陳秋娟，謝微，羅楊合，李金鳳，王勝新，全耀

（1.賀州學院化學與生物工程學院，廣西賀州542899；2.賀州學院食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899）

不同提取方法對馬蹄皮總提取物抗氧化活性的影響

陳秋娟1，謝微2，*，羅楊合2，李金鳳1，王勝新1，全耀1

（1.賀州學院化學與生物工程學院，廣西賀州542899；2.賀州學院食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899）

利用不同提取方法提取獲得馬蹄皮總提取物，研究不同提取物的總還原能力和羥自由基清除能力。結(jié)果顯示：不同提取物均具有不同程度的總還原能力和羥自由基清除能力，且均具有量效關(guān)系，表明不同提取物均具有一定的抗氧化能力；其中，抗氧能力最強的是用酸性乙醇作提取劑微波輔助提取的提取物。

馬蹄皮；總還原能力；羥自由基；抗氧化

馬蹄（Water chestnuts），又稱荸薺、地栗、烏芋等，屬莎草科多年水生草本植物的地下球莖。馬蹄富含有人體需要的多種營養(yǎng)成分，具有潤肺、消食、降血壓、潤腸通便等作用[1-2]。目前，我國馬蹄產(chǎn)量占世界總量的95%以上[3]。人們主要將馬蹄用于馬蹄罐頭、馬蹄糕，即食馬蹄糊的生產(chǎn)，以及加工成各種馬蹄保健品、馬蹄營養(yǎng)飲料等產(chǎn)品[3]，然而在馬蹄的加工過程中，占鮮馬蹄質(zhì)量20%～25%的馬蹄皮除少量用作飼料外，大部分都被作為廢棄物丟棄[4]。

活性氧自由基是一種氧化活性相當強的物質(zhì)，容易引起機體衰老，誘發(fā)各種惡性疾病等[5]。其中，羥自由基（·OH）是最活潑的活性氧自由基之一，可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及奪取氫原子和羥基化等反應，引起蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類等物質(zhì)出現(xiàn)氧化性損傷。食用抗氧化性食品對抑制因活性氧自由基引起的心腦血管等疾病具有一定的預防和治療作用，但是，目前被廣泛應用的食品抗氧化劑大部分是人工合成的，其安全性不足[6]。因此開發(fā)安全可靠的天然抗氧化劑成為一種迫切需要。

研究表明，許多植物的果皮及果核都表現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化性能[7]。馬蹄皮作為馬蹄加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，其提取物具有良好的抗氧化能力[8-10]。隨著科學研究的不斷深入，關(guān)于馬蹄皮提取物抑菌作用[11-12]和抗氧化性能的研究越來越多。提取物對羥自由基的清除能力是評價其抗氧化能力強弱的重要指標之一[13]。同時，研究已證實還原能力與抗氧化能力具有一定的關(guān)聯(lián)性，并且可以反映內(nèi)源抗氧化能力的變化，也是評價抗氧化活性的重要指標。一定程度上，還原能力越強，越不容易被氧化，抗氧化性就越高。目前，關(guān)于馬蹄皮的研究主要是提取工藝的研究，而關(guān)于不同提取方法對馬蹄皮提取物抗氧化活性影響的研究鮮有報道。

本文利用酸性乙醇（70%，pH=2，體積分數(shù)）、乙醇（70%，體積分數(shù)）、乙酸乙酯3種提取劑，分別采用普通浸提、微波輔助提取、超生波輔助提取3種方法進行提取，研究不同馬蹄皮提取物的總還原能力和對羥自由基的清除能力，據(jù)此判斷不同提取物的抗氧化能力差異，由此得出最佳的提取方法，以更好地開發(fā)利用馬蹄皮資源，為天然抗氧化劑及抗氧化保健食品的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬蹄皮：收集于賀州市八步區(qū)中心市場。

