張雖栓，蔡花真

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山467000）

硫酸酯化裂褶菌多糖的制備及其抗氧化活性研究

張雖栓，蔡花真

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山467000）

采用水提醇沉法提取裂褶菌多糖，用磺?；▽ζ溥M行硫酸酯化，經(jīng)紅外光譜定性分析，硫酸鋇比濁法定量計算得出硫酸基的含量。采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定裂褶菌多糖和裂褶菌硫酸酯對羥自由基的清除作用。結(jié)果表明：硫酸基含量為13.9%，硫酸基取代度（DS）為1.26時，硫酸酯化裂褶菌多糖的抗氧化活性比裂褶菌多糖增加2.6倍。硫酸酯化修飾能提高裂褶菌多糖的抗氧化活性。

裂褶菌多糖；硫酸酯化；硫酸基鑒定；抗氧化

裂褶菌多糖（Schizophyllan polysaccharide）是從裂褶菌子實體、菌絲體或發(fā)酵液中提取出來的水溶性多糖，具有β-（1，6）分支的β-（1，3）-D-吡喃型葡聚糖[1]，是裂褶菌中最主要的生物活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、抗菌、抗輻射、提高機體免疫力等多種藥理活性[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，在天然多糖分子中引入某種離子基團并且具有恰當(dāng)?shù)娜〈葧r，不僅能夠顯著改善多糖在水溶液中的溶解度，而且可以使多糖在水溶液中的鏈構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其具有某種特定的結(jié)構(gòu)而提高生物活性[3]。硫酸酯化多糖是多糖大分子鏈中單糖分子上某一個或幾個羥基被硫酸根所取代而形成的天然及半合成的生物活性多樣、構(gòu)效關(guān)系鮮明的多糖修飾物，由于具有抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等諸多獨特的作用[4]，受到人們的廣泛重視。

本文以裂褶菌多糖為原料，采用磺?；▽α疡蘧嗵沁M行硫酸化修飾，研究裂褶菌多糖及其硫酸酯對超氧陰離子自由基的清除能力，以期了解裂褶菌多糖硫酸酯修飾對多糖抗氧化作用的影響，為裂褶菌多糖及其衍生物的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：裂褶菌，產(chǎn)自于云南昆明云蕈科技開發(fā)有限公司。氯磺酸、無水吡啶、DMF、三氯乙酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、氯化鋇、硫酸鉀、明膠、磷酸氫二鈉、雙氧水、無水乙醇、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004B電子天平：上海天美；FZ102微型植物粉碎機：北京中興偉業(yè)；S10-3恒溫磁力攪拌器：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海躍進；FD-1C-55型凍干機：北京醫(yī)用離心機廠；GL-21M型高速冷凍離心機：長沙湘儀；UV-1800紫外分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2802PC紫外掃描儀：龍尼柯；Spectrum Two紅外光譜儀：PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 裂褶菌多糖的提取[5]

裂褶菌干粉→粉碎→過篩（40目）→去離子水浸泡→過濾→蒸發(fā)濃縮→氯仿-正丁醇（體積比4∶1）混合溶液去蛋白→乙醇沉淀→冷凍干燥→裂褶菌多糖。

1.3.2 磺?；噭┑闹苽鋄6]

在冰鹽浴冷卻和攪拌條件下，將8 mL無水吡啶加入帶有冷凝管和磁力攪拌裝置的50 mL干燥三頸燒瓶中，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸3 mL，控制滴加速度為10滴/min，反應(yīng)1 h，得淡黃色固體，即磺?；噭?。

1.3.3 硫酸化裂褶菌多糖的制備[7]

準(zhǔn)確稱取0.2 g裂褶菌多糖溶解于15 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入20 mL磺酰化試劑，控制溫度，在攪拌下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)產(chǎn)物于冰浴中冷卻，用3 moL/L NaOH中和至pH=7，加入3倍體積95%乙醇使多糖沉淀，于4℃靜置過夜，離心分離收集沉淀，用水復(fù)溶，流水透析48 h，蒸餾水透析12 h，冷凍干燥，得硫酸酯化裂褶菌多糖。

1.3.4 裂褶菌硫酸酯的鑒定（硫酸基的定性）

紅外光譜法：常規(guī)溴化鉀混合壓片法1.3.4.2硫酸酯化裂褶菌多糖硫酸根離子含量的測定。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取105℃干燥恒重的K2SO40.217 5 g，以1 mol/L鹽酸定容至50 mL得25 mmol/L SO42-標(biāo)準(zhǔn)溶液，再配制3%三氯乙酸溶液和BaCl2-明膠溶液（BaCl21.0%，明膠0.5%），按表1實驗條件和數(shù)據(jù)加入具塞試管，室溫靜置15 min，在360nm處測定其吸光值A(chǔ)1；再以相同體積的0.5%明膠溶液代替BaCl2-明膠溶液按照上述操作方法在360 nm處測定其吸光度A2，以（A1-A2）對硫酸根濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

