肖艷華 陳新龍 杜 丹 邢亞迪 張?zhí)烊?祝毛迪 劉明明 朱小燕 桑賢春 何光華

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水稻葉片淀粉積累及早衰突變體的鑒定與基因定位

肖艷華**陳新龍**杜 丹 邢亞迪 張?zhí)烊?祝毛迪 劉明明 朱小燕 桑賢春 何光華*

西南大學水稻研究所 / 轉基因植物與安全控制重慶市重點實驗室, 重慶 400716

利用EMS誘變秈型三系保持系西農1B, 獲得了一個新的水稻葉片淀粉過度積累而導致的早衰突變體()。該突變體苗期葉片呈淡綠色, 分蘗期開始除心葉外的葉片從葉尖開始黃化衰老, 逐漸延伸至葉中上部, 基部保持綠色, 該性狀一直持續(xù)到成熟。與野生型相比,葉片光合色素含量下降, O2￣、·OH和H2O2等活性氧含量上升, 保護酶系統(tǒng)中SOD和CAT活性降低。組織化學分析表明,葉片中積累了大量的淀粉顆粒, 淀粉含量顯著上升; qRT-PCR結果顯示, 淀粉合成途徑相關基因上調, 磷酸丙糖(TP)分配途徑基因下調, 推測基因突變可能改變了TP的分配途徑, 導致葉片過度積累淀粉, 破壞葉綠體結構, 光合系統(tǒng)受阻, 活性氧增多, 引起葉片黃化衰老。遺傳分析表明該突變體受一對顯性核基因調控,位于第11染色體標記S11-110與S11-87之間, 物理距離為304.9 kb, 這為進一步基因克隆和功能研究奠定了基礎。

水稻(L); 早衰; 淀粉積累; 遺傳分析; 基因定位

衰老是植物生命活動自然結束的衰退過程, 是植物發(fā)育過程中必然經(jīng)歷的生命現(xiàn)象, 在農業(yè)生產(chǎn)中, 早衰現(xiàn)象普遍存在, 給農作物生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量都造成重大損失。植物早衰主要表現(xiàn)為葉片黃化、枯萎、籽粒灌漿不足、千粒重下降及結實率降低等[1]。水稻是重要的糧食作物及單子葉模式植物, 因此, 對其葉片衰老的物質形態(tài)、生理生化及基因克隆的研究在水稻的遺傳改良和衰老機制調控等方面都有著十分重要的意義。

克隆衰老相關基因(senescence-associated genes, SAG)對通過分子育種手段提高水稻品質和產(chǎn)量至關重要, 采用圖位克隆、抑制差減雜交等方法, 已經(jīng)獲得了大量的SAGs。編碼堿性半乳糖苷酶, 對α-1,6半乳糖和雙半乳糖二?；视投加泻芎玫乃庑? 在葉綠體半乳糖脂降解過程中起重要作用[2];編碼一個CCCH-Type鋅指蛋白, 其功能喪失可促進葉片衰老, 過量表達則延緩葉片衰老[3]。目前, 水稻中已經(jīng)鑒定出不少的早衰突變體, 已完成分子定位的有[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]等。但通過圖位克隆得到的早衰基因并不多,編碼一個Ca2+/CaM依賴型蛋白激酶, 參與葉片中ABA誘導的抗氧化防護過程, 其功能缺失會引起H2O2過量積累, 導致葉片衰老[13];編碼一個具有NB-ARM結構域的蛋白, 參與葉綠體的降解, 引發(fā)快速衰老[14];編碼一個包含泛素結合結構域的蛋白, 其功能缺失促進植株對磷酸鹽(Pi)的吸收和轉運, 導致地上部Pi的過量積累, 致使葉尖枯死, 植株衰老[15];編碼一個過氧化氫酶OsCATC, 其功能缺失會引起植株體內H2O2大量積累, 激活硝酸還原酶并促發(fā)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生, 誘導葉片細胞死亡, 引起衰老[16];編碼一個網(wǎng)格相關受體蛋白復合體亞基(AP1M1), 定位于高爾基體, 參與調控高爾基體的物質運輸途徑和囊泡運輸, 功能缺陷造成水稻過敏性反應, 葉片表現(xiàn)出類病斑, 植株早衰[17]。

