加劑的培養(yǎng)基中的菌落長勢較對照快(圖6), 此外, 該基因在ABA、PEG及NaCl脅迫下表達(dá)量增加(圖4), 表明ABA可能在干旱及鹽脅迫中發(fā)揮信號因子作用, 以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本累積。這一研究結(jié)果與Novo-Uzal等[40]研究的銀杏()基因在NaCl脅迫下表達(dá)量提高的結(jié)果類似。

4 結(jié)論

從甘蔗中分離到了一個基因(GenBank登錄號為KU593507), 其cDNA全長為1434 bp, 基因組全長1558 bp, 含有2個外顯子和1個內(nèi)含子, ORF區(qū)為1047 bp, 編碼348個氨基酸。ScPOD02屬于酸性胞外分泌/細(xì)胞壁類型的I.1型過氧化物酶家族成員。ScPOD02原核誘導(dǎo)蛋白大小約為60 kD。在PEG脅迫下, 重組菌BL21 pET 32a-相比對照表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力。在9個不同甘蔗基因型與黑穗病菌互作過程中,基因在抗病品種中受該病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 但在中感及感病品種中的表達(dá)量基本不變或略微下調(diào), 且的瞬時表達(dá)能夠誘發(fā)本氏煙的防御反應(yīng)。此外,積極應(yīng)答SA、ABA、PEG和NaCl脅迫, 推測該基因在甘蔗免疫應(yīng)答及抗旱和抗鹽害反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。

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Molecular Cloning and Functional Identification of Peroxidase Genein Sugarcane

SU Ya-Chun, WANG Zhu-Qing, LI Zhu, LIU Feng, XU Li-Ping*, QUE You-Xiong, DAI Ming-Jian, and Chen Yun-Hao

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University / Sugarcane Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, China

Peroxidases (PODs), widely existing in various plant organs and different development stages, play a vital role in plant growth and development, and also respond to adverse stresses. Based on the previous transcriptome data, we isolated a cDNA (GenBank accession number KU593507) and genomic DNA (GenBank accession number KU593508) sequences offrom smut resistant genotype Yacheng 05-179 infected byfor two days. Sequence analysis showed that the full length cDNA ofis 1434 bp with an ORF of 1047 bp in length, encoding 348 amino acids. Its genomic DNA length is 1558 bp containing two exons and one intron. Phylogenetic tree analysis demonstrated that ScPOD02 and rice OsPrx11 (GenBank accession number gi|55700889) were clustered into the same evolutionary branch, suggesting that ScPOD02 belongs to one of the acidic exocytosis/cell wall type of class I.1 peroxidase family members.was further ligated with a prokaryotic expression vector of pET 32a and then transformed intoBL21. An approximately 60 kD fusion protein was obtained by isopropyl-β-d-thiogalactoside induction. Compared with the control, the growth of recombinant BL21 cells was enhanced under the stress of polyethylene glycol, indicating its high tolerance to drought stress. qRT-PCR analysis showed that the transcripts ofwere up-regulated in sugarcane smut-resistant cultivars (YZ03-258, YZ01-1413, YT96-86, and LC05-136) byexcept for ROC22 and YZ03-103, but remained or slightly decreased in the middle-susceptible (FN39 and GT02-467) and susceptible (FN40) cultivars. In addition,positively responded to salicylic acid, abscisic acid, polyethylene glycol and sodium chloride stresses. The transient expression ofinwas performed usingmediated method. A deeper DAB staining color inleaves was observed after overexpressing. Furthermore, the target geneand thehypersensitive reaction (HR) marker genes (and) and ethylene synthesis dependent genes (and) were all up-regulated. These reach a conclusion that thehas potential roles in the immune response and in protecting sugarcane from drought and salt stresses.

Sugarcane;; Gene cloning; Biotic and abiotic stresses; Gene expression level; Prokaryotic expression analysis; Transient expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2017.00510

本研究由福建省杰出青年科學(xué)基金項目(2015J06006), 福建農(nóng)林大學(xué)杰出青年基金項目(xjq201630)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-20)資助。

This study was supported by the Fujian Natural Science Funds for Distinguished Young Scholar (2015J06006), the Research Funds for Distinguished Young Scientists in Fujian Agriculture and Forestry University (xjq201630), and the China Agriculture Research System (CARS-20).

許莉萍, E-mail: xlpmail@126.com

E-mail: syc2009mail@163.com

2016-07-04;

Accepted(接受日期): 2016-11-02;

Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2016-12-14.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20161214.1605.006.html