馬 驪 袁金海 孫萬倉 劉自剛 曾秀存 武軍艷方 彥 李學(xué)才 陳 奇 許耀照 蒲媛媛 劉海卿 楊 剛 劉林波

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白菜型冬油菜類甜蛋白的篩選、克隆及其在低溫脅迫下的表達(dá)

馬 驪1,**袁金海1,**孫萬倉1,*劉自剛1曾秀存2武軍艷1方 彥1李學(xué)才1陳 奇1許耀照2蒲媛媛1劉海卿1楊 剛1劉林波1

1甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070;2河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 甘肅張掖734000

類甜蛋白是一種能在低溫脅迫下誘導(dǎo)表達(dá), 增強(qiáng)植物抗逆性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。本研究運(yùn)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù), 篩選低溫脅迫下隴油7號(hào)葉片差異蛋白點(diǎn), 從中分離出與抗寒密切相關(guān)的類甜蛋白。根據(jù)已發(fā)表植物類甜蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)引物, 采用RT-PCR擴(kuò)增隴油7號(hào)的DNA, 獲得基因開放閱讀框, 長度為732 bp, 編碼243個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析顯示, 與甘藍(lán)型油菜()的蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性高達(dá)99.18%, 該基因在進(jìn)化上高度保守, 其保守序列屬于植物的GH69-TLP-SF超家族, TLP相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為26.02 kD和9.15。TLP含有一個(gè)信號(hào)肽, 為親水性蛋白, 亞細(xì)胞定位預(yù)測其是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明隴油7號(hào)的TLP是由不規(guī)則卷曲和延伸鏈組成的不穩(wěn)定蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量和半定量分析顯示, 在適當(dāng)閾值的低溫脅迫下基因表達(dá)量上調(diào), 表明該基因在白菜型冬油菜隴油7號(hào)適應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

白菜型冬油菜; 雙向電泳; 低溫; 類甜蛋白

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者, 是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者, 要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí), 就必須進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究[1]。雙向凝膠電泳(two- dimensional gel electrophoresis, 2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域比較成熟的一項(xiàng)技術(shù), 特別在抗逆性差異蛋白質(zhì)的分析及鑒定方面, 利用2-DE技術(shù)能夠比較分析生物樣品在不同條件下蛋白質(zhì)組學(xué)的動(dòng)態(tài)變化, 從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特異功能的蛋白質(zhì), 根據(jù)蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物, 為進(jìn)一步進(jìn)行基因克隆和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定奠定基礎(chǔ)。研究表明, 類甜蛋白分布廣泛, 具有廣譜抗凍活性、抗真菌活性、β-1,3葡聚糖酶活性、酶抑制活性及過敏原活性等[2-4]。非生物和生物脅迫下, 植物通過自身的遺傳性和生理、生化等方面的反應(yīng), 導(dǎo)致一些代謝相關(guān)蛋白以及運(yùn)輸相關(guān)蛋白表達(dá)量變化, 從而誘導(dǎo)自身產(chǎn)生一些與抗逆相關(guān)的蛋白來抵御外界脅迫[5]。非生物脅迫(冷害、高鹽, 干旱[6-7]等), 生物脅迫(真菌、細(xì)菌、病毒和昆蟲[8-11], 激素(乙烯和水楊酸等)[12-13]以及特定的生理發(fā)育過程中, 植物基因都被快速誘導(dǎo)表達(dá), 一些轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性也顯著提高。例如, 冬黑麥葉片質(zhì)外體在低溫誘導(dǎo)下分泌的類甜蛋白, 其抗凍活性與抗凍蛋白相同[14]。干旱和鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)類甜蛋白基因的煙草植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱耐鹽脅迫能力[15]。