碳酸鈉：天津市鼎盛鑫化工有限公司；無水乙醇：天津市鼎盛鑫化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市凱通化學試劑有限公司；三氯乙酸：天津市北辰方正試劑廠；30%H2O2、鹽酸、氯化鈉：西隴化工股份有限公司；乙酸乙酯：杭州新方五交化有限公司；鐵氰化鉀、抗壞血酸、三氯化鐵：杭州新方五交化有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸：廣州市承躍貿(mào)易有限公司；以上藥品均為分析純；試驗用水為蒸餾水。

CW-2008型多功能微波反應萃取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；JY·99-IIDN型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；JP-250A-8型高速多功能粉碎機：永康市久品工貿(mào)有限公司；FA1004型電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；TDL-80-2B型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；HHS型水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 同種提取方法不同提取劑提取物的制備

挑選無腐爛馬蹄，清洗后去皮，收集馬蹄皮放在陰涼處自然風干后，粉碎備用。稱量馬蹄皮粉末8.0 g若干份，置于250 mL錐形瓶，分別加入160 mL（1∶20，g/ mL）70%酸性乙醇（pH=2）、70%乙醇和乙酸乙酯，提取方法選擇50℃普通浸泡提取2 h，趁熱減壓抽濾，濾渣再提取2次，每次提取1 h，分別將濾液合并，把濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至恒重，獲得浸膏狀提取物備用。

1.2.2 同種提取劑不同提取方法提取物的制備

挑選無腐爛馬蹄，清洗后去皮，收集馬蹄皮放在陰涼處自然風干后，粉碎備用。稱量馬蹄皮粉末8.0 g若干份，置于250 mL錐形瓶，加入160 mL（1∶20，g/mL）70%酸性乙醇（pH=2），分別用微波萃取儀（260 W、2 min、50℃）提取和超聲波細胞粉碎機（260 W、20 min、50℃）提取，抽濾后濾渣再提取2次，分別將濾液合并，把濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至恒重，獲得浸膏狀提取物備用。用同樣的方法制備乙醇不同提取方法提取物。由于乙酸乙酯作提取劑，其提取物的抗氧化效果不佳，因此不再做不同提取方法的比較研究。

1.2.3 總還原能力

參照文獻[5]的方法，在8支試管中分別加入3.0mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液，加入質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的樣品溶液3.0 mL，再分別加入1%的鐵氰化鉀溶液3.0 mL；混合物在50℃恒溫20 min后，分別加入3.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以2 500 r/min離心分離5 min，取上清液5.0 mL，加蒸餾水6.0 mL和0.1%FeCl3溶液2.0 mL，在700 nm處測量吸光度值，用蒸餾水代替樣品溶液進行還原能力參比測定試驗。吸光度越高表明其還原能力越強。每個樣品平行測定3次，取平均值。以相同濃度的VC作陽性對照。

1.2.4 羥基自由基清除能力

參照文獻 [5]，在8支試管中分別加入濃度均為2.0 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，分別加入1.0 mL質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的樣品溶液，加蒸餾水至5.0 mL，再分別加入2.0 mmol/L H2O22.0 mL，在37℃水浴下反應60 min后，用蒸餾水作參比，于510 nm處測吸光度值。每個樣品平行測定3次，取平均值。以相同濃度的VC作陽性對照。清除率計算公式為：

清除率/%＝（A0-A1/A0）×100

式中：A0為空白樣液吸光度；A1為樣液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬蹄皮不同提取物總還原能力的測定

2.1.1 同種提取方法不同提取劑提取物總還原能力的測定結(jié)果

分別準確稱量不同浸膏狀提取物配制成所需濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根據(jù)1.2.3方法測定不同提取物還原能力的大小，結(jié)果如圖1所示。

圖1 同種提取方法不同提取劑提取物總還原能力Fig.1 Total reducing power of different extraction agents extract for the same extraction method

