王貴升尹斐斐（①山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東 濟南 250100 ②山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟南 山東省威海市動物疫病預(yù)防控制中心）

肺炎克雷伯氏菌PCR檢測方法的建立

王貴升①②尹斐斐③（①山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東 濟南 250100 ②山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟南 ③山東省威海市動物疫病預(yù)防控制中心）

依據(jù)GenBank中肺炎克雷伯氏菌的部分已知序列，利用Primer Premier 5設(shè)計兩對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種檢測肺炎克雷伯氏菌的診斷方法。特異性和敏感性試驗顯示，該方法能特異地檢測肺炎克雷伯氏菌，其最低能檢測的細菌濃度為1×10-4Mcf，整個檢測擴增在3h內(nèi)完成。該結(jié)果表明本試驗所建立的PCR方法的靈敏度及特異性均較好，可用于快速檢測肺炎克雷伯氏菌。

肺炎克雷伯氏菌 PCR 檢測

肺炎克雷伯氏菌(K.pnenmoniae)是一種G-桿菌，屬于腸桿菌科，條件性致病菌[1]。肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌在普通的營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基上具有極高的相似性，細菌的形態(tài)、顏色、氣味都很相近，革蘭氏染色鏡檢中都是短小的G-小桿菌[2]。在常規(guī)的細菌培養(yǎng)中很難將肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌區(qū)別開來，而做細菌的生化鑒定和16sRNA鑒定需要比較長的時間，約3～4d的時間。如果做16sRNA鑒定還需要進行測序，成本比較高。另外，毛皮動物克雷伯氏菌病以支氣管炎、肺炎，敗血癥，腦膜炎，腹膜炎，腹瀉等為主要癥狀；與綠膿桿菌也引起的肺炎的癥狀相同[3-5]，因此，建立快速檢測和鑒定肺炎克雷伯氏菌的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 文中所涉及的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；大腸桿菌(Escherichia coli)，記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；以上菌株除了肺炎克雷伯氏菌保存于中國微生物菌種保藏普通微生物中心(登記入冊編號11222)，其余均保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 普通營養(yǎng)瓊脂，10×PCR反應(yīng)液、Taq酶、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(25mmol/L)均購自寶生物工程(大連)有限公司。細胞計數(shù)板；顯微鏡；生化培養(yǎng)箱；PCR儀為羅氏公司生產(chǎn)；Centrifuge 5417R臺式冷凍離心機由德國Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.1.3 引物設(shè)計 選取肺炎克雷伯氏菌的基因保守區(qū)，設(shè)計出相應(yīng)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用前用滅菌超純水配成10μmol/L的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 PCR體系建立 反應(yīng)條件的優(yōu)化，先建立優(yōu)化單個菌的檢測體系，在此基礎(chǔ)上，逐步改變引物的濃度以達到最佳。

1.2.2 PCR特異性試驗 選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和綠膿桿菌，分別挑單個菌落于10ml無菌試管中過夜搖菌，得原菌液。按照優(yōu)化好的PCR擴增條件，PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，分別取5ul PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。

1.2.3 PCR敏感性試驗 （1）將肺炎克雷伯氏菌7株劃在普通營養(yǎng)瓊脂上，取單個菌落作PCR反應(yīng)的模版，其他反應(yīng)體系和條件都不變，最后用滅菌雙蒸水補充至50μl。（2）取培養(yǎng)了12h的肺炎克雷伯氏菌的單個菌落，于3ml 85%Nacl生理鹽水中，將菌液濃度(麥式濃度)調(diào)整為0.1Mcf，并在此基礎(chǔ)上進行50、100、1000倍稀釋，即稀釋后的菌液濃度為0.002、0.001、0.0001Mcf。各取其4μl做PCR反應(yīng)的模版。其他PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系都不變。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 摸索反應(yīng)條件，建立了50μl的反應(yīng)體系：4μl待測樣品、4μl引物對K1或/和引物對K2(上下引物各2μl)和25μl PCR試劑，用滅菌雙蒸水補充至50μl。優(yōu)化后的程序為：第一階段預(yù)變性94℃3min；第二階段94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸7min，得PCR擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 PCR特異性試驗結(jié)果

2.1.1 肺炎克雷伯氏菌的特異性 如圖1所示，1～7泳道和9～15泳道為肺炎克雷伯氏菌的擴增產(chǎn)物，8和16泳道為陰性對照(蒸餾水)；1～8泳道第一對引物，9～16泳道第二對引物；7株肺炎克雷伯氏菌對擴增產(chǎn)物電泳及成像拍照，在303bp處均出現(xiàn)清晰條帶。對擴增產(chǎn)物測序，其序列均如SEQ ID NO.5所示為肺炎克雷伯氏菌的特異性基因序列?？梢?，該引物能將肺炎克雷伯氏菌檢測到。