從水稻[16]、馬鈴薯[17]、煙草[18]、荔枝[19]等植物中已分離克隆了類甜蛋白基因。我國北方寒旱區(qū)冬寒春旱, 而白菜型冬油菜是該地區(qū)唯一能夠安全越冬的冬油菜類型, 分離和克隆基因?qū)γ鞔_白菜型冬油菜在低溫脅迫反應(yīng)中的響應(yīng)機(jī)制及抗寒機(jī)理具有重要意義。本研究應(yīng)用2-DE技術(shù), 得到低溫誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白-類甜蛋白, 進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析, 以全面了解該基因在白菜型冬油菜隴油7號(hào)中的生物學(xué)功能, 為培育新的抗寒品種以及轉(zhuǎn)基因抗寒冬油菜的探究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)(超強(qiáng)抗寒)和天油2號(hào)(弱抗寒性)為供試材料, 選取籽粒飽滿、大小一致的油菜種子, 用10%過氧化氫處理30 min, 無菌水沖洗2~3次, 置鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)催芽(光照14 h, 30°C, 黑暗10 h, 28°C), 待種子露白后, 播于裝有育苗基質(zhì)的花盆(14 cm × 13 cm), 每盆4株幼苗, 于人工培養(yǎng)箱中(光照14 h, 25°C, 黑暗10 h, 20°C)培養(yǎng)至六葉期。選取生長健壯的幼苗進(jìn)行低溫脅迫處理, 先將油菜幼苗于4°C培養(yǎng)4 d, 繼而轉(zhuǎn)入–4°C超低溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d, 最后置–8°C繼續(xù)培養(yǎng)4 d, 每一低溫處理后, 取幼嫩葉片冷凍保存?zhèn)溆? 以未低溫處理的植株為對(duì)照(CK), 取低溫處理及對(duì)照葉片提取總蛋白和總RNA。

1.2 白菜型冬油菜葉片蛋白質(zhì)篩選與分析

1.2.1 總蛋白提取與蛋白質(zhì)濃度測定 采用TCA-丙酮沉淀法[20]提取冬油菜葉片總蛋白, 用Bradford[21]法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 蛋白質(zhì)雙向電泳 對(duì)低溫脅迫處理組(4°C)和對(duì)照(CK), 使用17 cm的IPG膠條, 按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊說明, 樣品上樣量為900mg, 將樣品與水化液按體積比1∶4混勻, 總體積不超過500mL, 按表1程序進(jìn)行第一向?qū)щ娋劢闺娪? 采用12%酰胺凝膠進(jìn)行第2向SDS-PAGE, 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后通過UMAX的Powerlook 2100XL掃描采集圖像, 用PDQuest 8.0分析軟件對(duì)凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理, 蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì), 確定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

1.2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定 對(duì)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)回收、酶解[22], 送往上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照天根試劑說明書提取總RNA, 電泳檢測后按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 得到單鏈cDNA, 測定其濃度后, 置–20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與基因克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的白菜型油菜基因的核苷酸序列, 利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物, TLP-F: 5′-GCTCAAGTGGAGCTCGATCA-3′, TLP-R: 5′-A GGATTTTGCATTTCAAGAGTGT-3′, 按照十字花科首位序列上設(shè)計(jì), 可擴(kuò)增出編碼區(qū)全序列。以未經(jīng)低溫處理的隴油7號(hào)葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 利用引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序?yàn)橐?4.0°C 5 min; 94.0°C 30 s, 57.0°C 30 s, 72.0°C 78 s, 循環(huán)35次; 72°C 10 min; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 利用天根生化科技(北京)有限公司的普通瓊脂糖凝DNA純化回收試劑盒回收目的條帶。將回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞, 過夜培養(yǎng), 藍(lán)白斑篩選, 挑白斑進(jìn)行菌液培養(yǎng)。PCR檢測菌落后, 隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆送華大基因股份公司(北京)股份有限公司測序。

表1 等電聚焦電泳程序

1.5 TLP預(yù)測蛋白的生物信息學(xué)分析

利用Protparam工具(http://www.expasy.org/tools/ protparam.html) 分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì); 采用TMpred Server軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html) 預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu); 利用SignalP4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dkrvices/ SignalP/)預(yù)測蛋白的信號(hào)肽; 利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); 采用NCBI中CD-Search工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守結(jié)構(gòu)域; 利用PSORT軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測基因編碼蛋白的亞胞定位。