由圖1可知，1）在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3種不同提取物均具有一定的總還原能力，并且3種提取物的總還原能力均隨著提取物質(zhì)量濃度的增大而增強，存在劑量-效應關(guān)系；2）在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL范圍內(nèi)，3種不同提取物的總還原能力相差不大；在2.5 mg/mL～ 4.0 mg/mL范圍內(nèi)，3種不同提取物的總還原能力相差較大；3）在相同濃度條件下，不同提取物的總還原能力強弱順序依次為酸性乙醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物，但各提取物的總還原能力均比VC弱。還原能力的測定結(jié)果表明馬蹄皮提取物中含有一定數(shù)量的還原性物質(zhì)，說明不同提取劑由于極性、分散性等性質(zhì)的差異，對馬蹄皮多酚、黃酮等植物還原性化學成分的提取具有選擇性。由此可知用酸性乙醇作提取劑，提取物的總還原能力更強。

2.1.2 同種提取劑不同提取方法提取物總還原能力的測定結(jié)果

分別準確稱量不同浸膏狀提取物配制成所需濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根據(jù)1.2.3方法測定不同提取物總還原能力的大小，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3的測定結(jié)果可知，同種提取劑不同提取方法提取物均表現(xiàn)出不同程度的總還原能力，但其清除能力均比VC弱。在相同濃度條件下，同種提取劑不同提取方法提取物的總還原能力強弱順序依次為VC＞微波提取物＞超聲波提取物＞普通提取物。在試驗濃度范圍內(nèi)，不同提取物的總還原能力均隨濃度的增加而增強，存在較明顯的劑量-效應關(guān)系。

圖2 酸性乙醇不同提取方法提取物總還原能力Fig.2 Total reducing power of different extraction agents extract for acidic ethanol

圖3 乙醇不同提取方法提取物總還原能力Fig.3 Total reducing power of different extraction agents extract for ethanol

兩種提取劑的超聲波提取物的總還原能力均優(yōu)于普通提取物，而微波提取物的總還原能力又均優(yōu)于超聲波提取物。這可能是因為微波輔助提取和超聲波輔助提取可以促進馬蹄皮中還原性物質(zhì)的溶出，微波處理后對樣品中的活性成分影響較小。與普通浸提法相比，超聲波和微波輔助提取法都能明顯縮短提取時間，特別是微波提取，既能大大縮短提取時間，又能保留還原性物質(zhì)的還原能力。因此微波輔助提取法更適宜用于馬蹄皮活性物質(zhì)的提取。

2.2 馬蹄皮不同提取物對羥自由基的清除能力

2.2.1 同種提取方法不同提取劑提取物對羥自由基的清除能力

分別準確稱量不同浸膏狀提取物配制成所需濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根據(jù)1.2.4方法測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 同種提取方法不同提取劑提取物對羥自由基的清除能力Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability to different extraction agents extract of the same extraction method

由圖4可知：1）在相同濃度下，酸性乙醇和乙醇提取物對羥自由基的清除能力相差不大，酸性乙醇提取物對羥自由基的清除能力略高于乙醇提取物，而乙酸乙酯提取物對羥自由基的清除能力明顯比酸性乙醇提取物和乙醇提取物差；其中在4 mg/mL濃度下，不同提取劑提取物的清除順序依次為酸性乙醇（64.42%）＞乙醇（62.29%）＞乙酸乙酯（36.06%）；2）在試驗濃度范圍內(nèi)，3種不同提取物都具有不同程度的羥自由基清除能力，3種不同提取物對羥自由基的清除率均隨濃度的增加而增大，但各提取物的清除能力均弱于VC。乙醇提取物的清除能力比乙酸乙酯的強，這是因為馬蹄皮提取物中的活性物質(zhì)，如多酚類、黃酮類等化合物大部分都是極性較強的物質(zhì)，所以易溶于極性較強的乙醇溶液中；而酸性乙醇提取物的羥自由基清除能力又比乙醇提取物的清除能力強，這是因為馬蹄皮提取物中的活性成分：多酚類、黃酮類等化合物，更易溶于酸性條件下的乙醇溶液中[14-16]。從試驗結(jié)果上來看，酸性乙醇（70%，pH=2）提取物的抗氧化能力最強。因此，與乙醇和乙酸乙酯相比，用酸性乙醇作提取劑，其提取物的抗氧化效果更佳，適宜推廣。