目前已報道的早衰突變體均未發(fā)現(xiàn)葉片淀粉大量積累的現(xiàn)象, 也未發(fā)現(xiàn)由于葉片淀粉積累導致植株衰老。在植物中, 淀粉存在兩種形式: 儲藏型淀粉和過渡型淀粉, 葉片淀粉屬于過渡型淀粉。植物白天光合作用剩余磷酸丙糖以過渡型淀粉暫時儲存在葉片的葉綠體中, 夜晚則分解為葡萄糖和麥芽糖, 從葉綠體運輸?shù)郊毎|基質, 用于合成蔗糖及維持植物的代謝生長[18]。如果淀粉代謝過程出現(xiàn)問題, 便會導致葉片中過渡型淀粉積累, 破壞類囊體結構, 光合作用受阻, 直接影響光合作用[19], 引起葉片衰老。目前, 對擬南芥淀粉代謝途徑研究得較為透徹, 水稻中也已克隆一些淀粉降解相關基因,[20]編碼葡聚糖水合雙激酶, 是葉片淀粉降解途徑的第一個關鍵酶, 作用于淀粉使其磷酸化, 其突變會導致葉片中淀粉過量積累;[21]編碼異淀粉酶, 用于水解支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵, 在葉片淀粉降解過程中位于OsGWD的下游, 作用于磷酸化的淀粉, 釋放出磷酸葡聚糖, 其功能缺陷會引起淀粉積累。

本研究通過EMS誘變保持系西農1B, 獲得了一個新的早衰突變體, 定位于第11染色體, 與已經(jīng)報道的衰老基因均不等位。該突變體苗期葉片呈淡綠色, 分蘗期開始葉尖變黃, 黃化逐漸擴展至葉中上部, 但基部仍保持綠色, 該性狀一直持續(xù)到成熟期, 直至生理衰老整個葉片變黃。與已往報道的早衰突變體不同的是,葉片中積累了大量的淀粉顆粒, 推測由于淀粉積累導致葉片衰老。本研究對該突變體進行了表型鑒定、生理生化及組織化學分析、相關基因表達分析、基因初步和精細定位, 為該衰老基因的克隆及其調控機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用EMS誘變秈型保持系西農1B, 從誘變群體中鑒定出一個葉片淀粉積累及早衰突變體, 經(jīng)過連續(xù)多代自交, 突變性狀穩(wěn)定遺傳。56S是一個表型正常的秈型低溫敏兩系不育系, 以56S為母本,為父本, 配制雜交組合, 利用其F1和F2分離群體進行遺傳分析, 并用F2中的隱性單株進行基因定位。

1.2 農藝性狀調查

田間種植野生型及各30株, 株行距25 cm × 30 cm, 重復3次, 成熟期分別隨機取野生型和各10株, 考查株高、穗長、有效穗、每穗粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重、結實率、一次枝梗數(shù)等主要農藝性狀。

1.3 光合色素含量及生理指標測定

分別在苗期和分蘗期測定光合色素含量。由于突變體苗期表型不明顯, 測定時將倒一至倒四葉混合稱量; 分蘗期分別測定倒一葉、倒二葉、倒三葉、倒四葉。參照文獻[22], 將0.1 g左右的待測樣品剪成2~3 mm的小塊, 浸于25 mL丙酮∶乙醇(1∶1, v/v)混合液中, 黑暗處理24~48 h。用BECKMAN COULTER-DU720型分光光度計測定萃取液在663 nm、645 nm和470 nm波長下的吸光值, 每組取3份樣品, 每份樣品重復測量3次。最后, 按Lichtenthaler等修正的Arnon法[23]計算葉片光合色素含量, 并取其平均值。

分蘗期分別取野生型和突變體新鮮葉片, 用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒, 參考其說明書, 測定過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性及過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2￣)和羥自由基(·OH)含量, 每個指標分別測定3次, 取其平均值。