利用Blast從GenBank中挑選了6個(gè)來源于十字花科植物的基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列, 依次為甘藍(lán)型油菜(XM_013786360)、甘藍(lán)(XM_013728170)、亞麻薺(XM_010461134)、擬南芥(NM_101683)、薺菜(XM_006303251)、琴葉擬南芥(XM_002892944)、白菜(FJ605478); 利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和氨基酸同源性分析; 采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 白菜型冬油菜在低溫脅迫下的表達(dá)量

根據(jù)白菜型油菜的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物TLP-S (5'-GCAACGGGAAACGGGTGTT-3')和TLP-A (5'-AGCGACCTTGAAGATTCTGGAGT-3')。以濃度一致的隴油7號(hào)和天油2號(hào)葉片cDNA (不同低溫處理及對(duì)照)為模板,(Act-F: 5'-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT- 3'; Act-R: 5'-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3')為內(nèi)參, 進(jìn)行熒光定量和半定量PCR。半定量RT-PCR采用同機(jī)分管擴(kuò)增內(nèi)參基因和目的基因, 電泳檢測基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)模式, PCR擴(kuò)增程序同上, 退火溫度為60°C。參考SYBR Premix ExII (TliRNaseH Plus)試劑盒(大連TaKaRa公司)的熒光定量PCR, 采用兩步法, 擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 30 s; 95°C 5 s, 60°C 34 s, 40個(gè)循環(huán); 95°C 15 s, 60°C 1 min, 95°C 15 s。96孔上樣板目的基因與內(nèi)參基因?qū)?yīng)各3次重復(fù), 操作時(shí)避免強(qiáng)光照射。采用2–ΔΔCT方法計(jì)算, 即ΔCT(目的基因)=CT(目的基因)–CT(內(nèi)參基因); ΔΔCT(目的基因)=處理組(ΔCT目的基因)–對(duì)照組(ΔCT目的基因), 相對(duì)表達(dá)量(Relative quantification)=2–ΔΔCT(目的基因)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫前后白菜型冬油菜差異蛋白篩選

使用PDQuest 8.0軟件分析2-DE考染圖(圖1-A, 圖1-B), 進(jìn)行自動(dòng)匹配, 并結(jié)合肉眼觀察及手動(dòng)調(diào)整, 共檢測到600多個(gè)可重復(fù)的蛋白點(diǎn), 其中新誘導(dǎo)表達(dá)蛋白點(diǎn)10個(gè), 植物由正常溫度突然轉(zhuǎn)到一個(gè)低溫環(huán)境中, 隨著脅迫時(shí)間的延長, 植物本身的逆境應(yīng)答機(jī)制會(huì)有響應(yīng), 一些新的蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)(圖1-B中1-10, 圖2), 這表明在正常條件下這些蛋白豐度較低或不表達(dá), 而在低溫脅迫下才表達(dá)發(fā)揮功能, 使植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化, 進(jìn)而使植物耐受或抵御低溫環(huán)境的脅迫。

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及功能分類

切取低溫脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)的10個(gè)蛋白點(diǎn)(圖1, 點(diǎn)1~點(diǎn)10), 用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解, 經(jīng)MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索(表2), 最后鑒定出7個(gè)蛋白點(diǎn)(表2)。

2.3基因克隆

2.4 白菜型油菜基因編碼蛋白質(zhì)的特性分析

利用NCBI的ORF Finder程序?qū)ふ议_放閱讀框, 顯示白菜型冬油菜的cDNA序列含有一個(gè)長度為732 bp的完整開放ORF, 編碼含243個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì), 與其他十字花科基因組數(shù)據(jù)庫編碼區(qū)序列一致, 起始密碼子為 ATG, 終止為密碼子為TAA。應(yīng)用Protparam預(yù)測基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì), 表明白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)TLP蛋白由20種氨基酸組成, 其中以Gly、Ser、Ala所占比例最高, 分別為10.7%、9.1%和9.1%; 含有酸性氨基酸(D、E)10個(gè), 堿性氨基酸(K、R) 23個(gè), 疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V) 78個(gè), 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y) 82個(gè), 帶電荷的氨基酸(R、K、H、Y、C、D、E) 64個(gè); 相對(duì)分子質(zhì)量約26.022 kD, 理論等電點(diǎn)為9.15; 預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為52.78, 是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)不穩(wěn)定); 總平均疏水指數(shù)(grand average ofhydropathicity, GRAVY)為–0.021, 表明該蛋白為親水性蛋白(圖3)。

A: 對(duì)照; B: 4°C處理。A: control; B: treatment of 4°C.

