周 晴 傅 玉 胡良安 李 倩 金 夢(mèng) 江 娥

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,重慶400016)

支氣管哮喘患者外周血Th17與Th9細(xì)胞的變化及臨床意義①

周 晴 傅 玉 胡良安 李 倩 金 夢(mèng) 江 娥

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,重慶400016)

目的：探討Th17、Th9細(xì)胞水平在支氣管哮喘患者中的表達(dá)及其臨床意義。方法：選取67例哮喘患者為研究對(duì)象，30例健康體檢者為對(duì)照組，根據(jù)全球哮喘防治倡議(GINA)將哮喘患者分為間歇與輕度持續(xù)組20例，中度持續(xù)組25例和重度持續(xù)組22例。收集患者臨床資料，完成哮喘控制測(cè)試(ACT)評(píng)分、肺功能和呼出氣一氧化氮(FeNO)值測(cè)定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血PBMC中CD3+CD8-IL-17+、CD3+CD8-IL-9+細(xì)胞水平。結(jié)果：與健康對(duì)照組相比，哮喘患者Th17、Th9細(xì)胞水平均明顯升高(P<0.05)；中重度哮喘患者Th17及Th9細(xì)胞水平顯著高于間歇與輕度哮喘組(P<0.05)，而間歇與輕度哮喘組患者與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。哮喘患者外周血Th17及Th9細(xì)胞的表達(dá)均與FeNO值正相關(guān)(r值依次為0.501、0.438；P<0.05)，與ACT評(píng)分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF負(fù)相關(guān)(r值依次為-0.441、-0.362；-0.307、-0.377；-0.419、-0.411；-0.428、-0.324；P<0.05)，同時(shí)Th17與Th9細(xì)胞在哮喘患者外周血中的表達(dá)率正相關(guān)(r值為0.443，P<0.05)。結(jié)論：Th17、Th9細(xì)胞在哮喘患者中高表達(dá)，具有協(xié)同致炎作用，且與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，提示Th17及Th9細(xì)胞對(duì)哮喘患者病情評(píng)估有潛在的參考價(jià)值。

Th17細(xì)胞；Th9細(xì)胞；哮喘；肺功能

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等)及其細(xì)胞組分參與的一種慢性氣道炎癥性疾病。免疫功能異常是其重要的發(fā)病機(jī)制[1]。輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper cell,Th細(xì)胞)在哮喘氣道慢性炎癥中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2 細(xì)胞失衡是哮喘發(fā)病的經(jīng)典免疫學(xué)機(jī)制，被認(rèn)為是哮喘氣道嗜酸細(xì)胞性炎癥形成及發(fā)展的免疫學(xué)基礎(chǔ)[2]，但最近研究表明，Th17與Th9細(xì)胞也參與了導(dǎo)致哮喘發(fā)病的免疫紊亂過(guò)程[3,4]。Th17細(xì)胞可能通過(guò)募集、活化中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，發(fā)生炎癥反應(yīng)；而Th9細(xì)胞與過(guò)敏、氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)。但Th17和Th9細(xì)胞是否與哮喘的癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)及兩者在哮喘中是否存在協(xié)同致炎作用，目前尚未闡明。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)哮喘患者外周血Th17、Th9細(xì)胞的水平，分析兩者與哮喘控制測(cè)試(Asthma control test，ACT)評(píng)分、肺功能和呼出氣一氧化氮(Fractional exhaled nitric oxide,FeNO)值的相關(guān)性，初步探討Th17和Th9細(xì)胞免疫途徑在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 抗人CD3-PEcy5單克隆抗體、抗人CD8-FITC單克隆抗體均購(gòu)自Biolegend公司；抗人IL-17-PE單克隆抗體、抗人IL-9-eFluor 660單克隆抗體均購(gòu)自eBioscience公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；固定劑、破膜劑購(gòu)自BD公司；刺激劑PMA-Ionomycin和阻斷劑BFA-Monomycin購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司；Th17、Th9細(xì)胞檢測(cè)采用美國(guó)BD公司FACSVantage流式細(xì)胞分析儀及流式結(jié)果分析系統(tǒng)；肺功能儀采用德國(guó)Jeager肺功能儀；FeNO值測(cè)定采用瑞典Aerocrine檢測(cè)儀。所有試劑均嚴(yán)格按照說(shuō)明書保存和操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 研究對(duì)象 選取2015年3月至2016年5月在我院呼吸內(nèi)科就診的哮喘患者67例，所有患者均符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。根據(jù)全球哮喘防治倡議(Global initiative for asthma,GINA)[6]，將患者分為間歇與輕度持續(xù)組(20例)，中度持續(xù)組(25例)和重度持續(xù)組(22例)。同時(shí)選取我院門診健康體檢者30例為正常對(duì)照組，所有健康體檢者無(wú)抽煙史、過(guò)敏性家族史和自身免疫病史。所有研究對(duì)象在4周內(nèi)未使用全身激素治療和免疫抑制劑，2周內(nèi)無(wú)急性感染；并排除合并其他肺部疾病、妊娠、腫瘤及其他自身免疫性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意后，收集基本資料及標(biāo)本。