圖1 肺炎克雷伯氏菌的特異性試驗M：DNA maker DL2000：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；下同

圖2 大腸桿菌的特異性試驗

2.1.2 對大腸桿菌的特異性試驗 如圖2所示，1～10泳道和12～21泳道為10株大腸桿菌的擴增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對照；1～11泳道是第一對引物；2～22泳道是第二對引物；10株大腸桿菌在303bp處沒有出現(xiàn)條帶?？梢姡撘锊荒軐⒋竽c桿菌檢測到。

2.1.3 對綠膿桿菌的特異性試驗 如圖3所示，1～10泳道和12～21泳道為10株綠膿桿菌的擴增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對照；1～11泳道是第一對引物；2～22泳道是第二對引物；在303bp處均沒有出現(xiàn)條帶。可見，該引物不能將綠膿桿菌檢測到。

2.1.4 對肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌混合菌的特異性試驗 如圖4所示，1～3泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；4～6泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；7～9泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；10泳道為陽性對照，檢測肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；11泳道為陰性對照；12～14泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；15～17泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；18～20泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；21泳道為陽性對照，檢測肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；22泳道為陰性對照；可見，此兩對引物對肺炎克雷伯氏菌具有良好的特異性，能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c混淆程度很大的大腸桿菌和綠膿桿菌區(qū)分開。

圖3 綠膿桿菌的特異性試驗

圖4 肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌混合菌的特異性試驗

2.2 PCR敏感性試驗結(jié)果

2.2.1 肺炎克雷伯氏菌單個菌落敏感性 如圖5，肺炎克雷伯氏菌7株單個菌落就可以用該引物檢測到，說明此引物敏感性良好。

圖5 肺炎克雷伯氏菌單個菌落敏感性試驗

2.2.2 肺炎克雷伯氏菌梯度稀釋后敏感性 如圖6、7，引物對K1對肺炎克雷伯菌的敏感性試驗結(jié)果；1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf，3、4泳道菌液模版濃度為0.001Mcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0001Mcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽性對照，8泳道為陰性對照；引物對K2對肺炎克雷伯菌的敏感性試驗結(jié)果； 1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf，3、4泳道菌液模版濃度為0.001Mcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0001Mcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽性對照，8泳道為陰性對照；可見，當(dāng)菌液濃度為0.0001Mcf時仍可見清晰的條帶，說明該引物的敏感性較高。

圖6 引物對K1的敏感性試

圖7 引物對K2的敏感性試驗

3 結(jié)論

隨著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；?、集約化發(fā)展，毛皮動物疾病越來越復(fù)雜，病毒、細菌等多病原混合感染的現(xiàn)象日益突出[6]。當(dāng)毛皮動物養(yǎng)殖場發(fā)生疫病時，應(yīng)將實驗室檢查與現(xiàn)場診斷相結(jié)合，傳統(tǒng)技術(shù)與現(xiàn)代化技術(shù)相結(jié)合，綜合分析，找出主要病原和誘發(fā)因素[7]。本方法的建立，能夠快速的將肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開。為臨床治療方案制定爭取了時間。

[1] 陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學(xué)(第5版)[M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006∶116.

[2] 張詩渝. 肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定及其對小鼠的致病性研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[3] 曹榮峰, 田洪宇, 王繼芳等. 水貂細菌性疾病的病原學(xué)調(diào)查[J]. 經(jīng)濟動物學(xué)報, 2008(12)∶ 21-23.

[4] 鐘世勛, 遲珊珊, 王振等. 山東規(guī)?；B(yǎng)殖場毛皮動物多重感染病原學(xué)分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 34(11)∶ 1770-1777.

[5] 陳思, 呂文雪, 許皓等. 引起毛皮動物肺炎的主要病原微生物及特征[J]. 中國毛皮動物科學(xué)研究進展, 2014(2)∶ 164-169.

[6] 任橋, 徐玉, 劉煥奇等. 水貂出血性敗血癥繼發(fā)克雷伯菌病的診斷與治療[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2012(9)∶ 77-79.

[7] 錢愛東, 李影. 獸醫(yī)全攻略毛皮動物疾病[M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009∶ 238-239.

S852.61+2

A

1007-1733(2017)04-0006-02

2017–01–11）

山東省毛皮動物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-18-011-05)