1.4 細胞學觀察

分蘗期取野生型和突變體倒二葉制作冷凍切片, 利用Nikon DS-Fi1c熒光顯微鏡, 分別在白光和488 nm紫外光條件下觀察橫切面結構。

同時期, 參照文獻[24], 通過透射電鏡觀察野生型和突變體的葉肉細胞結構, 先用戊二醛和鋨酸雙重固定, 后用不同濃度的乙醇逐級脫水, 再置換和包埋, 制作超薄切片, 最后用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛液雙重染色, 利用H600型透射電鏡觀察并照相。

1.5 葉片碘-碘化鉀染色及淀粉含量測定

參照文獻[25], 將8.8 g碘化鉀加入30 mL預熱的雙蒸水, 緩慢攪拌, 待溶解后加入2.2 g結晶碘, 充分振蕩至完全溶解, 再用雙蒸水定容到1 L。從大田取回的材料放在丙酮∶乙醇(1∶1, v/v)混合液中24~48 h, 待完全脫色后, 用I2-KI染色, 約20 min后取出觀察照相。

同時期先將葉片剪碎并研磨至粉末, 參照BioAssay Systems公司生產(chǎn)的試劑盒ESTA-100說明書, 稱量0.03 g左右, 測定野生型和突變體的葉片淀粉含量, 每個樣品重復5次。

1.6 DNA、總RNA的提取及quantitative Real- time PCR

采用改良的CTAB法[26]提取親本、基因池及F2群體DNA。

使用天根生化科技(北京)有限公司植物總RNA提取純化試劑盒提取分蘗期野生型和相同部位葉片組織總RNA。反轉錄試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)由TaKaRa生物公司生產(chǎn)。以基因為內參基因, 在Applied Biosystems公司7500 Real-time PCR儀上擴增, 按2–ΔΔCT方法分析基因的相對表達量, 重復3次。

1.7 遺傳分析及分子標記分析

將秈型不育系56S與雜交, F1自交得F2分離群體, 根據(jù)F1和F2表型進行遺傳分析。選擇F2中的隱性群體進行基因定位。采用BSA法[27], 分別取F2中正常表型株和突變表型株各10株的DNA等量混合, 構成正?；虺睾屯蛔兓虺亍⒄説ttp://www.gramene.org/microsat設計SSR和InDel分子標記序列, 對兩個供試親本(56S和)進行多態(tài)性分析, 然后利用多態(tài)性標記分析兩池間的多態(tài)性, 找出可能與目標基因連鎖的標記。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR體系為12.5 μL, 包括1.0 μL模板DNA、1.0 μL 10 μmol L–1引物、0.5 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、1.25 μL 10×PCR buffer、0.75 μL 25 mmol L–1MgCl2、7.9 μL ddH2O和0.1 μL 5 U μL–1rDNA聚合酶。PCR程序為94℃預變性5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 再72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[28], 銀染顯色后, 觀察記錄擴增條帶并照相。

1.8 遺傳圖譜的構建

在F2定位群體中, 將具有56S帶型的單株記為, 具有帶型的單株記為, 具有56S/F1雜合帶型的單株記為。利用軟件MapMaker 3.0, 對定位群體進行連鎖數(shù)據(jù)分析, 繪制遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)及農藝性狀

在自然生理衰老前, 野生型西農1B的葉片一直保持綠色。的葉片在苗期呈淡綠色(圖1-A), 分蘗期除心葉外的葉片逐漸從葉尖開始黃化衰老(圖1-B), 并逐漸擴展至葉中上部, 基部保持綠色(圖1-C), 該性狀一直持續(xù)到成熟, 并且分蘗數(shù)減少(圖1-D), 成熟時一次枝梗數(shù)減少(圖1-E), 結實率明顯降低。

的株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重、結實率及一次枝梗數(shù)均有所降低, 除株高、穗長和千粒重顯著下降外, 其余均極顯著下降, 尤其是每穗實粒數(shù), 僅為野生型的17.35% (表1)。表明葉片早衰對突變體農藝性狀特別是產(chǎn)量性狀有消極影響。

表1 野生型(WT)和突變體esl9農藝性狀

*表示在0.05水平上差異顯著;**表示在0.01水平上差異顯著。

*Significant difference at<0.05 by-test;**significant difference at<0.01 by-test.