2.2.2 同種提取劑不同提取方法提取物對羥自由基的清除能力

分別準確稱量不同浸膏狀提取物配制成所需濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根據(jù)1.2.4方法測定，不同提取物對羥自由基的清除能力結(jié)果如圖5和圖6所示。

由圖5和圖6可知，酸性乙醇-普通提取物、酸性乙醇-超聲波提取物、酸性乙醇-微波提取物和乙醇-普通提取物、乙醇-超聲波提取物、乙醇-微波提取物均具有不同程度的羥自由基清除能力，但其清除能力均比VC弱。在相同濃度條件下，同種提取劑不同提取方法提取物的羥自由基清除率順序依次為VC＞微波提取物＞超聲波提取物＞普通提取物。在試驗濃度范圍內(nèi)，提取物的濃度與羥自由基清除率存在明顯的劑量-效應關(guān)系。

圖5 酸性乙醇不同提取方法提取物對羥自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging ability to differentextraction agents extract of acidic ethanol

圖6 乙醇不同提取方法提取物對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability to different extraction agents extract of ethanol

由圖5和圖6的測定結(jié)果可知，超聲波提取物的抗氧化能力比普通提取物的強，而微波提取物的抗氧化能力又比超聲波提取物的強。

3 結(jié)論

本試驗利用酸性乙醇、乙醇、乙酸乙酯3種提取劑，分別采用普通浸提、微波輔助提取、超生波輔助提取3種方法進行提取，獲得馬蹄皮總提取物。通過研究不同提取物的總還原能力和羥自由基清除能力，得出不同提取物均具有不同程度的總還原能力和羥自由基清除能力，且均隨濃度的增加而提高，表明不同提取物都具有不同程度的抗氧化能力；其中，用酸性乙醇作提取劑微波輔助提取的提取物抗氧化能力最強。微波輔助提取不僅顯著縮短了提取時間，提高了工作效率，降低消耗的成本，而且保留了馬蹄皮提取物的抗氧化活性，具有很高的經(jīng)濟效益和科研價值。因此用酸性乙醇作提取劑和微波輔助提取法來獲取馬蹄皮總提取物，是一條高效開發(fā)利用廢棄馬蹄皮資源的有利途徑，為我們合理開發(fā)高附加值天然抗氧化保健品、藥品和研制安全可靠的食品天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

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The Influence to Antioxidant Activity of Total Extract of Eleocharis Tuberose Peel with Different Extraction Methods

CHEN Qiu-juan1，XIE Wei2，*，LUO Yang-he2，LI Jin-feng1，WANG Sheng-xin1，QUAN Yao1
（1.School of Chemical and Biological Engineering，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.Research Institute of Food Science&Engineering Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

It was to study the total reducing ability of different extractives and their scavenging activity to hydroxyl radical by utilizing different extraction methods to obtain total extract of eleocharis tuberose peel in this thesis. The result showed that different extractives have different total reducing abilities and scavenging activities to hydroxyl radical.There was a dose-effect relationship between total reducing ability and scavenging activity to hydroxyl radical which showed different extractives have certain antioxidant ability.Among them，the strongest an tioxidant ability was using acidic ethanol as extracting agent extracts of microwave assisted extraction.

eleocharis tuberose peel；total reducing ability；hydroxyl radical；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.005

2016-07-27

廣西高?？茖W技術(shù)研究項目（KY2015LX477）；賀州學院校級課題（2014ZC28）；廣西自治區(qū)大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201511838090）

陳秋娟（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取、純化與分析。

*通信作者：謝微，女（壯），助理研究員，研究方向：分析檢測。