1.2.2 肺功能及FeNO值測(cè)定 對(duì)入組患者進(jìn)行常規(guī)肺功能檢測(cè)和FeNO值測(cè)定，操作參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)規(guī)范進(jìn)行。肺功能重復(fù)測(cè)3次，每次數(shù)值變化不超過(guò)5%，取最佳值，計(jì)算第1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 1 second,FEV1)，第1秒用力呼氣容積占用力肺活量比值(FEV1/forced vital capacity,FEV1/FVC)和最大呼氣峰值流速(Peak expiratory flow,PEF)，結(jié)果以占正常預(yù)計(jì)值的百分比表示。檢測(cè)FeNO水平時(shí)要求患者在平靜狀態(tài)下，將肺內(nèi)氣體吹盡后迅速含住過(guò)濾器，用力吸氣5 s后，以平均50 ml/s的呼氣速度勻速呼氣10 s，F(xiàn)eNO值以十億分之一(Parts per billion，PPB)表示。

1.2.3 ACT問(wèn)卷調(diào)查 ACT問(wèn)卷主要包括5個(gè)方面：活動(dòng)受限、喘息癥狀、夜間哮喘癥狀、急救藥物(如沙丁胺醇)的使用頻次和患者對(duì)哮喘控制情況的自我評(píng)估。每一方面包括5個(gè)選項(xiàng)，對(duì)應(yīng)1～5分，最后將得分相加計(jì)算總分。得分25分為哮喘完全控制，20～24分為哮喘部分控制，低于20分為哮喘未控制。

1.2.4 檢測(cè)外周血Th17、Th9細(xì)胞 收集哮喘患者和健康對(duì)照者靜脈血4 ml，經(jīng)肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Perpheral blood mononuclear cell,PBMC)。用RPMI1640培養(yǎng)液重懸PBMC并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，然后接種于24孔板，加入4 μl/ml PMA-Ionomycin，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h，最后2 h加入4 μl/ml的BFA-Monom-ycin。收集細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入CD3-PEcy5單克隆抗體和CD8-FITC單克隆抗體，室溫、避光孵育30 min，再依次加入固定劑、破膜劑各100 μl，孵育15 min后，加入IL-17-PE單克隆抗體和IL-9-eFluor 660單克隆抗體，混勻、室溫、避光孵育30 min，對(duì)照管加入相應(yīng)的同型對(duì)照。孵育結(jié)束后，加入PBS重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由于PMA刺激會(huì)誘發(fā)細(xì)胞表面CD4分子被內(nèi)吞[7]，所以我們采用CD3+CD8-表面標(biāo)記法間接定義CD4+T細(xì)胞[8,9]，CD3+CD8-IL-17+T細(xì)胞標(biāo)記為Th17細(xì)胞，CD3+CD8-IL-9+T細(xì)胞標(biāo)記為Th9細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料和肺功能比較 研究組在性別、年齡、體重指數(shù)(Body mass index,BMI)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨病情嚴(yán)重程度增加，哮喘患者的FeNO值明顯升高，并伴隨ACT評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重度哮喘組的肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1/FVC及PEF較間歇與輕度哮喘組均明顯降低(P<0.05)。各組研究對(duì)象的基本資料見(jiàn)表1。

2.2 哮喘組與對(duì)照組外周血Th17、Th9細(xì)胞水平比較 圖1為研究對(duì)象代表性流式細(xì)胞分析圖。與健康對(duì)照組相比，哮喘組患者外周血Th17及Th9細(xì)胞水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 不同哮喘嚴(yán)重程度組間外周血Th17、Th9細(xì)胞比較及二者相關(guān)性 隨病情嚴(yán)重程度的增加，哮喘患者外周血Th17、Th9細(xì)胞比例明顯增加。中、重度哮喘患者外周血Th17及Th9細(xì)胞水平均顯著高于間歇與輕度持續(xù)組(P<0.05)，而間歇與輕度持續(xù)組患者與健康對(duì)照組比較，Th17及Th9細(xì)胞水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。同時(shí)，Th17和Th9細(xì)胞在哮喘患者外周血PBMC中的表達(dá)率顯著正相關(guān)(r=0.443,P=0.001)，見(jiàn)圖2。

2.4 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血PBMC中Th17及Th9細(xì)胞水平與哮喘患者氣道炎癥指標(biāo)FeNO值顯著正相關(guān)(P<0.05)，與ACT評(píng)分、肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1/FVC及PEF均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表2 哮喘組和對(duì)照組Th17、Th9細(xì)胞水平

Tab.2 Levels of Th17 and Th9 cells in asthma patients and healthy controls

GroupsnTh17(%)Th9(%)Control300 51±0 160 55±0 21Asthma671 17±0 551)1 23±0 611)

Note：1)P<0.05 vs control group.