A: 對(duì)照; B: 4°C處理。A: control; B: treatment of 4°C.

表2 特異蛋白點(diǎn)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定結(jié)果

上游的起始密碼子ATG用方框表示: *為終止密碼TAA的位置。

An upstream in-flame start codon ATG is boxed; * indicates the positions of termination codon.

預(yù)測顯示, 白菜型油菜TLP存在2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu), 1~26位氨基酸為由內(nèi)向外螺旋, 9~26位氨基酸為由外向內(nèi)螺旋(圖4)。用在線工具SignalP4軟件分析隴油7號(hào)TLP蛋白的N-末端信號(hào)肽序列(圖5), 說明該蛋白為一個(gè)信號(hào)多肽, 第20~第21個(gè)氨基酸為最可能的信號(hào)肽斷裂點(diǎn)。

用在線工具S0PMA對(duì)白菜型冬油菜TLP酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測, 結(jié)果顯示(圖6), 該酶蛋白包含12.76% α螺旋(alpha helix)、45.27%無規(guī)則卷曲(random coil)、27.57%延伸鏈(extended strand)和14.40% β轉(zhuǎn)角(beta turn)。

應(yīng)用NCBI CCD數(shù)據(jù)庫對(duì)TLP保守序列進(jìn)行預(yù)測, 發(fā)現(xiàn)該酶蛋白屬于糖苷水解酶家族64和類甜蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域, 在酶蛋白第22~238位氨基酸之間存在保守結(jié)構(gòu)域(圖7), 它們是一種主要參與宿主防御和抵御真菌的酶。

2.5 白菜型油菜TLP氨基酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)一步分析TLP蛋白親緣關(guān)系表明(圖8), 白菜型油菜與其他十字花科植物TLP酶蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以大致分為2類。白菜型油菜()、甘藍(lán)型油菜()、甘藍(lán)()和大白菜(subsp. Pekinensis)為同一亞族, 屬于蕓薹屬; 擬南芥()和琴葉擬南芥()同屬于鼠耳芥屬, 亞麻薺()、薺菜()分別為亞麻薺屬和薺屬?？梢姴煌参锏腡LP系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有明顯的種屬特征。

豐田紡織擁有強(qiáng)大的技術(shù)儲(chǔ)備，并致力于在電池技術(shù)上實(shí)現(xiàn)突破。在過濾器制造過程中，用于處理微細(xì)纖維的技術(shù)其實(shí)也可以用于在鋰電池的隔膜上?；诖思夹g(shù)，豐田紡織開發(fā)了一種無紡布型分離器，與常見的隔膜相比，具有三維結(jié)構(gòu)的無紡布多孔結(jié)構(gòu)在鋰離子通過隔板時(shí)容易保持較低的離子電阻。極大地提高了鋰電池的功率密度。豐田紡織開發(fā)的電池單元是層壓型，容量約為15Wh。將數(shù)十個(gè)電池單元組合成模塊，再有多個(gè)模塊組合成電池包。該產(chǎn)品的最大特點(diǎn)是輸出密度高，其輸出密度是普通混合動(dòng)力汽車（HEV）電池輸出密度的1.5～2倍。

藍(lán)色: α螺旋; 紫色: 無規(guī)則卷曲; 紅色; 延伸鏈; 綠色: β轉(zhuǎn)角。

Blue: alpha helix; Purple: random coil; Red: extended strand; Green: beta turn.