A: 苗期野生型(WT)和突變體植株; B: 分蘗期野生型(WT)和突變體植株; C: 分蘗期野生型倒二葉(W2)和突變體倒二葉(); D: 成熟期野生型(WT)和突變體植株; E: 成熟期野生型(WT)和突變體主穗。

A: plants of wild-type (WT) andat seedling stage; B: plants of wild-type (WT) andat tillering stage; C: the second upper leaves of wild-type (WT) andat tillering stage; D: plants of wild-type (WT) andat maturity; E: main panicles of wild-type (WT) andat maturity.

2.2 光合色素含量

與野生型相比, 在苗期,除類胡蘿卜素含量極顯著降低外, 葉綠素和葉綠素均顯著降低(圖2-A); 在分蘗期, 野生型與突變體不同部位葉片色素含量差異不一致, 新生葉片和最老的葉片差異較小, 而剛成熟葉片差異較大,倒一葉的葉綠素含量及倒四葉各項光合色素含量顯著降低, 其余部位各種色素含量均極顯著降低(圖2-B), 其中倒二葉的下降幅度最大, 其葉綠素、葉綠素、類胡蘿卜素及總葉綠素含量分別僅為野生型的43.75%、48.75%、44.36%和44.32%。倒一葉、倒三葉和倒四葉的葉綠素含量分別為野生型的60.72%、55.68%和74.20%, 葉綠素含量分別為野生型的82.07%、60.36%和75.91%, 類胡蘿卜素含量分別是野生型的57.81%、59.15%和72.85%。

2.3 細胞學觀察

采用冷凍切片技術, 對野生型和突變體的相同對應部位葉片的葉肉細胞結構進行觀察(圖3-A, B)。在白光條件下, 野生型呈嫩綠色, 而呈棕黃色(圖3-C, D), 表明突變體中葉綠體結構已破壞。在488 nm紫外條件下, 野生型葉肉細胞呈紅色(圖3-E, G), 這是由于葉綠體不吸收紅光, 反射后即呈紅色熒光; 而不呈紅色(圖3-F, H), 表明葉肉細胞中葉綠體破壞, 光合色素降解, 這與光合色素含量測定結果相符。同時, 透射電鏡結果顯示, 與野生型相比, 突變體的葉肉細胞內充斥著過多的淀粉顆粒。

2.4 生理指標

CAT、SOD和POD是植物細胞膜酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶, 用于清除活性氧自由基。植物葉片在衰老過程中, 保護酶活性的改變引起細胞內活性氧代謝平衡破壞。細胞內過多的活性氧可直接破壞細胞膜結構, 引起細胞死亡, 導致衰老。因此, 這些保護酶的活性及活性氧的含量變化常被作為植物衰老的判斷依據(jù)[29]。

與野生型相比,中CAT和SOD活力均不同程度降低, CAT活力顯著降低(圖4-A), SOD極顯著降低(圖4-B), 僅為野生型的48.25%。POD活性在中略微升高, 但未達到顯著水平(圖4-C)。的活性氧H2O2、O2￣和·OH含量分別是9.26 mmol g–1protein、216.72 U g–1FW和199.17 U mL–1, 與野生型的5.91 mmol g–1protein、150.18 U g–1FW和147.20 U mL–1相比, 均極顯著升高, 分別上升了56%、44%和35% (圖4-D~F)。說明突變體由于保護酶活力的降低, 導致細胞內活性氧不能及時被清除, 從而加劇葉片的衰老。

A: 苗期野生型(WT)和突變體的光合色素含量; B: 分蘗期野生型(WT)和突變體倒一至倒四葉的光合色素含量。*表示在0.05水平差異顯著; **表示在0.01水平差異顯著。

A: photosynthetic pigment contents of wild-type (WT) andat seedling stage; B: photosynthetic pigment contents of the first, second, third and fourth leaves of wild-type (WT) andat tillering stage. * Significant difference at<0.05 by-test; ** significant difference at< 0.01 by-test.