表1 研究對(duì)象的臨床特征和肺功能

Tab.1 Patient characteristics and pulmonary function

CharacteristicsIntermittenttomildpersistentModeratepersistentSeverepersistentHealthycontrolNumber20 25 2230Age(years)49 00±13 9449 67±7 7345 21±14 1644 77±11 44Females(%)50 00 48 00 45 4553 33BMI(kg/m2)23 66±3 5023 95±2 7424 16±3 0722 53±1 57FeNO(PPB)26 43±7 1254 82±14 561)75 89±19 811)2)ACT20 37±2 2016 06±2 691)14 14±3 001)2)FEV1(%)81 54±10 1977 81±12 1072 10±19 361)FEV1/FVC(%)94 29±12 5381 29±13 271)68 95±15 901)2)PEF(%)92 69±14 8079 21±14 101)75 35±19 681)

Note：1)P<0.05 vs intermittent to mild persistent;2)P<0.05 vs moderate persistent.

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組間Th17、Th9細(xì)胞比例Fig.1 Th17 and Th9 cell levels in two groups were measured by flow cytometryNote：CD3+CD8-IL-17+ T cell was marked for Th17 cell,CD3+CD8-IL-9+ T cell was marked for Th9 cell；A.Th17 cell level of control group；B.Th17 cell level of asthma group；C.Th9 cell level of control group；D.Th9 cell level of asthma group.

表3 哮喘各組Th17及Th9細(xì)胞水平

Tab.3 Levels of Th17 and Th9 cells in subgroups of asthma

GroupsIntermittenttomildpersistentModeratepersistentSeverepersistentHealthycontrolTh17(%)0 70±0 271 21±0 461)2)1 61±0 441)2)3)0 51±0 16Th9(%)0 71±0 291 03±0 241)2)1 97±0 321)2)3)0 55±0 21

Note：1)P<0.05 vs healthy control;2)P<0.05 vs intermittent to mild persistent;3)P<0.05 vs moderate persistent.

圖2 哮喘患者PBMC中Th17(%)與Th9(%)細(xì)胞的相關(guān)性Fig.2 Correlation analysis between percentages of Th17 cells and Th9 cells in PBMC of asthma patients

表4 Th17及Th9細(xì)胞水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

Tab.4 Correlations analysis between levels of Th17 or Th9 cells and clinical characteristics

ItemTh17(%)rPTh9(%)rPFeNO0 5010 0000 4380 000ACT-0 4410 000-0 3620 004FEV1(%)-0 3070 017-0 3770 003FEV1/FVC(%)-0 4190 001-0 4110 001PEF(%)-0 4280 001-0 3240 012

3 討論

哮喘的病理本質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為Th2及其相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化參與并維持過(guò)敏性哮喘的發(fā)病，且與癥狀嚴(yán)重程度正相關(guān)[10]；而Th17、Th9細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與研究，完善了Th1/Th2細(xì)胞失衡為哮喘發(fā)病機(jī)制這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)。

作為Th17細(xì)胞的特異性因子IL-17，可誘導(dǎo)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種前炎癥因子，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生[11]；同時(shí)，其募集、活化中性粒細(xì)胞的生物學(xué)功能，已被證實(shí)與中性粒細(xì)胞炎癥和氣道重塑相關(guān)[12]。相關(guān)研究表明，與健康對(duì)照組相比，Th17細(xì)胞在哮喘患者的痰液、肺組織、支氣管黏膜下組織和外周血中均升高[13，14]。Th17細(xì)胞參與的細(xì)胞炎癥反應(yīng)是機(jī)體的過(guò)繼免疫反應(yīng)，而后者的特點(diǎn)具有特異性和持久存在，這似乎給哮喘細(xì)胞炎癥提供了一個(gè)更合理的解釋機(jī)制[15]。在本研究中，哮喘患者外周血Th17細(xì)胞水平較健康對(duì)照組明顯升高，結(jié)果與以往研究報(bào)道一致。進(jìn)一步分析表明，隨著病情嚴(yán)重程度加重，Th17細(xì)胞比例逐漸升高，中、重度哮喘組Th17細(xì)胞比例升高較間歇與輕度哮喘組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示，Th17細(xì)胞水平與氣道炎癥指標(biāo)FeNO值顯著正相關(guān)，與ACT評(píng)分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Th17細(xì)胞參與T細(xì)胞介導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)并維持氣道炎癥。ACT評(píng)分與肺功能是反映患者癥狀控制情況和臨床預(yù)后的重要參考指標(biāo)，表明Th17細(xì)胞水平在一定程度上可反映患者病情管理情況。