表1 氯化鋇-明膠比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 1 Standard curve of the barium chloride-gelation turbidimetry mL

2）試樣中硫酸根含量的測定[9]

稱取硫酸酯化裂褶菌多糖試樣20 mg于安瓿瓶中，加入2 mL 1 mol/L HCl溶液，N2保護下封管。沸水浴加熱水解1 h，取0.2 mL進行試樣溶液進行分析，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定其吸光度A1。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣中SO42-的百分含量，硫酸酯化裂褶菌多糖中硫酸基的取代度（DS）按下式計算：

式中：DS為硫酸基取代度；S%為樣品中硫酸根的百分含量。

1.3.5 裂褶菌多糖對羥自由基的清除作用

采用鄰二氮菲-Fe2+/H2O2氧化法[10]測定試驗體系中羥自由基的氧化作用。分別按表2加入試劑及多糖樣品，將上述試管同時置于37℃的恒溫水槽中，保溫60 min，測定其在波長536 nm處的吸光度（A值），取3次實驗數(shù)據(jù)平均值，按下式計算羥自由基清除率：

表2 鄰二氮菲-H2O2/Fe2+體系加樣表/總體積為10 mLTable 2 Sample list of phenanthroline-H2O2/Fe2+/volume for 10 mLmL

2 結(jié)果與分析

2.1 裂褶菌多糖的分離純化

SephadexG-200凝膠柱層析譜圖如圖1。

圖1 SephadexG-200凝膠柱層析譜圖Fig.1 The chromatography spectrogram of SephadexG-200 gel column

冷凍干燥的裂褶菌多糖粗品經(jīng)SephadexG-200凝膠柱分離，主要分離得到了一種多糖，命名為SPG，分離圖譜見圖1，層析結(jié)果為單一峰，說明裂褶菌多糖為均一組分。

2.2 裂褶菌多糖及硫酸酯化裂褶菌多糖的紅外光譜分析

裂褶菌多糖的紅外光譜圖如圖2，硫酸酯化裂褶菌多糖的紅外光譜圖如圖3。

圖2 裂褶菌多糖（SPG）的紅外圖譜圖Fig.2 The infrared spectrogram of SPG

圖3 硫酸化裂褶菌多糖（SSPG）的紅外圖譜圖Fig.3 The infrared spectrogram of SSPG

為了進一步裂褶菌糖多糖和硫酸酯化裂褶菌多糖在糖鍵上的變化，本實驗采用KBr壓片法用紅外光譜儀對裂褶菌多糖（SPG）及其硫酸酯化裂褶菌多糖（SSPG）進行紅外光譜掃描，分別所得到紅外圖譜見圖2和圖3。裂褶菌多糖（SPG）紅外光譜如圖2所示，裂褶菌多糖在3 200 cm-1～3 500 cm-1的寬峰是O-H伸縮振動；2 995.44 cm-1的峰為糖類C-H伸縮振動，在這個區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰；1 428.54 cm-1的不太尖的吸收峰是C-H的變角振動；1 000 cm-1～1 200 cm-1的比較大的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動所引起的；885.87 cm-1處的吸收峰為吡喃糖β型C-H的變角振動的特征吸收峰，呋喃糖是不會有這種吸收峰的，故可知糖苷鍵為β型，糖環(huán)形態(tài)為吡喃糖環(huán)[11-12]。

硫酸酯化裂褶菌多糖（SSPG）如譜圖3中3200cm-1～ 3 500 cm-1的吸收峰為多糖中-OH的吸收峰的變窄，說明羥基數(shù)量有所減少；在1 310 cm-1附近有一明顯的吸收峰該峰為-OSO3的S=O伸縮振動吸收峰；845.87 cm-1有一明顯的吸收峰，該峰為-C-O-S的伸縮振動峰；這表明硫酸中的硫酸基被轉(zhuǎn)移到了裂褶菌多糖樣上，形成了新的化學(xué)鍵。

裂褶菌多糖經(jīng)硫酸化前后，在吸收波形，波數(shù)，吸收峰等指標(biāo)上十分接近，這表明了兩者的化學(xué)組成十分相近。

2.3 硫酸酯化裂褶菌多糖中硫酸根的定量分析

采用硫酸鋇比濁法，測定不同濃度下硫酸基標(biāo)準(zhǔn)液在360 nm處的吸光度，得硫酸基含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y=1.113x+ 0.001 4；R2=0.999 7。

圖4 硫酸基含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Calibration curve for the determination of sulfate conten

對裂褶菌多糖采用磺?；ㄟM行硫酸酯化，反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液為黃褐色，有少量沉淀物。離心取上清液，透析，5倍95%乙醇沉淀，沉淀物溶解后再次透析，透析液冷凍干燥，得到淡黃偏白色產(chǎn)物，即為裂褶菌多糖硫酸酯。對其硫酸基的吸光度同樣進行3組檢測，其結(jié)果見表3。