A, B: 野生型(WT)和突變體倒二葉; C, D: 白光下野生型(WT)和突變體葉片橫切面(A和B中白框部位); E, F: 488 nm紫外光下野生型(WT)和突變體葉片橫切面; G, H: 488 nm紫外光下野生型(WT)和突變體局部(E和F中白框部位)放大橫切面; I, J:透射電鏡下野生型(WT)和突變體葉片細胞結構(箭頭所指表示淀粉顆粒, Bar=2 μm)。C、E、G和I代表野生型(WT); D、F、H和J代表突變體。圖C、D、E和F中, Bar=10 μm; 圖G和H中, Bar=25 μm。

A, B: the second leaves of wild-type (WT) and; C, D:transverse sections of leaves in wild-type (WT) andunder white light (the white boxes of A and B); E, F: transverse sections of leaves in wild-type (WT) andunder UV light at 488 nm; G, H: magnified view of boxed area of E and F, respectively; I, J: cell structure of leaves in wild-type (WT) andunder transmission electron microscope(starch granules showed by the arrow, bar=2 μm). Thecell structures of wild-type (WT) andwere showed in Figs. C, E, G, I, and in Figs. D, F, H, J, respectively. Bar=10 μm in the Figs. C, D, E, and F; bar=25 μm in the Figs. G and H.

2.5 淀粉含量

分蘗期分別對野生型和葉片進行碘-碘化鉀染色, 野生型和經(jīng)過白天光合作用, 18:00時多余的磷酸丙糖合成淀粉儲存在葉片, 均被染成藍色(圖5-A); 6:00時野生型的葉片淀粉經(jīng)過一夜幾乎完全分解, 而中不同部位葉片的淀粉分解情況不同, 倒二葉中還有大量淀粉積累, 倒三葉中也有少量積累, 但心葉則沒有淀粉積累(圖5-B)。進一步測定倒二葉淀粉含量表明,葉片晚上和早上淀粉含量均極顯著高于野生型, 但突變體早上含量低于晚上, 說明該部位葉片的淀粉存在一個積累過程, 晚上也能分解, 但不能完全分解, 多余的淀粉逐漸積累并最終導致過度積累(圖5-C)。

2.6 淀粉代謝相關基因的表達

葉片淀粉代謝途徑相關基因定量分析表明, 與野生型相比,中編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的幾個同工酶、、和表達量均不同程度上調, 其中、和達到極顯著水平,達到顯著水平; 磷酸丙糖轉運途徑基因和(均編碼磷酸丙糖轉運載體)表達量均極顯著下調; 淀粉分解途徑基因(編碼葡聚糖水合二激酶)、(編碼異淀粉酶)表達量上調(圖6), 引物序列見表2。說明光合初級產(chǎn)物磷酸丙糖(TP)的分配途徑可能發(fā)生了改變, 在水稻中, 多數(shù)TP是通過位于葉綠體膜上的TPT轉運到細胞質合成蔗糖, 多余的TP才在葉綠體中合成淀粉, 但在中, TP更多被用于合成淀粉, 雖然過多淀粉促進淀粉分解基因的表達, 但不足以完全分解淀粉, 結果造成淀粉的日積月累, 最終淀粉積累過多而破壞了葉綠體。

A: 過氧化氫酶(CAT)活力變化; B: 超氧化物歧化酶(SOD)活力變化; C:過氧化物酶(POD)活力變化; D: 過氧化氫(H2O2)含量變化; E: 超氧陰離子(O2￣)含量變化; F: 羥自由基(·OH)含量變化。*表示在0.05水平差異顯著; **表示在0.01水平差異顯著。

A: activity of catalase (CAT); B: activity of superoxide dismutase (SOD); C: activity of peroxidase (POD); D: content of H2O2; E: content of superoxide anion (O2￣); F: content of hydroxylradical (·OH). * Significant difference at<0.05 by-test; ** significant difference at< 0.01 by-test.