白菜型冬油菜隴油7號(hào)與天油2號(hào)的TLP蛋白相似性為98.77%, 與其他十字花科植物蛋白相似性比較結(jié)果顯示(圖9), 該蛋白與甘藍(lán)型油菜()的TLP蛋白完全相似, 與甘藍(lán)()、亞麻薺()、擬南芥()、薺菜()、琴葉擬南芥()、白菜(subsp. Chinensis)的同源蛋白也具有較高的相似性, 達(dá)到89%~98%。

2.6 低溫脅迫下基因的表達(dá)分析

半定量RT-PCR技術(shù)分析表明, 溫度為 4°C時(shí),基因表達(dá)最強(qiáng), 隨著溫度繼續(xù)降低, 該基因表達(dá)量逐漸下降(圖10)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明(圖11), 低溫脅迫下, 隴油7號(hào)和天油2號(hào)的表達(dá)量在4°C明顯上調(diào)并達(dá)峰值, 分別較CK增加了347.6%和92.7%, 隨后在–4°C該基因表達(dá)量逐漸下降, 分別為CK的74.7%和37.8%, 在–8°C時(shí), 兩品種的持續(xù)下調(diào)表達(dá), 與CK處于同一轉(zhuǎn)錄水平。在同處理溫度下, 抗寒性弱的天油2號(hào)相對(duì)表達(dá)量低于抗寒性強(qiáng)的隴油7號(hào), 說明在低溫脅迫下發(fā)揮著重要作用。

3 討論

類甜蛋白TLP起源古老, 在漫長的進(jìn)化歷程中, 不斷發(fā)生基因復(fù)制事件。因此, 類甜蛋白TLP具有多種生物學(xué)功能。本研究從白菜型冬油菜中克隆了基因的cDNA序列, 該基因由732個(gè)核苷酸序列組成, 編碼243個(gè)氨基酸, 屬于親水性蛋白, 擁有完整的閱讀框(ORF), 具有GH69-TLP–SF超級(jí)家族特有的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域, 該基因與十字花科的甘藍(lán)型油菜、白菜等氨基酸序列具有極高的相似性, 具有二硫鍵功能位點(diǎn), 無規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)窃摰鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件, 包麗媛等[23]的研究也得到類似結(jié)果。前人的研究發(fā)現(xiàn), TLPs最為重要的結(jié)構(gòu)特征在于其分子中由16個(gè)半胱氨酸殘基配對(duì)形成的8個(gè)二硫鍵, 由于這些二硫鍵的存在, 使得TLPs具有相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu), 具有抗酶解和抗酸堿的功能, TLPs分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)一般由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 結(jié)構(gòu)域Ⅰ由1個(gè)β片層(β-sheet)反向平行折疊形成, 再由α螺旋區(qū)域構(gòu)成, 該結(jié)構(gòu)域具有抗真菌活性[28]。

TLP具有抗凍活性的特性最早發(fā)現(xiàn)于寒冷地帶的苦茄中, 寒冷條件下可誘導(dǎo)植物體內(nèi)基因的表達(dá)與積累[24], 并可在組織細(xì)胞中出現(xiàn)增強(qiáng)的類甜蛋白, 從而增強(qiáng)植物整體抵御凍害的能力。Hiilovaara-Teijo等[25]研究發(fā)現(xiàn), 冬黑麥葉片質(zhì)外體在低溫誘導(dǎo)下分泌的類甜蛋白, 其抗凍活性與抗凍蛋白相同。此外, TLP還具有多種滲調(diào)蛋白(Osmotin)和類滲調(diào)蛋白(OLP)的特性, 而這2種蛋白都與抗逆功能有關(guān)[26]。低溫下, 植物的抗凍蛋白和冷誘導(dǎo)蛋白會(huì)直接或間接地調(diào)節(jié)酶或通過信號(hào)傳導(dǎo)等一系列溫度適應(yīng)來調(diào)節(jié)植物的抗寒性[29]。