Th9細(xì)胞是一種新型Th細(xì)胞亞群，主要分泌IL-9、IL-10和IL-21，其中IL-9與哮喘發(fā)生的遺傳有關(guān)，其編碼基因位于5號(hào)染色體(5q31-33)，該區(qū)域的連鎖不平衡與多態(tài)性表明，IL-9與過(guò)敏、氣道高反應(yīng)性、總免疫球蛋白E水平升高密切相關(guān)[16]。目前Th9細(xì)胞已成為變態(tài)反應(yīng)疾病的研究熱點(diǎn)，但它在發(fā)病中所起的作用仍然未知。雖然最近研究已證明，哮喘患者的支氣管黏膜組織、肺組織和外周血中的IL-9表達(dá)水平均升高，但是不能排除是從其他細(xì)胞來(lái)源的IL-9起作用[17]。Th9細(xì)胞來(lái)源的IL-9通過(guò)增加呼吸道炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活，從而加重過(guò)敏性疾病的癥狀[18]。Jones等[19]報(bào)道了哮喘患者外周血中Th9細(xì)胞比例升高，但缺少其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著哮喘病情嚴(yán)重程度加重，Th9細(xì)胞水平升高，且Th9細(xì)胞水平與FeNO值顯著正相關(guān)，與ACT評(píng)分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Th9細(xì)胞水平可以反映哮喘病情嚴(yán)重程度和氣道炎癥水平。同時(shí)本研究還分析了在哮喘患者外周血中，Th17與Th9細(xì)胞比例正相關(guān)，所以我們推測(cè)兩者在介導(dǎo)炎癥病理過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同致炎作用，但兩者相互作用的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，哮喘患者外周血Th17和Th9細(xì)胞水平隨著病情嚴(yán)重程度的加重而明顯升高，且與氣道炎癥指標(biāo)正相關(guān)，與肺功能、病情控制評(píng)分負(fù)相關(guān)，提示Th17、Th9細(xì)胞在哮喘發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮不可忽視的作用，對(duì)癥狀嚴(yán)重程度和預(yù)后評(píng)估有一定的參考價(jià)值。

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[收稿2016-09-19 修回2016-10-28]

(編輯 張曉舟)

Changes and clinical significance of Th17 and Th9 cells in patients with asthma

ZHOUQing,FUYu,HULiang-An,LIQian,JINMeng,JIANGE.

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

Objective:To explore the expression of Th17 and Th9 cells and their clinical significance in patients with asthma.Methods：67 patients with asthma and 30 healthy subjects were enrolled in this study,according to GINA,the asthmatic patients were classified intermittent to mild persistent asthma(n=20),moderate persistent asthma(n=25)and severe persistent asthma(n=22).The characteristics of patients,Asthma control test(ACT) scores,pulmonary function and fractional exhaled nitric oxide(FeNO)were evaluated,the levels of CD3+CD8-IL-17+,CD3+CD8-IL-9+were determined by flow cytometric analysis.Results：The levels of Th17,Th9 cells were significantly higher in asthma patients compared with control group(P<0.05);moderate to severe persistent group showed a significant increase of Th17 and Th9 proportion compared with intermittent to mild persistent group,while there were no significance between intermittent to mild persistent asthma and control group(P>0.05).The expression of Th17 and Th9 cells were positively correlated with FeNO(r=0.503,0.438;P<0.05) while negatively correlated with ACT,FEV1,FEV1/FVC and PEF in the asthmatic patients(r=-0.441,-0.362;-0.307,-0.377;-0.419,-0.411;-0.428,-0.324;P<0.05).There were positive correlation between the expression of Th17 and Th9 cells(r=0.443;P<0.05).Conclusion：Th17 and Th9 cells highly increased in the patients with asthma have synergy inflammatory effect,which were associated with symptom severity.These results indicate that Th17 and Th9 cells may have a potential value to assess severity of asthma.

Th17 cell;Th9 cell;Asthma;Pulmonary function

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.019

①本文受國(guó)家臨床重點(diǎn)?？茖ｍ?xiàng)資助(民辦醫(yī)政函[2012]649號(hào))。

周 晴(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究，E-mail:zhouqingzq163@163.com。

及指導(dǎo)教師：胡良安(1963年-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺癌、肺結(jié)核、哮喘方面的研究，E-mail:huliangan9@163.com。

R562.25

A

1000-484X(2017)04-0569-05