A: 分蘗期晚上野生型(WT)和突變體碘-碘化鉀染色(ED: end of day); B: 分蘗期早上野生型(WT)和突變體心葉至倒三葉碘-碘化鉀染色(EN: end of night); C: 分蘗期野生型(WT)和突變體倒二葉淀粉含量測定。*表示在0.05水平差異顯著; **表示在0.01水平上異顯著。

A: iodine-iodide kalium dyeing of wild-type (WT) andin the evening at tillering stage; B: iodine-iodide kalium dyeing of wild-type (WT) andin the morning at tillering stage; C: determination of starch contents of the second leaves of wild-type (WT) andat tillering stage. * Significant difference at<0.05 by-test; ** significant difference at< 0.01 by-test.

*表示在0.05水平差異顯著; **表示在0.01水平差異顯著。

* Significant difference at<0.05 by-test; ** significant difference at<0.01 by-test.

表2 淀粉代謝相關基因的定量引物

2.7 遺傳分析與基因定位

以56S和配制雜交組合, F1群體葉片均表現(xiàn)早衰黃化, F2群體中表現(xiàn)出明顯的性狀分離, 其中突變植株1941株, 正常植株596株, 經(jīng)卡方測驗, 其分離比例符合3∶1 (χ2=3.076 < χ20.05,1=3.84), 表明受一對顯性核基因的控制。

以F2中的596株隱性單株作為定位群體。選用平均分布于水稻12對染色體上的400對SSR引物對兩個親本進行多態(tài)性分析, 其中有80對表現(xiàn)出多態(tài)性。將這80對具有多態(tài)性的標記進一步對正?；虺睾屯蛔兓虺剡M行連鎖分析, 位于第11染色體上的RM6440和S11-26在2個基因池之間表現(xiàn)出多態(tài)性。利用F2群體中70株隱性單株進行驗證, 表明這2個標記與突變位點連鎖, 并將目的基因初步定位在RM6440和S11-26之間, 遺傳距離分別為25.35 cM和26.49 cM。在初步定位區(qū)間內進一步開發(fā)SSR標記和InDel標記, 共篩出6對標記在親本間呈現(xiàn)多態(tài)性, 分別是S11-32、S11-90、S11-110、ind11-1、S11-81、S11-87 (表3)。利用F2群體所有單株精細定位表明, S11-32處有12個交換株, S11-90處有4個, S11-110處有2個, ind11-1和S11-81處沒有交換株, S11-87處有3個, 其中, S11-110處的2個交換株包含在S11-90處的4個之中, 而這4個又包含在S11-32處的12個交換株中, 并且兩端標記S11-32和S11-87處的交換株之間不存在交叉。因此, 將最終定位在標記S11-110和S11-87之間, 物理距離為304.9 kb (圖7)。通過gramene和ricedata等網(wǎng)站預測, 該區(qū)間共有41個開放閱讀框, 其中14個編碼轉座子蛋白, 11個編碼逆轉座子蛋白, 9個編碼表達蛋白, 2個編碼托品酮還原酶II, 4個編碼富含亮氨酸重復家族蛋白, 1個編碼假定蛋白。

=70: 初步定位群體數(shù)目;=596: 精細定位群體數(shù)目。

=70: number of colony in primary mapping;=596: number of colony in fine mapping.

表3 新開發(fā)的SSR和InDel標記

3 討論

植物衰老是其生長發(fā)育必然經(jīng)歷的普遍現(xiàn)象, 是植物器官和個體生理機能自然衰退的過程。影響植物衰老的因素很多, 如外界環(huán)境中溫度、水分、空氣、光照及礦質營養(yǎng)的變化和激素的誘導均會加速或延緩衰老。從分子水平來看, 衰老相關基因的變異引起表達量的變化, 從而影響植物衰老[30]。