張計(jì)育等[4]研究表明, 200 mmol L–1的NaCl和4°C低溫處理誘導(dǎo)了基因的表達(dá)。本研究初期, 利用雙向電泳技術(shù)篩選出了4°C低溫脅迫下響應(yīng)抗寒機(jī)制的關(guān)鍵蛋白-類甜蛋白, 說明基因參與調(diào)控冬油菜對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)性響應(yīng)。本研究中, 最初4°C低溫處理可增強(qiáng)葉片基因的表達(dá)量, 隨著脅迫溫度的繼續(xù)降低, 葉片中該基因表達(dá)量下降, –8°C時(shí), 表達(dá)量與CK處于同一水平。其原因可能是最初的降溫導(dǎo)致冬油菜葉片對(duì)低溫的應(yīng)激反應(yīng), 誘導(dǎo)基因的表達(dá)與積累, 而后由于繼續(xù)零下低溫脅迫, 使得葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到不可逆的損傷, 抗寒能力下降,基因的表達(dá)量急劇下降并與CK處于同一水平。這與實(shí)際生產(chǎn)中冬油菜的生長習(xí)性相一致(–2°C低溫下冬油菜地上部分抗寒能力開始下降, –8°C時(shí)進(jìn)入枯葉期)。以上這些結(jié)果表明,基因在冬油菜響應(yīng)低溫脅迫提高自身抗寒性中起著重要作用。

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Selection and Cloning of Thaumatin-like Protein (TLP) Gene from Winterand Its Expression under Low Temperature Stress

MA Li1,**, YUAN Jin-Hai1,**, SUN Wan-Cang1,*, LIU Zi-Gang1, ZENG Xiu-Cun2, WU Jun-Yan1, FANG Yan1, LI Xue-Cai1, CHEN Qi1, XU Yao-Zhao2, PU Yuan-Yuan1, LIU Hai-Qing1, YANG Gang1, and LIU Lin-Bo1

1Gansu Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement / Rapeseed Engineering Research Center of Gansu Province / College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2College of Agronomy and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China

Thaumatin-like protein (TLP) is an essential protein induced by low temperature stress and enhances plant resistance to adverse circumstances. In our study, we selected differential protein spots from Longyou 7 leaves under low temperature stress and separated TLP closely related to cold resistance by using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Using the primers ofcDNA sequences and reverse transcription PCR (RT-PCR), we cloned the complete open reading frame ofgene of wintercultivar Longyou 7. The sequence length offromwas 732 bp, encoding a protein of 243 amino acid residues with a predicted molecular weight of 26.02 kD and a theoretical pI of 9.02. Bioinformatics analysis showed a similarity of 99.18% in TLP amino acid sequence betweenand, the predicted TLP contained a conserved amino acid sequence belonging to the plant GH69-TLP-SF superfamily. The TLP had one signal peptide which belongs to hydrophilic protein. Moreover, the detection of subcellular localization suggested the synthetic process of this protein is in the endoplasmic reticulum. The prediction of the second structures indicated that TLP is a labile protein consisting of random coils and extended strands. The expression analysis ofgene by utilizing real time and Semi-quantitative RT-PCR suggested that theexpression could be up-regulated in response to lower temperature. In conclusion,gene of the wintercultivar Longyou 7 might play a significant role in response to cold stress.

Winter; Two-dimensional gel electrophoresis; Lower temperature; TLP

10.3724/SP.J.1006.2017.00620

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460356, 31560397), 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃) (2015CB150206), 國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014G10000317), 甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(145RJZG050), 科技部油菜雜種優(yōu)勢利用技術(shù)與強(qiáng)優(yōu)勢雜交種創(chuàng)制項(xiàng)目(2016YFD0101300)和絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶新疆核心區(qū)農(nóng)田周年覆蓋高效種植模式研究與示范項(xiàng)目(2016E02009)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-13), the National Natural Science Foundation of China (31460356, 31560397), the National Basic Research Program of China (973 Program) (2015CB150206), the Natural Science Foundation of Gansu Province (145RJZG050), the part of National Key Research and Development Program (2016YFD0101300), and the Research and Demonstration Project of High Efficient Planting Pattern in the Core Area of the Silk Road Economic Zone in Xinjiang (2016E02009).

孫萬倉, E-mail:18293121851@163.com, Tel: 18293121851

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

馬驪, E-mail: 348369277@qq.com, Tel: 18189560623; 袁金海, E-mail:954152476@qq.com

2016-01-19;

Accepted(接受日期): 2016-11-03;

Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2016-12-14.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20161214.1605.002.html