表3 樣品的吸光度值Table 3 The absorbance values of the sample

由回歸方程得出：0.2 mL樣品中硫酸根的含量為0.069 9 mg，得出裂褶菌多糖硫酸酯中硫酸基的含量為13.9%。

即可算出硫酸基的取代度：DS=1.62×%S（32-1.02×%S）=1.26

2.4 SSPG的抗氧化活性

分別配置濃度為100、200、300、400、500 μg/mL的SSPG和SPG溶液，這兩種多糖對羥自由基的清除作用如圖5所示。

由圖5可知：兩種多糖溶液對羥自由基都有一定的清除作用，且隨著多糖含量的增加，對羥自由基的清除作用在增強。經(jīng)硫酸化后的裂褶菌多糖對羥自由基清除能力大幅提升，多糖濃度為500 μg/mL時清除率約為原多糖的2.6倍，高達42%。在低濃度下也表現(xiàn)出較高清除能力，并明顯高于SPG的清除作用。

圖5 不同濃度的多糖溶液對羥自由基的清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging effect of polysaccharide solution in different concentration

分析結(jié)果可能是由于裂褶菌多糖中的部分羥基被硫酸基取代后使吡喃型糖環(huán)的構(gòu)象發(fā)生一定的扭曲或轉(zhuǎn)變，可能會有利于硫酸基和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，另外，這些陰離子基團間的相互排斥作用使糖苷鏈鏈段適當(dāng)伸長[13]，因而在糖鏈局部可能形成螺旋結(jié)構(gòu)，糖鏈延伸，有序性增加，降低了多糖的黏度，增強了與自由基的結(jié)合能力[14]的原因。

3 結(jié)論

3.1 組分分析

經(jīng)SephadexG-200凝膠柱層析結(jié)果為單一峰，說明裂褶菌多糖為吡喃型葡聚糖單一組分。

3.2 紅外譜圖

對得到的裂褶菌多糖進行硫酸酯化，得到淡黃偏白色產(chǎn)物SSPG，對其進行鑒定，通過與SPG的紅外光譜對比分析，SPG在3 355.20、2 995.44、1 638.44、1 075.99、885.87 cm-1處出現(xiàn)吸收峰；SSPG在3 355.20、2 995.44、1 638.4、1 240.45、1 075.99、845.87、570.40 cm-1處形成吸收峰。

通過對SPG和SSPG的紅外譜圖的對比可知，在吸收波形、波數(shù)、吸收峰等特征指標(biāo)上十分接近，這表明了兩者的化學(xué)組成基本一致。但是在3 382.16、1 240.45、845.87 cm-1處SSPG與SPG形成的吸收峰有明顯差異。根據(jù)相關(guān)資料表明，多糖中3 600 cm-1～ 3 200 cm-1的-OH的吸收峰明顯變窄，說明多糖中部分羥基已被取代；在1 240.45 cm-1處形成的吸收峰，是由-OSO3的不對稱的S=O鍵伸縮振動形成的特征峰；在845.87 cm-1處的吸收峰是C-O-S鍵振動引起的特征吸收峰，這表明硫磺酰中的硫酸基已被轉(zhuǎn)移到了裂褶菌多糖上，形成了新的化學(xué)鍵。

最后，通過硫酸比濁法測定裂褶菌多糖修飾物硫酸基的含量為13.9%，取代度為1.26。

3.3 抗氧化性分析

裂褶菌多糖和裂褶菌多糖硫酸酯對羥自由基具有一定的清除作用，其清除率隨著多糖濃度的增大而增強，且經(jīng)過修飾后的裂褶菌多糖硫酸酯的清除能力明顯高于裂褶菌多糖，這表明裂褶菌多糖經(jīng)硫酸化分子修飾后，由于引入硫酸根，導(dǎo)致分析的極性增加、水溶性提高和黏度降低等理化性質(zhì)變化，從而使其生物活性明顯增強。

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Preparation and Antioxidative Activities of the Sulfated Schizophyllan Polysaccharide

ZHANG Sui-shuan，CAI Hua-zhen
（Henan Vocational College of Quality Engineering，Pingdingshan 467000，Henan，China）

The Schizophyllan polysaccharide was extracted by water extraction and ethanol precipitation method.The polysaccharide esterification were synthetized by chlorosulfonic acid method and was confirmed by infrared spectroscopy.The content of sulfate radical was determined by barium sulfate turbidity.The effects of polysaccharides scavenging hydroxyl were determined by phenanthroline-metal iron-H2O2system.The results showed that：when sulfate replaced was 13.9%，sulfation rate of 1.26 sulfated Schizophyllan polysaccharide antioxidant activity increased by 2.6 times than the unmodified polysaccharide.The antioxidant activity of Schizophyllan polysaccharide can be improved through sulfation.

Schizophyllan polysaccharide；sulfation；sulfuric acid-based identification；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.004

2016-06-08

河南省科技攻關(guān)項目（142102210222c）

張雖栓（1970—），男（漢），副教授，碩士，主要從事食品與藥物化學(xué)的研究。