本研究中的突變體是一個新型的葉片淀粉積累及早衰突變體, 與已往報道的突變體有所不同。苗期黃化衰老;從抽穗前期到灌漿期結束, 倒四至心葉依次黃化衰老死亡;孕穗期葉尖和葉邊緣黃化衰老;苗期褐化衰老, 一直持續(xù)到成熟期;拔節(jié)期葉尖和葉邊緣黃化衰老;苗期葉片表現(xiàn)正常, 分蘗期呈黃綠色, 孕穗期開始葉中上部出現(xiàn)黃化;四葉期待心葉全展時葉尖開始黃化, 并逐漸擴展[4-5,7-11]。這些衰老突變體中均未發(fā)現(xiàn)或未報道葉片有過多淀粉積累的現(xiàn)象, 本研究中,苗期葉片呈淡綠色, 分蘗期除心葉外的葉片從葉尖開始黃化加深衰老, 逐漸擴展至葉中上部, 分蘗數(shù)減少, 植株矮化, 并且葉片中有大量淀粉積累。

葉片中的淀粉只是光合產(chǎn)物的一種暫時性儲存形式, 晚上不進行光合作用時便會分解[31]。然而, 在突變體中, 早上葉片中仍有大量淀粉積累。為了解淀粉在葉片中過多積累的原因, 我們對淀粉代謝相關基因作了定量分析, 發(fā)現(xiàn)淀粉合成基因在中過量表達, 分解基因的表達量也不同程度地升高。由此推測, 可能由于葉片中淀粉合成增加, 促進淀粉分解, 但是, 促進作用有限, 分解速率不及合成速率, 導致葉片中合成的淀粉仍不能完全降解, 故引起葉綠體中淀粉顆粒積累。過多的淀粉粒堆積在葉綠體內, 不僅會壓迫甚至損傷類囊體, 而且, 對光照會有遮擋作用, 直接阻礙光合膜對光的吸收, 導致光合系統(tǒng)受阻[32]。心葉由于光合作用較弱, 沒有形成過多的淀粉積累或者積累不足以破壞葉綠體, 而老葉片由于葉綠體已破壞導致光合產(chǎn)物減少、淀粉合成減少, 其余葉片特別是倒二葉光合作用最強, 淀粉合成大于分解, 因此, 這可能是倒二葉染色最深、其余葉片染色較淺的原因。

植物中, 葉綠體內光合作用電子傳遞鏈是活性氧產(chǎn)生的主要場所之一, 活性氧的爆發(fā)會導致葉片衰老[33]。本研究中,的活性氧O2￣、H2O2和·OH含量均顯著高于野生型。SOD作為O2￣的清除因子, 可以通過歧化作用將O2￣轉化為H2O2, 過多的H2O2被POD立即分解為完全無害的水[34]。然而, 與野生型相比,中SOD極顯著降低, 由此導致O2￣和H2O2不能被清除。同時, 過多的O2￣和H2O2可以反應生成·OH, 從而引起·OH在突變體中含量升高。細胞內CAT存在于線粒體和過氧化物酶體, 葉綠體中沒有CAT[35],中細胞CAT活性降低, 表明活性氧的積累也影響了細胞內呼吸作用等其他代謝過程。由此推測,由于葉片中過多的淀粉積累, 破壞了葉綠體結構, 導致植株吸收光能的效率降低, CO2固定途徑受阻, 此時, O2等便被作為電子受體, 形成O2￣, O2￣接著引發(fā)一系列的鏈式反應產(chǎn)生更多的H2O2和·OH[36]。這些活性氧的過多積累對植物有很大的毒害作用, 影響細胞內代謝過程, 引起膜脂過氧化作用, 導致細胞膜以及內膜系統(tǒng)損傷, 進一步引起細胞死亡[29], 導致植物衰老。

通過分子標記方法, 將基因定位在第11染色體上標記S11-110和S11-87之間, 該區(qū)間內包含41個注釋基因, 有9個編碼表達蛋白, 4個編碼富含亮氨酸重復家族蛋白, 2個編碼托品酮還原酶II, 1個編碼假定蛋白, 其他編碼轉座子或反轉座子蛋白。沒有在該區(qū)間發(fā)現(xiàn)已報道的衰老相關基因, 編碼富含亮氨酸蛋白的這4個基因幾乎都含有NB-ARC結構域, 該結構域多存在于抗病蛋白中, 同時參與細胞程序性死亡, 引起衰老[37], 但是基因測序并未發(fā)現(xiàn)這4個基因在野生型和突變體中存在差異。由于該突變體與已往報道的有所不同, 其葉片中有大量淀粉積累, 我們推測其衰老是由葉片中淀粉積累所致。突變體的衰老是由于植株對Pi的吸收和轉運增強, 引起葉片中Pi過量積累而導致葉尖枯死[15], Pi的吸收和轉運與淀粉代謝存在一定關系, 但在我們的定位區(qū)間內并未發(fā)現(xiàn)Pi代謝相關基因, 說明兩者衰老機制可能并不相同, 還需通過基因克隆及功能分析來進一步研究衰老機制。

4 結論

是一個新型的因葉片淀粉積累而導致的早衰突變體, 苗期葉片呈淡綠色, 分蘗期開始葉尖黃化, 隨后逐漸擴展至葉中上部, 分蘗數(shù)減少, 植株矮化, 結實率降低。葉片中由于淀粉顆粒積累而破壞了葉綠體結構, 光合色素含量降低。中保護酶SOD和CAT活性極顯著降低, 活性氧O2￣、H2O2和·OH含量升高。該突變體受一對顯性基因控制, 該基因被定位于第11染色體物理范圍為304.9 kb的區(qū)間內。本研究結果為下一步的基因克隆和功能分析奠定了基礎。

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Identification and Gene Mapping of Starch Accumulation and Early Senescence Leaf Mutantin Rice

XIAO Yan-Hua**, CHEN Xin-Long**, DU Dan, XING Ya-Di, ZHANG Tian-Quan, ZHU Mao-Di, LIU Ming-Ming, ZHU Xiao-Yan, SANG Xian-Chun, and HE Guang-Hua*

Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400716, China

A new leaf senescence mutant() was discovered from the progeny ofmaintainer line 1B mutated by ethyl methane sulfonate(EMS). Compared with the wild-type, the leaf ofwas pale green at seedling stage; chlorosis occurred at leaf tip and gradually extended to the middle-upper parts of leaf at tillering stage. However, the leaf base remained green until maturity. In the, the photosynthetic pigment contents declined, and the contents of reactive oxygen species (ROS), such as O2￣, ·OH, and H2O2, heightened compared with those in the wild-type. At the same time, activities of protective enzymes, SOD and CAT, both reduced in. The results of iodine-iodide kalium dyeing and starch content determination showed that more starch granules accumulated in theleaf. Quantitative RT-PCR results indicated that genes responsible for starch synthesis were up-regulated and genes participated in the triose phosphate distribution path were down-regulated. We made an inference that gene mutation changed the distribution of triose phosphate, resulting in starch granules accumulating in the leaf, chloroplast structure being destroyed and photosynthetic system being blocked, thus increasing the contents of ROS, eventually causing leaf senescence. Genetic analysis demonstrated that the phenotype ofwas controlled by a dominant nuclear gene. The target genewas mapped between SSR markers S11-110 and S11-87 with a physical distance of 304.9 kb on chromosome 11. These results will lay a foundation for cloning and functionally analysing.

Rice (L.); Early senescence;Starch accumulation; Genetic analysis; Gene mapping

10.3724/SP.J.1006.2017.00473

本研究由農業(yè)部行業(yè)專項(201303129)和重慶市重點實驗室能力提升項目(cstc2014pt-sy80001)資助。

This study was supported by the Special Industry Project of Ministry of Agriculture (201303129) and the Capacity Promotion Project of Key Laboratories in Chongqing (cstc2014pt-sy80001).

何光華, E-mail: hegh@swu.edu.cn

E-mail: xyhua0625@163.com

2016-09-11;

Accepted(接受日期): 2017-01-21;

Published online(網(wǎng)絡出版日期):2017-02-17.

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1009.024.html